Name: 通过侧尾静脉注射在成年小鼠中持续递送腺相关病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 学习通过侧尾静脉注射在成年小鼠中持续递送腺相关病毒的方法，用于基因治疗研究。该优化方案可提高AAV转导效率并确保实验结果的可重复性。

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作者谨向美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）动物护理设施工作人员表示感谢，感谢他们的支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）NINDS所内研究部门资助（年度报告编号：1ZIANS003129）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

AAV-Based Therapies via Intravenous Injection in Preclinical Mouse Models

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作者无任何与本文发表内容相关的披露事项。

基于AAV的疗法因其作为基因治疗载体的高度可塑性，在单基因遗传病治疗中展现出巨大潜力，使得研究人员能够定制AAV以满足不同疾病的各种递送需求4,5,7,9。在临床前小鼠模型中，AAV通常通过静脉注射给药，以评估潜在治疗手段的安全性和有效性16。由于不同注射剂量的AAV可能导致实验结果出现显著差异，因此实验人员必须能够稳定地注入目标AAV剂量，以确保所获得的in vivo数据具有有效性和可重复性28。静脉注射虽广泛应用，但技术难度较高，需要经过长期训练并持续练习，才能建立并维持确保注射成功率的技术水平16,17,18,19。除了准确完成AAV注射外，通常还需采用检测方法评估注射后AAV在靶组织或靶细胞中的生物分布及递送效率29,30。
本方案旨在通过详细描述一种优化的静脉注射操作流程，帮助实验人员对7至9周龄、未麻醉的小鼠成功且稳定地进行腺相关病毒（AAV）给药，从而简化静脉注射的操作。需要特别注意的是，若小鼠体型明显小于或大于同龄野生型小鼠，由于静脉可视性降低或与本方法所用固定装置不匹配，可能会增加操作难度。&#160;已被&#160; 先前报道过尾部IV&#160;注射不是&#160;适用于试剂的添加&#160;在小鼠中通过静脉注射&#160;小于6周龄，因体型较小&#160;血管尺寸31尽管可能实现，但对体重小于22.0 g的小鼠进行稳定注射可能存在困难。使用非典型体型小鼠的研究人员可能需要对操作步骤进行相应调整。本方案还概述了多种可用于评估AAV生物分布和转导效率的检测方法。
在执行本方案时，需牢记一些关键要点。注射过程中，若针头未进入静脉，29 G针头会提供更大的阻力。这有助于减少因注射失败导致药液意外注入血管外而造成的损失量。胰岛素注射器的死腔体积小于常规注射器。如果使用与本方案所列不同的注射器和/或针头，则可能需要在步骤1.1.3.3中准备额外的注射液体积，以补偿较大的死腔体积（例如，将预期剂量增加30 µL，而非15 µL）。
若在将AAV剂量吸入注射器时，注射器壁上产生细小的由抽吸引起的气泡，可缓慢继续将药液向上吸入注射器中，以去除大部分微小气泡。应比计划注射体积多吸入至少10–15 µL的AAV。额外加入的体积用于补偿在排出气泡过程中或因注射尝试失败可能导致的液体损耗。（例如，若目标注射体积为150 µL，则应将165 µL的液体吸入注射器中（位于注射器刻度160 µL与170 µL标记的中间位置）。若针头正确置于静脉内，且在成功注射前注射器内液体体积为165 µL，则应持续推注试剂，直至注射器内剩余15 µL液体（位于10 µL与20 µL刻度标记的中间位置），从而确保实际注射量为150 µL（165 µL – 15 µL = 150 µL）。将针尖斜面开口（斜面朝上）与注射器刻度对齐，可在注射过程中准确追踪已注射的体积。
一些实验人员可能更倾向于将小鼠侧放，以便使其一条静脉保持平直，相比让小鼠直立时更易于穿刺。然而，当小鼠侧放时，其尾巴会因个体大小不同而呈现不同倾斜角度，这要求在对不同体型的小鼠进行注射时调整进针角度。这种变化可能对操作成功率的一致性产生不利影响。在初期练习阶段，实验人员可尝试两种不同的固定方式，以确定自己偏好的操作方法。让小鼠保持直立状态可快速、方便地接触两侧尾静脉，当多次注射尝试失败需交替使用两侧静脉时，这种方式可缩短固定时间。
若在靠近尾根部（更接近小鼠身体）的侧静脉注射（尤其适用于体重&#62;30 g的小鼠），由于尾根部的静脉位置略深于远端，应将注射角度从与静脉平行调整为与静脉成5°–10°。
此处列出的RNase消化和RNA污染检测方案已在从新鲜冷冻肝组织中分离的DNA样本上得到验证，这些样本在20 µL体积中含有175-700 ng的核酸。RNase消化方案还测试了从新鲜冷冻肝组织和FACS分选细胞中分离的DNA样本，以确认RNase消化后载体基因组和小鼠基因组的存在。结果通过琼脂糖凝胶电泳对目标扩增子进行终点PCR扩增后可视化。
遵循所述方法可减少掌握静脉注射技术所需的培训和练习时间，并提高注射成功率，从而节约试剂。本方案采用简单且常用的工具，无需使用可能不易获得的先进设备或装置。此外，此处列出的静脉注射步骤可适用于多种需静脉给药的注射物，例如反义寡核苷酸（ASOs），仅需根据具体注射物对注射物制备步骤进行相应调整即可。

