Name: 分离小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质，使用原子力显微镜进行刚度测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 了解如何使用原子力显微镜测量小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质的刚度，以研究糖尿病视网膜病变中的血管机械生物学机制。该方法有助于揭示血管硬度与视网膜炎症及退行性病变之间的关系。

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本研究得到了美国国立卫生研究院国家眼科研究所（National Eye Institute/NIH）R01EY028242 基金（资助 K.G.）、防盲研究组织/国际视网膜研究基金会（Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation）针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的创新研究方法催化剂奖（资助 K.G.）、W.M. Keck 基金会资助的斯蒂芬·瑞安黄斑变性研究倡议（Stephen Ryan Initiative for Macular Research, RIMR）特别基金（资助 Doheny 眼科研究所）以及乌苏拉·曼德尔奖学金（Ursula Mandel Fellowship）和加州大学洛杉矶分校研究生理事会多元化奖学金（UCLA Graduate Council Diversity Fellowship）（资助 I.S.T.）的支持。此外，本研究还获得了防盲研究公司（Research to Prevent Blindness, Inc.）向加州大学洛杉矶分校眼科系提供的无限制资助。&#160;本文内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

Measurement of Stiffness in Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

原子力显微镜（AFM）已广泛用于测量主动脉和动脉等较大血管在疾病相关状态下刚度的变化16。这些研究结果有助于确立内皮细胞力学生物学在动脉粥样硬化等心血管并发症中的作用17。基于这些发现，我们开始探索内皮细胞力学生物学在早期糖尿病视网膜病变（DR）视网膜微血管损伤发展过程中此前未被认识的作用。然而，这一研究的成功依赖于对糖尿病引起视网膜毛细血管刚度变化的精确测量。最近的研究表明，与大血管类似，视网膜毛细血管以及视网膜内皮细胞分泌的内皮下基质的刚度也可以通过原子力显微镜（AFM）进行直接、准确且可靠的测量4,5,6。
