Name: 单动物、单管 RNA 提取，通过 qRT-PCR 比较缓步动物 Hypsibius 示例中的相对转录水平 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 了解从单个缓步动物Hypsibius exemplaris中提取RNA并进行qRT-PCR分析的方法。该技术通过物理裂解和冻融循环，将提取时间缩短约30%，效率提升200倍以上，适用于神经韧性分子机制研究。

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我们感谢以下资助：NIH Ruth Kirschstein 博士后奖学金 #5F32AG081056-02、Errett Fisher 博士后奖学金（资助 Molly J. Kirk 博士）、Crowe 家族奖学金（资助 Chaoming Xu）、加州大学圣塔芭芭拉分校学术参议院资助，以及 NIH 资助项目 #R01GM143771 和 #2R01HD081266，这些资助支持了本研究工作。作者还感谢加州纳米系统研究所内的生物纳米结构实验室所提供的技术支持，该实验室由加州大学圣塔芭芭拉分校以及加州大学校长办公室资助。

<img alt="缓步动物cDNA合成过程：冻融循环、RT-PCR分析、移液装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：从单个缓步动物中提取RNA的单管操作流程。 （A）从单个缓步动物中提取RNA并进行后续cDNA合成的操作流程示意图，包括六次冻融循环。样品后续可用于RT-PCR和qRT-PCR分析。（B）用于去除水分的微移液管拉尖示意图。比例尺：2 mm。（C）在少量水中缓步动物的明场图像（虚线所示）。为成功提取RNA并防止裂解缓冲液被稀释，需将大部分水分去除至图示程度。比例尺：50 μm。（D）使用长镊子将样品浸入液氮中以安全快速进行冻融操作的示意图。部分图像使用BioRender制作。Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
注意：图1A 展示了该实验流程的示意图。有关缓步动物和藻类培养的详细步骤，请参考已发表的文献45,46,47。
1. 矿泉水的灭菌
<ol>
	<li>从5加仑的水桶中倒入2升泉水至一个2升耐高压玻璃瓶中（具体信息参见材料表）。</li>
	<li>将瓶盖盖在耐高压瓶上，并用少量高压灭菌胶带封口。不要拧紧瓶盖，仅将其放置在瓶口上方。</li>
	<li>在湿循环模式下对泉水进行高压灭菌，不进行干燥步骤，持续50分钟。</li>
	<li>让水冷却至室温（RT），然后拧紧瓶盖，并在室温下储存。</li>
</ol>
2. 玻璃微电极拉制（使用微电极拉制仪）
<ol>
	<li>将一根玻璃微量移液管（外径：1 mm，内径：0.58 mm，长度：10 cm）固定在微量移液管拉制仪上。避免与加热丝接触，以免改变移液管形状并损坏加热丝。
	<ol>
		<li>针对每根加热丝和不同的拉制仪，需通过实验经验确定移液管的拉制参数。但作为优化的起始参考，可采用 78 °C 的加热温度，并以 182.2 g 的拉力进行单步拉制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使加热丝升温，利用重力将玻璃微量移液管拉成两根具有尖锐尖端的玻璃微量移液管（图 1B）。</li>
	<li>将制备好的玻璃微量移液管存放于带盖的 100 mm 培养皿中，并用石蜡或黏土固定，以防止尖端折断。</li>
</ol>
3. 玻璃微电极拉制（无微电极拉制仪）
<ol>
	<li>将本生灯或其他可控火焰源调至低档并点燃。</li>
	<li>用双手各持一根玻璃微量移液管的一端。</li>
	<li>将玻璃微量移液管的中部置于火焰上加热，直至玻璃开始熔化。随后迅速将两端拉开，形成两个非常精细且尖锐的尖端。</li>
	<li>用一对无菌精细镊子轻轻折断尖端以使其开口。</li>
	<li>将这些拉制好的玻璃微量移液管存放于一个密闭的 100 mm 培养皿中，并使用石蜡或黏土固定，以防止尖端折断。</li>
</ol>
4. RNA 提取
<ol>
	<li>在耐低温容器中取 0.5 L 液氮。 
	注意：液氮具有极低温性质，接触皮肤或眼睛可能造成冻伤。操作时应穿戴防护服、防溅护目镜、腈手套、低温手套、实验服及包趾鞋。运输液氮前须确认容器适用于液氮。此步骤也可使用乙醇-干冰浴替代。</li>
	<li>配制 cDNA 合成主混合液：将 1 µL 随机六聚体引物、2 µL DNase、4 µL 5x RT Buffer、1 µL 酶混合液、1 µL H2O 和 1 µL 10 mM dNTPs 混合，总体积为 10 µL。将该溶液置于冰上保存。</li>
	<li>配制缓步动物裂解缓冲液（5 mM Tris (pH = 8)、0.5% (v/v) 去垢剂 1、0.5% (v/v) 去垢剂 2、0.25 mM EDTA 溶于无核酸酶的无菌水中）。 
	注意：该溶液可在室温下存放 6 个月。但需保持无菌状态，并避免接触可能含有 RNA 酶的污染源。</li>
	<li>根据提取需要，分装足够量的裂解缓冲液（每只缓步动物 2 μL）。</li>
	<li>向缓步动物裂解缓冲液中加入 RNA 酶抑制剂，使其终浓度为 4 U/μL。</li>
	<li>涡旋混匀后，在室温下使用台式离心机以 2000 × g 离心 5 秒，随后将溶液置于冰上保存。</li>
