DNA条形码技术在药用植物鉴定中的应用

我的研究旨在利用DNA条形码技术，提高药用植物鉴定的准确性和效率，从而促进这些宝贵自然资源的保护与可持续利用。DNA条形码技术已获得更广泛的应用，例如通过监测或保护物种进行质量控制，以及生物多样性评估。高通量研磨与扩增技术结合DNA条形码用于物种鉴定，推动了基于DNA条形码的草药鉴定应用，并揭示了以往DNA条形码鉴定中的错误。

目前，关于如何鉴定药用植物的全面指南尚不完善，而我们的方法可提供详细的参考依据。未来，我们实验室的主要研究方向是将DNA条形码技术与本领域的其他技术相结合，以拓展应用范围并推动技术创新。首先，取100毫克新鲜组织或20毫克风干组织，置于2毫升离心管中。

将两颗直径为5毫米的不锈钢珠放入离心管中，然后将离心管转移至高通量组织研磨仪，以60赫兹频率研磨60秒。进行DNA提取时，向样品中加入800微升预冷的细胞核分离缓冲液，置于涡旋振荡器上振荡5分钟。随后将样品放入离心机，以13,780×g离心10分钟。

离心后，小心移除上清液。接着，向样品中加入600 µL P1缓冲液，再加入5 µL RNase A。振荡混匀后，将样品置于65 °C水浴中孵育1.5小时，孵育期间翻转离心管2至3次。

然后，加入 200 µL 缓冲液 P2，充分混匀，并将样品置于冰上 15 分钟。随后，在 13,780 ×g 条件下离心 10 分钟。小心地将上清液转移至 AF 滤柱中，并在 13,780 ×g 条件下离心 2 分钟。

将下层滤液转移至新的1.5毫升离心管中。计算滤液体积后，向样品中加入1.5倍体积的P3缓冲液，并立即振荡以混匀样品。取650微升制备好的混合液加入吸附柱中，孵育5分钟。

然后，在13,780 ×g 条件下离心30至60秒。将获得的滤液再次加入吸附柱中。离心后弃去废液。

用 600 微升洗涤液 WB 将柱子清洗两次。离心后，弃去废液，然后将吸附柱放入一个干净的收集管中。将样品在 13,780 × g 离心 2 分钟后，室温放置以挥发残留的乙醇。将吸附柱转移至一个洁净的 1.5 毫升离心管中，并在吸附膜中心加入 45 微升预热至 65 摄氏度的无菌去离子水。

5分钟后，在室温下以13,780G离心2分钟。然后使用分光光度计测定滤液中的DNA浓度。

OD260与OD280的吸光度比值范围为1.8至1.84，DNA含量超过100纳克/微升，表明所提取的DNA质量良好。首先，从植物组织中提取DNA，并测定DNA浓度。将所有必需组分加入0.2毫升离心管中，配制反应体系。引物扩增后，取3微升PCR产物和2微升5,000碱基对DNA标记物，分别加入琼脂糖凝胶的加样孔中。

将电压设置为120伏，电流设置为400毫安，电泳运行40分钟。使用多功能凝胶成像分析系统观察和分析凝胶结果。样品经测序仪运行后，选择“创建新项目”并点击“确定”进入软件主页。

在“文件”菜单下，选择“导入并添加样本”，选择序列迹文件格式，并将其作为未组装样本下的待处理文件导入。然后转到“高级组装”，选择“按组组装”。当出现提示定义名称的对话框时，在“定义样本名称部分”中修改文件名，然后单击“组装”以显示比对序列。

选择“前往”，然后选择“搜索序列”，并点击“确定”以查找匹配的序列。接着选择并删除5.8S和28S区域，以及任何低质量的序列。导出包含拼接序列的结果用于匹配。

在NCBI的核苷酸数据库中选择BLAST比对搜索。选用物种鉴定工具及对应《中国药典》基因组数据库的特异性引物ITS2，从NCBI下载当归属三种物种以及作为外群的前胡一种物种的序列。将这些序列与所获得的结果序列一同进行分析。

然后单击文件。选择打开文件或会话以导入文件，此时将出现一个对话框。选择后跟 DNA 的一行，并通过 CLUSTALW 选择一行以进行序列比对。

进入系统发育分析页面，点击“构建测试邻接树”以生成系统发育树。凝胶电泳结果表明，样本AS1、AS2和AS3在约500个碱基对处显示出单一清晰条带，阴性对照无条带，表明提取的DNA扩增成功。测序结果通过BLAST分析显示与当归（Angelica sinensis）的序列相似性为100%，与GPGD数据库中的匹配结果一致。

在系统发育分析中，剪接序列与当归（Angelica sinensis）OR879715.1 聚为一支，自展支持值为 100，证实其鉴定为当归（Angelica sinensis）。