该方法通过胰蛋白酶消化从轻度固定的鼠眼组织中分离视网膜毛细血管。根据经验，此轻度固定步骤十分必要，因为从未固定眼球（采用低渗法）分离的毛细血管较为脆弱，易发生断裂，因而不适合进行原子力显微镜（AFM）刚度测量4。相反，过度固定以及随之所需的强烈胰蛋白酶消化（其他视网膜胰蛋白酶消化方案中已有报道）18也可能破坏毛细血管的结构完整性，表现为紧密连接的断裂。因此，本方法采用的轻度毛细血管固定和温和胰蛋白酶消化有助于减少因甲醛过度交联引起的刚度伪影，同时确保毛细血管结构的完整性，从而实现可靠的AFM刚度测量。
作为一种替代方法，最近一项研究报道了对轻度固定的视网膜铺片中的视网膜毛细血管进行原子力显微镜（AFM）刚度测量19。该方法通过对完整视网膜内的毛细血管实施AFM力-压痕操作，实现了原位（in situ）刚度测量。然而，这些毛细血管的刚度测量值可能包含了内界膜的刚度成分。此外，该方法仅限于测量视网膜铺片表面可及的浅层毛细血管，而无法检测在早期糖尿病视网膜病变（DR）中特别受累的深层毛细血管丛20。本研究采用的方法可从所有视网膜层中干净地提取血管（无残留视网膜组织），从而解决了上述问题。目前，我们正在优化该方案，以从早期年龄相关性黄斑变性（AMD）动物模型中分离脉络膜血管。需要指出的是，本方案中使用的轻度甲醛固定可能在AFM测量中引起交联相关的刚度伪影。因此，在解读通过该方法获得的血管刚度值时，应更侧重于不同实验组之间的相对刚度变化，而非绝对刚度值。
与需要轻度固定的视网膜毛细血管不同，源自视网膜内皮细胞培养的血管内皮下基质可在无需任何修饰的情况下进行评估。这主要归因于所沉积基质的稳定性，其稳定性源于多种因素的共同作用，包括在培养基中添加抗坏血酸（可增强胶原蛋白合成）15），防止脱细胞过程中基质脱落的玻璃盖玻片化学修饰，以及延长培养时间（10–15天）。重要的是，我们已证明高血糖诱导的基底内皮下基质刚度增加 体外 与糖尿病引起的视网膜毛细血管僵硬度增加一致 体内4这一点并不令人意外，因为基质硬度的增加会通过力学互惠效应导致其上方的视网膜内皮细胞（ECs）硬度增加，二者共同作用使得毛细血管整体硬度上升。事实上，我们近期已证实，在糖尿病条件下培养的视网膜内皮细胞会变得更硬4，可能通过增加Rho/ROCK依赖性的肌动蛋白细胞骨架张力所致21这些发现还表明，在早期年龄相关性黄斑变性恒河猴模型中观察到的脉络膜内皮细胞僵硬，反映了脉络膜内皮下基质及完整血管的僵硬程度增加。12，这一假设正在持续开展的研究中得到验证。总体而言，未固定视网膜血管下基质及内皮细胞的刚度变化趋势与轻度固定的完整视网膜血管中观察到的变化趋势一致，这证明了轻度固定方法的可靠性。
对糖尿病视网膜病变（DR）动物模型中视网膜毛细血管进行直接刚度测量，不仅有助于确立内皮细胞力学生物学作为DR治疗的新靶点，也为未来开发用于无创评估DR患者视网膜毛细血管刚度的高灵敏成像技术提供了有力依据。此类无创技术有望检测由毛细血管僵硬化引起的血流微小变化，类似于糖尿病引起的心血管疾病中常检测到的动脉脉搏波速度变化。对来自糖尿病供体死后人眼分离的视网膜毛细血管进行原子力显微镜（AFM）刚度测量，将在这一方面提供重要的概念验证。鉴于在1型糖尿病（链脲佐菌素诱导）小鼠模型中，视网膜毛细血管刚度在疾病早期即已升高4，若能成功利用AFM验证刚度测量成像技术，或将促使视网膜毛细血管刚度被确立为早期DR发病机制的临床生物标志物。