单基因疾病占所有罕见病的80%，全球共有约3亿人受其影响1,2。目前，大多数此类严重致残的罕见病尚无获批的治愈性疗法1,2,3。然而，单基因疾病是基因治疗的理想适应症，可通过基因治疗实现对功能异常基因的替换、补充、校正或沉默4,5。目前，已有多种载体正在被开发并用于将基因治疗递送至特定细胞类型4,6。其中一种载体是腺相关病毒（AAV）。AAV是一种非致病性细小病毒，正越来越多地被用作基因治疗载体7。与其他病毒载体相比，AAV具有较低的免疫原性、较低的宿主基因组整合风险，并能高效转导多种组织中的分裂期和非分裂期细胞7,8。此外，已有多种方法被开发用于设计和筛选具有理想特性的AAV，例如特定的组织嗜性或进一步降低的免疫原性，这极大增强了AAV作为不同适应症病毒载体的多功能性9。这些因素使AAV成为被广泛研究的基因治疗载体，并推动了多种获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的AAV基因疗法的开发10。
小鼠模型常用于测试潜在的基因疗法 体内 并更好地理解单基因疾病的发病机制。这得益于小鼠模型能够重现不同疾病的病理特征，其基因组与人类基因组具有高度相似性，以及小鼠在操作、饲养和繁育方面的相对便利性11,12,13. 体内 在研究影响身体多个系统或区域的疾病（如肌营养不良症）时，检测尤为重要。对于这类疾病， 体外 仅通过测试可能不足以全面评估经全身给药后拟作用于不同身体区域的治疗药物的安全性、有效性、药代动力学和药效动力学14.
可采用多种全身给药途径来递送药物。每种给药途径均有其优势、局限性，以及与所研究的动物模型和药物的相容程度15。在小鼠中，静脉（IV）尾侧静脉注射是腺相关病毒（AAV）全身递送的常用途径16。尾侧静脉注射可将注射物快速、直接地注入小鼠血液循环系统，确保药物在全身循环中具有较高的生物利用度17。此外，该方法所需操作工具相对简单且易于获取。然而，由于尾静脉管径较小且定位困难，尾侧静脉注射在技术上具有挑战性，需要较高的操作技能并持续练习，以避免注射失败或剂量递送不全16,17,18,19。若在注射过程中未能识别出剂量未完全注入的情况，可能导致昂贵试剂的浪费或实验结果不准确。本文总结的经验基于已有详尽文献报道的实验方案，我们对其进行了适应性改进，优化了尾侧静脉注射过程中的多个步骤，以确保注射操作持续成功20,21,22,23,24,25,26,27。
本文介绍了一种经过详细优化的侧尾静脉注射方案，使用简单且常见的工具，向未麻醉的7至9周龄小鼠递送腺相关病毒（AAV）。此外，我们还提供了用于评估AAV递送效率和生物分布的检测方法的操作流程。这些方案涵盖了注射后组织采集、组织固定、DNA提取，以及通过数字聚合酶链式反应（dPCR）定量每二倍体基因组中的载体基因组拷贝数（vg/dg）。本文提供的静脉注射方案及相关操作要点旨在提高侧尾静脉注射操作的成功率和便捷性，有望缩短掌握注射技术所需的时间，同时提升注射的准确性和重复性。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mL 胰岛素注射器，配29G针头</td><td>BD 生物科学</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管&amp;nbsp; 管</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD 生物科学</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>华纳·格雷厄姆公司</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10×磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>康宁</td><td>46-013-CM</td><td>用于配制 1x PBS 以进行组织固定</td></tr><tr><td>15 mL 一次性离心管</td><td>康宁</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管架</td><td>多个来源</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>190 proof 乙醇</td><td>华纳·格雷厄姆公司</td><td>6810-01-113-7320</td><td>用于配制70%乙醇</td></tr><tr><td>1× 无菌 PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微型离心组织保存管</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>腺相关病毒（AAV）</td><td>查尔斯河实验室</td><td>N/A</td><td>单链DNA（ssDNA）AAV被包装用于递送由CMV启动子驱动的Cre重组酶作为转基因</td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>BD 生物科学</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>珠磨裂解管</td><td>下一步进展</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>BsuRI（HaeIII）限制性内切酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ER0151&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>子弹头研磨器</td><td>下一步进展</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>杰克逊实验室007914品系（遗传背景：C57BL/6J）来源的Ai14小鼠</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>携带 Ai14 Cre 报告等位基因的小鼠购自 JAX（目录号：007914）</td></tr><tr><td>一次性吸水垫</td><td>Fisherbrand</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>精细科学工具（F.S.T）</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>精细科学工具（F.S.T）</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>DNA降解试剂（DNAZap）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>DNA提取 RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>用于核酸提取过程中的RNA消化</td></tr><tr><td>用于DNA纯化的无DNase的RNase</td><td>&amp;nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>核酸提取后用于RNA消化</td></tr><tr><td>dPCR 探针 PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>dPCR 软件&amp;nbsp;</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td>QIAcuity 软件套件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高架平台</td><td>多个来源</td><td>N/A</td><td>使用一个空的移液器吸头盒在尾部加温过程中垫高小鼠固定器</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>多个来源</td><td>N/A</td><td>此处使用的型号：Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>荧光显微镜软件&amp;nbsp;</td><td>多个来源&amp;nbsp;</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td>此处使用的软件：NIS-Elements&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>纱布</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>金属容器</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>甲基丁烷</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>高质量生物学</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>小鼠管式固定器</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Myfuge迷你离心机</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>聚合酶链式反应热循环仪</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1851148</td><td>型号：C1000 Touch</td></tr><tr><td>精密擦拭布</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR 纳米板 26k 24孔</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One dPCR 系统</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>用于从组织中提取 DNA</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA Micro 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>用于基因组DNA的纯化，以及从小体积血液中分离DNA；该方案也用于FACS分选细胞的DNA提取</td></tr><tr><td>啮齿类动物固定器锥形管</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>比例尺</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>泡沫箱</td><td>多个来源</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>表面清洁剂和消毒剂</td><td>Peroxigard</td><td>29101&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>多个来源</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>转移镊子</td><td>精细科学工具（F.S.T）</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>涡旋</td><td>Daigger &amp;安普公司</td><td>22220A</td><td>型号：Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