视网膜毛细血管对于维持视网膜稳态和视觉功能至关重要。事实上，在糖尿病早期发生的毛细血管退化与糖尿病性视网膜病变（DR）这一威胁视力的并发症的发生密切相关。DR是一种微血管疾病，影响近40%的糖尿病患者1。血管炎症在DR中显著促进视网膜毛细血管的退化。以往的研究已证明，异常的分子和生化信号在糖尿病诱导的视网膜血管炎症中发挥重要作用2,3。然而，近期研究提出了DR发病机制的新范式，指出视网膜毛细血管僵硬是导致视网膜血管炎症和退化的关键因素，这一因素此前未被认识4,5,6。
具体而言，糖尿病引起的视网膜毛细血管刚性增加是由于视网膜内皮细胞（ECs）中胶原交联酶赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）表达上调所致，该酶可导致内皮下基质（基底膜）硬化4,5,6。基质硬化反过来通过力学互作使覆盖其上的视网膜ECs变硬，从而导致视网膜毛细血管整体刚性增加4。关键的是，仅糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬化即可促进视网膜EC活化及炎症介导的EC死亡。这种对视网膜EC功能障碍的力学调控可归因于内皮细胞力传导过程的改变，即机械信号被转化为生化信号以产生生物学反应的过程7,8,9。重要的是，EC&#160;所受机械信号及内皮下基质结构的改变也已被证实参与与早期年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的脉络膜血管退行性病变10,11,12，这表明血管力生物学在退行性视网膜疾病中具有更广泛的病理意义。
值得注意的是，视网膜毛细血管硬化在糖尿病早期即已发生，且与视网膜炎症的起始时间相吻合。因此，视网膜毛细血管硬度的增加可能成为糖尿病视网膜病变（DR）的治疗靶点和早期诊断标志物。为此，获得视网膜毛细血管及其内皮下基质可靠且直接的硬度测量结果至关重要。原子力显微镜（AFM）可实现这一目标，该技术具有独特、灵敏、准确且可靠的优势，能够直接测量细胞、细胞外基质及组织的硬度13。AFM通过向样品施加微小（纳牛顿级）的压痕力，根据样品硬度决定探针悬臂弯曲的程度——样品越硬，悬臂弯曲越明显，反之亦然。我们已广泛使用AFM测量培养的内皮细胞、内皮下基质以及分离的小鼠视网膜毛细血管的硬度4,5,6,11,12。这些AFM硬度测量结果有助于确立内皮细胞力学生物学在糖尿病视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD）发病机制中的关键作用。为了推动力学生物学在视觉研究中的应用范围，本文提供了利用AFM对分离的小鼠视网膜毛细血管及内皮下基质进行硬度测量的逐步操作指南。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;视网膜毛细血管分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PVDF 注射器滤器</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>低蛋白结合力 Durapore</td></tr><tr><td>不含钙和镁的10X Dulbecco's 磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>终浓度1X，pH 7.4</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>RNase-DNase-free，无热原</td></tr><tr><td>20 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 英寸一次性硼硅酸盐玻璃/非无菌巴斯德吸管</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm 组织培养皿</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL 笔式吸液器</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>刀片架</td><td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳钢手术刀片 #10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>牙科蜡</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>终浓度5%（v/v）</td></tr><tr><td>Kimwipes - 擦拭纸</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 不锈钢 115mm&amp;nbsp; 镊子</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ II级A2型生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量离心管 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>AmScope</td><td>SM-3 系列变倍三目体视显微镜 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片 - 白色标签 - 预清洁 - 25x75x1.0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液，0.1M 溶液，pH 7.4 - 生物技术级</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>胰蛋白酶溶液用 pH 8</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1:250 粉末，组织培养级</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10%（w/v）胰蛋白酶溶液</td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;内皮下基质&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>含钙和镁的1X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>氨水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（12mm）</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>人视网膜内皮细胞（HREC）</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 培养基</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>小鼠视网膜内皮细胞（mREC）</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;原子力显微镜测量&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m 探针</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>高19微米的半球形探针，末端半径1&lt;br/&gt; 微米，弹簧常数0.25N/m</td></tr><tr><td>70 nm LC 探针</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>高19微米的半球形探针，末端半径70nm，&lt;br/&gt; &amp;nbsp;弹簧常数0.1N/m</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;摄像头</td><td>XCAM 系列</td><td>Toupcam</td><td>1080P HDMI</td></tr><tr><td>用于运行摄像头的台式机</td><td>Asus</td><td>Asus 台式机</td><td>Intel i5-6600 CPU，8GB 内存</td></tr><tr><td>盖玻片用培养皿支架</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm 玻璃底培养皿，带&lt;br/&gt; &amp;nbsp;14 mm 微孔</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>安装在光学显微镜上的生物科学原子力显微镜，用于灵敏测量软性生物样品的力学结构特性（刚度和形貌）</td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>配备10X物镜的倒置显微镜</td></tr></tbody></table>

使用原子力显微镜测量小鼠视网膜毛细血管及其内皮下基质硬度的分离方法

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

视网膜毛细血管退化是糖尿病性视网膜病变（DR）早期阶段的临床特征。我们最近的研究表明，糖尿病引起的视网膜毛细血管僵硬在炎症介导的视网膜毛细血管退化过程中起着关键且此前未被认识的因果作用。视网膜毛细血管僵硬度的增加源于赖氨酰氧化酶的过表达，该酶可交联并硬化内皮下基质。由于在早期阶段干预DR有望预防或延缓DR的进展及相关视力丧失，因此内皮下基质和毛细血管僵硬度成为早期DR管理中相关且新颖的治疗靶点。此外，直接测量视网膜毛细血管僵硬度可为开发用于在动物和人类受试者中无创评估视网膜毛细血管僵硬度的新成像技术提供关键的临床前验证步骤。基于这一考虑，本文提供了利用原子力显微镜分离并测量小鼠视网膜毛细血管及内皮下基质僵硬度的详细实验方案。

小鼠视网膜毛细血管 
分离的视网膜毛细血管进行原子力显微镜（AFM）刚度测量时，样品处理步骤可能破坏其力学-结构完整性。为防止此类损伤，从而确保AFM测量的可行性、可靠性和可重复性，在眼球摘除后，需在4 °C条件下用5%甲醛溶液固定过夜，再进行血管分离。该温和固定方案采用较低的甲醛浓度、较低的固定温度、较短的固定时间，且不穿刺角膜，旨在最大限度地减少化学固定可能引起的交联或硬化等假象。如图2B、C所示，这种相对温和的固定方式可确保分离出的视网膜血管结构完整，具有足够的机械耐久性，适用于AFM测量。相比之下，从未固定眼球（采用低渗法）4或短暂固定眼球（固定8小时）中分离的视网膜血管则容易发生断裂或塌陷，因而无法用于AFM测量（图2B）。
视网膜内皮下基质 
血管硬度反映了血管细胞与基底膜（内皮下基质）硬度的综合特性4。由于细胞会通过改变自身硬度以适应基质硬度，这一过程称为力学互惠性9，因此内皮下基质硬度成为决定整体血管硬度的重要因素。在测量基质硬度时，获得均匀致密的内皮下基质至关重要。对于在添加抗坏血酸的培养基中培养的人视网膜内皮细胞（ECs），通常需要10–15天(图3A)4,5,6。培养时间的差异可能源于市售原代视网膜内皮细胞批次之间的差异。此外，我们通常发现，与原代人视网膜内皮细胞培养相比，来自C57BL/6小鼠的市售视网膜内皮细胞沉积的基质更为致密，表明存在物种特异性差异。如图3A所示，相差显微图像仅能从宏观尺度上提供基质的大致形态。然而，在使用针对基质结构蛋白IV型胶原和纤连蛋白的抗体对基质进行免疫标记后，通过高分辨率共聚焦荧光成像可清晰观察到基质在纳米至微米尺度上的纤丝结构(图3B)。需要注意的是，这些基质蛋白还可通过与特定整合素受体结合，向内皮细胞传递指导性信号9。
原子力显微镜刚度测量 
选择合适的悬臂梁刚度（弹簧常数，k）和探针尺寸对于获得可靠且灵敏的测量结果至关重要。这些参数应根据生物样品的刚度和尺寸进行匹配。在将选定的悬臂梁安装到原子力显微镜（AFM）上后，必须将红外激光束聚焦于悬臂梁末端，并使反射的激光光斑位于光电探测器的中心位置。这种激光对准可确保对悬臂梁偏转进行精确且灵敏的检测，从而实现准确的刚度测量。AFM刚度测量开始时，z轴压电陶瓷驱动悬臂梁垂直向下移动靠近样品。此时悬臂梁无偏转，进而在接近曲线中形成一条平坦的基线 (图4A)。当悬臂梁探针接触并压入样品时，悬臂梁发生弯曲，导致激光在光电探测器上发生偏转，这在接近曲线中表现为垂直方向的偏转。当对样品施加预设的压入力（设定力）后，悬臂梁从样品表面回撤至起始位置（Z目标高度）。随后，将偏转的回撤曲线拟合至赫兹/斯内登（Hertz/Sneddon）模型，以计算样品的杨氏模量（刚度）。
从图4所示的代表性力-压痕测量结果可以看出，从糖尿病小鼠分离的视网膜毛细血管获得的压入和回缩曲线(图4B)明显比非糖尿病小鼠的曲线(图4A)更陡峭。力-压痕曲线斜率更陡表明样品对压痕力的阻力更大，导致悬臂偏转更显著，反映出样品刚度更高13。事实上，对多条力-压痕曲线的后续数据分析表明，糖尿病小鼠的视网膜毛细血管刚度显著增加4。还应注意的是，悬臂探针与生物样品接触时常会引起非特异性表面黏附，导致回缩过程中悬臂出现负向偏转，表现为回缩曲线延伸至基线以下(图4B)。此外，细胞、基质和血管等生物样品本质上具有黏弹性，因此在受力压痕后可能发生一定程度的永久形变和/或表观刚度变化。若发生此类情况，则会在压入与回缩曲线之间出现不重合（滞后现象）。事实上，比较图4A与图4B可证实预期趋势：非糖尿病小鼠中较柔软的毛细血管在受力压痕后表现出的滞后程度大于其刚度更高的对应物。如先前报道5,6，视网膜内皮细胞培养获得的内皮下基质的刚度（杨氏模量）也可采用上述方法计算。