通过侧尾静脉注射在成年小鼠中稳定递送腺相关病毒

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

许多疾病会影响多个器官或累及身体的不同部位，因此必须通过全身给药方式将治疗药物递送至分布在各处的靶细胞。静脉注射是临床前研究中广泛使用的一种全身给药途径，适用于评估需在全身范围内发挥作用的治疗方法。在成年小鼠中，该方法是将治疗剂注入小鼠尾部侧面的静脉。一旦掌握，尾静脉注射操作安全、快速，且仅需简单并常见的实验工具。然而，尾静脉注射技术难度较高，需要经过大量训练和持续练习，以确保准确递送预定剂量。
本文介绍了一种基于我们自身经验以及先前其他研究团队所报告建议而优化的详细尾静脉侧向注射方案。除小鼠固定器和胰岛素注射器外，本方案仅需大多数实验室中常见的试剂和设备。我们发现，按照本方案操作可稳定、成功地将腺相关病毒（AAV）经静脉注射递送至未麻醉的7至9周龄小鼠尾静脉中。此外，我们还描述了用于评估AAV转导效率及生物分布的优化方案，包括荧光报告蛋白的组织学检测以及每二倍体基因组中病毒基因组拷贝数（vg/dg）的定量分析。本方案的目标是帮助实验人员更轻松、稳定且可重复地完成尾静脉注射操作，从而缩短掌握该技术所需的练习时间。