<img alt="小鼠眼部手术示意图，显示使用手术刀和镊子进行角膜缘和视网膜切口的过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠眼球切口示意图，用于视网膜分离。 使用镊子夹住视神经，用手术刀在角膜缘后方做一完整切口，以将小鼠视网膜与晶状体及前房分离。紫色虚线表示垂直切口的位置。该示意图使用科学图像与绘图软件绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="眼内血管分离与固定方法比较；胰蛋白酶消化法；显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于原子力显微镜（AFM）测量的小鼠视网膜完整血管分离方案的优化。 （A）体视显微镜图像显示从小鼠眼球中分离出的完整视网膜，该眼球经轻度固定处理，尚未进行毛细血管分离步骤。比例尺：2 mm。（B）代表性相差显微图像（4倍放大）展示了采用不同分离方法获得的小鼠视网膜血管。通过比较分离血管的结构完整性和耐久性，发现将眼球摘除后的小鼠眼球在4 °C条件下用5%甲醛固定24小时，再进行胰蛋白酶消化（红色框），可获得最适合用于AFM刚度测量的视网膜血管网络。采用该方法分离的视网膜血管呈现出清晰且均匀铺展于玻璃表面的血管网络。比例尺：500 µm。（C）高倍放大（20倍）视野下完整的视网膜毛细血管网络（类似于B图所示），进一步证实了来自轻度固定眼球的毛细血管具有良好的结构完整性。比例尺：100 µm。本图经修改自4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像：人与小鼠REC生长（10-15天）、IV型胶原与纤连蛋白染色比较示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：源自原代人和小鼠REC培养的脱细胞基质。（A）代表性20倍相差显微图像，显示人或小鼠REC培养10天（10 d）或15天（15 d）后经脱细胞处理，在玻璃盖玻片上形成的内皮下基质聚集体。比例尺：100 µm。（B）源自15天人REC培养物的脱细胞基质的代表性高倍（100倍）共聚焦荧光图像，经抗IV型胶原和抗纤连蛋白抗体标记，显示致密的纳米纤维状IV型胶原与纤连蛋白基质。比例尺：20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="力-距离曲线；非糖尿病 vs 糖尿病；悬臂梁接近/回缩；原子力显微镜数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：小鼠视网膜毛细血管刚度测量中原子力显微镜（AFM）获得的力-距离曲线。 折线图显示了来自一只（A）非糖尿病或（B）糖尿病小鼠分离出的视网膜毛细血管某一位置单次力压痕测量的代表性接近（浅色）和回缩（深色）曲线。使用SAA-SPH 1 µm半径半球形悬臂探针获得的力曲线，描绘了悬臂-样品距离（由z压电驱动器控制）与引起悬臂偏转的施加垂直力之间的关系。（A）黄色箭头表示由z压电驱动的悬臂向样品接近过程，白色箭头表示悬臂探针与样品接触的接触点，绿色箭头表示悬臂偏转至设定值（峰值）压痕力（*）的过程。（B）从糖尿病小鼠分离出的视网膜毛细血管获得的接近和回缩曲线均表现出比非糖尿病小鼠明显更陡的斜率（如A图所示），表明糖尿病小鼠毛细血管刚度更高。箭头指示回缩曲线中低于基线的下陷，反映了在压痕过程中探针与样品之间的黏附力导致悬臂探针产生负偏转。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们近期发现视网膜毛细血管硬化是糖尿病相关视网膜功能障碍的一种新范式。本实验方案详细阐述了从小鼠视网膜毛细血管及视网膜内皮细胞培养物中分离视网膜毛细血管及其内皮下基质的步骤，随后介绍了利用原子力显微镜测量其硬度的技术方法。