7至9周龄的雄性小鼠通过尾静脉侧向注射方式给予AAV，每只小鼠注射剂量为1.5 × 1012 vg，注射体积为150–200 µL。所使用的单链DNA AAV携带由CMV启动子驱动的Cre重组酶转基因。注射的小鼠在Cre报告基因Ai14等位基因上为纯合子。当暴露于Cre重组酶时，含有Ai14等位基因的细胞会表达荧光蛋白tdTomato。由于tdTomato的表达是由Cre介导的基因组重组所引发的，因此表达tdTomato的细胞表明这些细胞要么是直接被AAV转导的细胞，要么是转导细胞的子代细胞。此处展示的数据来自注射了AAV9-CMV-Cre的小鼠，剂量为每只小鼠1.5 × 1012 vg，注射体积为160 µL（相当于5.8–5.9 × 1013 vg/kg）。小鼠在注射后28天被处死，组织按上述方法收集。部分骨骼肌和肝叶经消化处理，并通过FACS收集细胞。部分肝叶立即使用预冷的甲基丁烷冷冻，用于核酸提取。部分骨骼肌和肝叶则进行固定-冷冻处理，以便对荧光tdTomato进行组织学成像。tdTomato在肝脏（图2A）和股四头肌（图2C）中广泛表达，表明AAV9能够广泛到达并转导这两种组织的不同区域。
采用新鲜冷冻肝脏和FACS分选细胞中提取的DNA，通过数字PCR（dPCR）定量病毒基因组拷贝数与二倍体基因组拷贝数的比值（vg/dg）。vg/dg的定量可用于评估注射的一致性以及AAV在分析样本中的转导效率。新鲜冷冻肝脏组织样本和FACS分选细胞的1D液滴散点图用于验证检测的有效性（图3A、C）。散点图显示存在阳性和阴性分区，阳性和阴性分区之间有清晰的分离，可准确确定检测阈值，并且在阳性和阴性分区之间几乎没有或仅有少量液滴，从而避免降低dPCR检测的准确性。满足上述所有标准表明dPCR检测结果有效。通过定量各样本中Polr2a基因的拷贝数来确定小鼠二倍体基因组的数量（每个小鼠二倍体基因组含2个Polr2a基因拷贝），并使用针对Cre重组酶转基因序列的引物/探针来定量病毒基因组（每个病毒基因组含1个转基因拷贝，表1）。对新鲜冷冻肝脏组织样本和FACS分选细胞的vg/dg值进行定量，结果显示其vg/dg值分别为187.7和4.7（图3B、D）。PBS注射小鼠的样本以及不含核酸的非模板对照作为阴性对照使用。
<img alt="基因编辑装置；PCR工作站；微量移液器；凝胶电泳；DNA分析实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：静脉注射操作站概览。（A）进行静脉注射所需的工具。图中显示：（1）计时器，（2）小鼠管状固定器，（3）未切割和（4）已切割的塑料固定锥形套，（5）酒精棉片，（6）空的移液器吸头盒（用作抬高小鼠管状固定器的平台），（7）一次性吸水垫，（8）装有温水的15 mL锥形管，（9）15 mL管架，（10）纱布，以及（11）胰岛素注射器。（B）首先将小鼠放入管状固定器中。如果小鼠体型过小，仅靠管状固定器无法有效固定，则插入已切割的固定锥形套，在小鼠周围形成一个固定套筒。确保固定装置不会阻碍小鼠呼吸。将管状固定器置于抬高的平台上，以便将小鼠尾巴浸入温水中。（C）注射前小鼠尾巴的位置及持针角度。向后轻拉尾巴使其伸展，使注射部位完全水平。针头应与尾巴及静脉平行，针尖斜面朝上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="AAV9-CMV-Cre 病毒在肝脏和股四头肌中的基因表达；与 PBS 的荧光显微镜比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：静脉注射后荧光报告蛋白的检测。 对携带 Cre 报告基因 Ai14 等位基因的 7 至 9 周龄雄性小鼠，通过静脉注射给予 AAV9-CMV-Cre 病毒（每只小鼠 1.5 × 1012 vg，溶于 160 µL，相当于 5.8–5.9 × 1013 vg/kg）或 PBS。图中显示的是静脉注射 AAV9 递送 Cre 后小鼠（A）肝脏或（C）股四头肌切片的代表性荧光图像。（B）肝脏或（D）股四头肌切片来自注射 PBS 的小鼠，作为阴性对照。组织在静脉注射后 28 天采集，并进行固定冷冻处理。Cre 暴露后，荧光 tdTomato 蛋白在被转导的细胞及其子代细胞中表达。切片厚度为 10 µm，放大倍数为 10×。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA结合分析的流式细胞术结果；分析后的分区样本的散点图和图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：每二倍体基因组的载体基因组（vg/dg）定量。 对注射了AAV9-CMV-Cre或PBS的小鼠所获取的（A）肝组织或（C）FACS分选细胞样本中，通过dPCR定量载体基因组的1D散点图。散点图显示了dPCR的阳性与阴性分区，以及横跨各样本的检测阈值线。（B,D）在对（B）肝组织或（D）FACS分选细胞样本中的小鼠二倍体基因组和载体基因组进行定量后得到的vg/dg值。本图结果来自一只注射AAV9的小鼠和一只注射PBS的小鼠，每只小鼠均设有dPCR技术重复。误差线表示每个样本的95%置信区间。缩写：NTC = 无模板对照；dPCR = 数字PCR；FACS = 荧光激活细胞分选。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre 正向引物</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre 反向引物</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre 探针</td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polr2a 正向引物</td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polr2a 反向引物</td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polr2a 探针</td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于vg/dg定量的引物和探针序列。Cre 引物和探针用于定量载体基因组。Polr2a 引物和探针用于定量小鼠二倍体基因组。

本文详细介绍了一种优化的小鼠侧尾静脉注射方案，用于在成年小鼠中系统性给予腺相关病毒（AAV）。此外，我们还描述了常用的检测方法，以评估AAV的转导效率。

许多疾病会影响多个器官或涉及身体的不同部位，因此系统性地递送治疗药物以靶向……至关重要

我们致力于开发针对先天性及早发性肌营养不良症和神经肌肉疾病的基因疗法。为实现这一目标，我们采用多种基因治疗手段，以解决这些疾病的潜在遗传病因。病毒性和非病毒性基因治疗载体的持续发展对我们的研究领域至关重要。随着新型改进的病毒性和非病毒性基因治疗载体的出现，基因治疗的安全性和效率得到提升，从而进一步提高了治疗的安全性，并缩短了使这些疗法达到患者可用所需的时间。在本方案中，我们提供了执行小鼠侧尾静脉注射的全面且详细优化的步骤，旨在帮助实验人员稳定、成功地完成注射操作。首先，将小鼠尾巴插入固定管的顶部开口。缓慢将小鼠拉入管内，并在小鼠前方放置塞子，防止其逃脱。对于体型较小的小鼠，可制作一个限制套管：从锥形管的鼻端进行剪切，确保小鼠鼻部不被堵塞，并有足够的空间呼吸。然后剪裁锥形管的后部，使其长度与小鼠相近。将小鼠放入之前所述的管状固定器中。在握住小鼠尾巴的同时，让小鼠自行走入锥形管内。将固定锥形管插入管中。确保小鼠的尾巴完全从管后端伸出，且小鼠在锥形管内有足够空间呼吸。立即将管塞固定在锥形管前端的鼻部开口处。用温水填充15毫升的锥形管。将装有小鼠的固定管置于抬高的平台上。将固定住的小鼠尾巴浸入温水中至少一分钟，直至侧尾静脉明显扩张并清晰可见。将未加盖的腺相关病毒（AAV）置于含有1.7毫升的微量离心管中，并放入离心管架。用惯用手将针头垂直插入管中。针头进入管内后，用非惯用手握住离心管。然后将试管和注射器同时抬高至与眼睛齐平，同时确保针头不接触试管壁。将双臂放在桌面上，缓慢将药液吸入注射器中。在一次性吸水垫上方排出注射器中的气泡。将注射液保持40秒以使其升温。确认尾静脉清晰可见后，将管状固定器从 elevated platform 上取下并直接放置在桌面上。将小鼠置于固定器中，使其足部朝下，以便于操作尾巴。用纱布快速擦拭尾部使其干燥。然后用酒精棉片擦拭尾部，再次用干纱布擦干。将尾部向左或向右旋转约90度，使两条侧静脉中的一条朝上。在尾部中段三分之一处选择一个合适的注射部位。用非优势手的拇指和食指夹住尾部，食指位置紧邻注射部位的远端。将尾部弯折至食指上方，使注射部位平整地贴合在食指上。然后向后牵拉尾部以使其伸展，并使注射部位完全保持水平。用优势手的食指和中指夹住注射器筒身的凸缘两侧，同时将拇指置于推杆处待命。将双手均置于桌面上，使针头直接接触尾部，与尾部及静脉平行，针尖斜面朝上。现在对针头施加向下的压力，将其向前滑入静脉，以将AAV溶液注入静脉。给药后，缓慢拔出针头，并立即用纱布在注射部位按压至少10秒，直至出血停止。注射后荧光报告蛋白的组织学成像显示，tdTomato在肝脏和股四头肌中广泛弥散表达，表明AAV9广泛到达并转导了这两种组织的不同区域。