视网膜毛细血管退化是糖尿病性视网膜病变（DR）早期阶段的临床特征。我们近期的研究表明……

已知血管炎症会导致糖尿病视网膜病变早期阶段视网膜毛细血管的退化，而糖尿病视网膜病变是糖尿病主要的威胁视力的微血管并发症。本实验室正在研究血管硬度形式的机械信号是否以及如何参与糖尿病早期这些异常的视网膜血管改变。目前人们日益关注开发在早期阶段预防糖尿病视网膜病变的方法，尤其聚焦于抑制糖尿病早期发生的视网膜炎症，这种炎症会导致视网膜神经血管功能障碍。我们近期的研究表明，除了遗传和生化因素外，机械信号（如血管僵硬度）也可能促进糖尿病早期的视网膜炎症。本方案将使研究人员能够分离完整的视网膜血管及内皮下基质，以便后续使用原子力显微镜进行僵硬度测量。这些测量结果将有助于明确血管僵硬度和内皮细胞力学生物学在糖尿病视网膜病变和黄斑变性相关血管缺陷发生过程中的作用。通过施加微小的纳米级至皮牛顿水平的迭代力，原子力显微镜提供了一种灵敏、准确且可靠的直接测量软质生物样本（如血管、细胞及可获取的组织）刚度的技术。据我们所知，此类温和的测量唯有通过原子力显微镜才能实现。我们近期的研究表明，糖尿病会导致视网膜毛细血管变硬，进而引发视网膜血管炎症与退行性病变。更深入地理解糖尿病视网膜病变的机械调控机制，有望在未来发现基于微生物学的抗炎治疗靶点，从而开发出更有效的疗法。首先，在解剖显微镜下，将一只经过固定处理的小鼠眼球置于一张石蜡纸上。使用一对显微镊子夹住残留的眼外肌和视神经组织。然后调整眼球方向，使角膜朝向一侧。现在使用手术刀在距角膜缘后方1至2毫米处做一与角膜缘平行的切口。在固定眼球的同时，向下施加力量，直至前段与后端分离。然后弃去前段和晶状体。将后段转移至一个盛有 PBS 的 6 厘米培养皿中。用微型刮匙挖出视网膜，同时用显微镊子夹住视神经固定。为冲洗视网膜，将其转移至一个12孔板中的孔内，该12孔板中有六个孔装有双蒸水。使用P1000移液器在视网膜附近小心地反复吸打水溶液，同时吹出水流以产生轻柔的搅动。接着，使用倒置的玻璃移液器将视网膜转移至第二个孔中。为了消化视网膜，使用倒置的玻璃移液管将清洗后的视网膜转移至12孔板中的胰蛋白酶溶液中。将经胰蛋白酶浸泡的P200移液枪头对准视神经中心，然后轻柔地上下吹打整个血管网络，以分离非血管组织。现在使用预先用胰蛋白酶冲洗过的倒置玻璃移液管，将视网膜血管系统转移至六孔板中盛有双蒸水的一个孔内。轻轻摇晃六孔板，然后用经胰蛋白酶冲洗过的倒置玻璃移液管将血管系统上下吹打，以去除任何残留的非血管组织。小心地将视网膜血管系统转移至带电荷表面显微镜载玻片上已标记区域的中央。然后使用 P 200 移液器从一侧小心吸除多余的水分。将载玻片放置于生物安全柜中靠近前侧的位置，使残留的水分自然蒸发。当血管组织接近干燥时，将其转移至相差显微镜下观察。 使用 P 200 移液器在标记区域的一侧缓慢加入双蒸水，以小心地重新水合血管系统。分离的视网膜血管经固定后，形成了结构坚固且足够耐用的组织，适用于原子力显微镜（AFM）测量。相比之下，从未固定或短暂固定的动物眼球中分离出的视网膜血管则出现碎片化和塌陷。首先，在含钙镁的 PBS 中用轨道摇床将经戊二醛交联的明胶包被的盖玻片冲洗约五次。前三次冲洗过程中，使用无菌镊子提起盖玻片，以确保戊二醛充分冲洗干净。接着，将小鼠视网膜内皮细胞（RECs）的培养基更换为新鲜培养基，并补充经无菌过滤的抗坏血酸。处理15天后，用无钙镁的PBS缓冲液冲洗细胞。将细胞在250微升预热的脱细胞缓冲液中孵育2至3分钟。在相差显微镜下确认细胞的脱细胞效果。轻轻移液去除缓冲液，避免扰动REC分泌的基底膜下基质。然后每孔加入0.5毫升PBS。去除PBS后，每孔加入200微升N-ace free DN-ace 1。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，以去除所有细胞碎片。接着，在相差显微镜下观察宏观纤维状的内皮下基质。然后使用共聚焦显微镜在 100 倍放大倍数下观察更精细的纳米级基质纤维。