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

通过侧尾静脉注射在成年小鼠中持续递送腺相关病毒

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

来源：Pourshafie, N., 等. 利用重组腺相关病毒9型系统性递送microRNA治疗啮齿类动物神经肌肉疾病. J. Vis. Exp.

在脊髓延髓肌萎缩症小鼠模型中注射重组腺相关病毒载体

来源：Grames, M. S., 等．大鼠腺相关病毒静脉注射方法与技巧及中枢神经系统转导评估．J. Vis. Exp.

在大鼠模型中静脉注射重组腺相关病毒载体

本文描述了在神经肌肉疾病的小鼠模型中，使用重组腺相关病毒9型递送microRNA的方法。在小鼠中单次外周给药即可在肌肉和运动神经元中实现miRNA的持续过表达，为在活体（in...

利用重组腺相关病毒9型系统性递送微小RNA治疗啮齿类动物神经肌肉疾病

本研究的目的是在成年小鼠中利用一种新型的软膜下基因递送技术，开发并验证脊髓腺相关病毒9型（AAV9）介导的基因递送的有效性和安全性。...

成年小鼠脑膜下腺相关病毒9（AAV9）载体递送

介绍了在大鼠中实现中枢神经系统大范围基因递送的方法。本示例的目的是模拟一种影响整个脊髓的疾病。通过广泛的转导，可实现仅通过一次外周给药，便将治疗性蛋白递送至中枢神经系统。...

腺相关病毒大鼠静脉注射方法及中枢神经系统转导效果评估的方法与技巧

本文介绍了一种使用含1%盐酸利多卡因的病毒溶液进行直接鞘内注射的技术，以确保腺相关病毒高效递送至小型动物，并建立了一种评分系统，可根据利多卡因引起的短暂性肌力减弱程度来预测中枢神经系统中的转导效率。...

成年小鼠脑脊液内直接注射重组腺相关病毒

在本研究中，通过使用由输注/抽取注射泵、可拆卸气密注射器及显微注射针组成的注射系统，证明了结膜下注射可作为小鼠眼组织有效的载体递送方法。该注射系统也可适用于其他眼内给药途径。...

小动物模型中腺相关病毒载体的结膜下给药

本文描述了一种对幼年大鼠腰池进行注射的外科手术方法。该方法已用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计也可适用于多种其他治疗剂，包括细胞和药物。...

通过腰池注射在幼年大鼠中进行鞘内载体递送

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

学习通过侧尾静脉注射在成年小鼠中持续递送腺相关病毒的方法，用于基因治疗研究。该优化方案可提高AAV转导效率并确保实验结果的可重复性。

通过侧尾静脉注射在成年小鼠中稳定递送腺相关病毒

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