在去除人或小鼠RECs培养10天或15天后的细胞后，于玻璃盖玻片上观察到内皮下基质聚集体。去细胞化基质的共聚焦显微镜结果显示，存在致密的纳米纤维状IV型胶原和纤连蛋白基质。首先，将原子力显微镜（AFM）的悬臂梁支架固定在悬臂梁更换支架上。使用钟表匠镊子将选定的悬臂安装到支架上。拧紧支架上的螺丝以固定悬臂。将悬臂支架放置在位于支架上的原子力显微镜（AFM）探头中并锁定。使用AFM软件中的步进电机功能将AFM探头提升至最高点，并将该位置设为零点。小心地将AFM探头从支架上取下，然后通过将支脚插入相应的插槽中，将其安装到样品台上。为校准悬臂，使用步进电机功能将其移近样品表面。然后点击光谱学窗口中接触模式下的“approach”按钮。以15微米的小步长降低悬臂。按下“acquire”以采集力曲线。然后选择力曲线。在校准管理器窗口中打开，并在方法部分选择基于接触的模式。接着使用选择拟合范围功能，选中悬臂梁的 retract 曲线以进行线性拟合。接下来，勾选灵敏度复选框，将力的单位从伏特转换为牛顿。在液体中将悬臂抬升 100 至 200 微米，并选择热噪声函数。再次点击选择拟合范围，使用洛伦兹曲线拟合热噪声钟形曲线。曲线拟合后，选择弹簧常数 K 选项。确认弹簧常数接近制造商提供的数值，并记录该值以供后续参考。接着，将载有啮齿类动物眼视网膜血管或内皮下基质样本的载玻片放置在原子力显微镜（AFM）载物台上，并对视网膜血管进行成像观察。在软件的实验部分选择接触模式进行光谱测量。然后将设定点力设置为 0.5 纳牛，并点击接近。使用原子力显微镜载物台上的调节螺钉，小心地将悬臂探针定位到样品上的目标位置。点击“接近”以将悬臂靠近样品，然后点击“采集”以获取力曲线。最后，保存所有力曲线用于分析。从糖尿病小鼠分离的视网膜毛细血管获得的接近和回撤曲线比从非糖尿病小鼠获得的曲线更陡峭。

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科研

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生物学

分离小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质，使用原子力显微镜进行刚度测量

细胞外基质的刚度显著影响黏附细胞的多种行为。基质刚度在组织内存在空间上的差异，并在多种疾病状态下发生改变。本文中，我们建立了利用原子力显微镜微压痕技术来表征正常及纤维化小鼠肺组织中刚度空间变化的方法。...

利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

我们提供了从小鼠分离主动脉并利用原子力显微镜测量其弹性模量的详细实验方案。...

测量刚度 离体 利用原子力显微镜检测小鼠主动脉

我们介绍一种利用原子力显微镜（AFM）在细胞水平上研究关节软骨早期骨关节炎变化的方法。...

原子力显微镜在早期骨关节炎检测中的应用

利用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝脏硬度

本文旨在指导读者使用集成的原子力-光学成像显微镜对培养中的活细胞进行机械刺激操作。文中提供了一步一步的操作方案，并展示了一组典型的实验数据，用以显示活细胞对机械刺激的响应。...

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利用基于丙烯酰胺的水凝胶研究基质刚度对细胞功能的影响

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完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

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