	<li>使用无菌滤芯吸头 P1000 移液器从培养物中取出实验所需数量的缓步动物，并将其转移至无菌 35 mm 培养皿中。 
	注意：可按需处理任意数量的缓步动物。通常每个实验条件处理三只缓步动物用于提取。</li>
	<li>使用 1 mL 高压灭菌的无菌泉水和无菌滤芯吸头 P1000 移液器对缓步动物清洗三次。缓慢反复吹打有助于去除藻类污染物。</li>
	<li>在 25x 至 50x 放大倍数的解剖显微镜下，使用无菌滤芯吸头 P10 移液器将一只已清洗的缓步动物转移至新的无菌 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用无菌滤芯吸头 P200 移液器，用 100 μL 无菌无核酸酶水清洗单个缓步动物。 
	注意：此清洗步骤用于进一步去除包括核糖核酸酶在内的污染物。</li>
	<li>使用无菌滤芯吸头 P10 移液器，将已清洗的缓步动物连同 1–2 μL 无菌无核酸酶水转移至洁净无菌的 PCR 管底部，注意确保缓步动物未粘附在吸头侧壁上。</li>
	<li>在 25x 放大倍数的解剖显微镜下观察缓步动物。</li>
	<li>为便于去除水分，将拉制的玻璃毛细移液管尖端在管外轻轻折断。确保其孔径足够大以吸取水分，但不足以吸入缓步动物。</li>
	<li>利用拉制玻璃毛细移液管的毛细作用，吸除水分，直至缓步动物周围仅残留一个直径约为两个缓步动物体长的小水泡。</li>
	<li>通过解剖显微镜监测去水过程，确保水位适当且缓步动物保持湿润。 
	注意：图 1C 展示了应去除的水量示例。此为关键步骤。残留的小水泡可防止缓步动物干燥，但应尽可能去除多余水分，以避免稀释裂解缓冲液。有关残留水量的示例，请参见 图 1C。</li>
	<li>去水后立即向管底加入 2 μL 缓步动物裂解缓冲液，短暂涡旋混匀，并在台式离心机中室温下以 2000 × g 离心 5 秒。</li>
	<li>立即将含有缓步动物的样品放入 PCR 管架中，并确保样品被管架牢固固定。</li>
	<li>使用一对长柄粗齿镊夹住管架，轻轻将装有样品的管架浸入液氮中，直至完全冻结（图 1D）。</li>
	<li>将管架从液氮中取出，立即置于冰上，使其融化（约需 45 秒至 1 分钟）。每隔 15 秒将样品从冰上取出目视检查一次。当样品变得明显透明时，进入下一步。</li>
	<li>重复步骤 4.18–4.19 五次。总共需进行六次冻融循环，以实现最大程度的裂解与提取（图 2A、B）。</li>
	<li>完成冻融后，将样品置于冰上，并立即进入下一步。此时切勿将样品冷冻保存，否则会降低可用于 cDNA 合成的 RNA 量。</li>
</ol>
5. cDNA 合成
<ol>
	<li>向含有缓步动物裂解液的PCR管中加入2 μL cDNA合成预混液。轻轻弹动管壁混匀，然后使用台式离心机在室温下以2000 × g 离心5秒，随后将样品放回冰上。</li>
	<li>将样品放入热循环仪中，先在25 °C孵育10分钟以退火引物，再在55 °C进行逆转录反应30分钟，最后在85 °C加热5分钟以灭活酶。</li>
	<li>孵育结束后，立即将PCR管置于冰上，并加入21 μL无菌无核酸酶水，将样品稀释至总体积25 μL。对于低拷贝数的转录本，可根据实验经验调整此稀释步骤。</li>
</ol>
6. qPCR
<ol>
	<li>使用从较大量缓步动物中提取的总RNA确定引物对的退火温度，例如，采用Boothby, 201843中介绍的批量提取方法。</li>
	<li>运行PCR温度梯度以确定最佳退火温度，然后进行qRT-PCR（本方案中使用的所有PCR设置，请参见表1和表2）。</li>
	<li>将一管指示染料预混液置于冰上避光融化。将96孔qPCR板置于冰上，在所需数量的孔中分别加入5 μL预混液、2 μL水、各1 μL引物（10 μM）以及1 μL cDNA产物。</li>
	<li>用PCR板封膜密封反应板，并使用适用于该引物对的退火温度运行qRT-PCR（本文中使用的所有qRT-PCR设置，请参见表3）。</li>
</ol>
7. 定量分析与结果解读
<ol>
	<li>将结果与一个或多个对照管家基因进行定量比较，这些管家基因的表达量在所施加的条件下应保持恒定。本研究中使用了肌动蛋白基因（actin gene）。</li>
	<li>获取并比较每个孔的Ct值（循环阈值）与对照管家基因反应的Ct值。使用以下公式计算基因表达的变化倍数： 
	<img alt="qPCR分析公式：ΔCt = Ct(目标基因) - Ct(管家基因)，公式对比。" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	<img alt="比较基因表达分析的ΔΔCt方法公式，显示ΔCt(样品)−ΔCt(对照)。" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> 
	<img alt="基因表达倍数变化公式，2^(-ΔΔCt)，用于分析基因调控；公式。" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3"> 
	注：每个转录本及缓步动物的基因表达倍数以2-(ΔΔCt)48的形式作图表示。</li>
	<li>为根据Ct值粗略估算转录本数量，使用以下公式： 
	<img alt="指数衰减公式 N=10×2^(35-ct)，数学表达式。" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 4"> 
	其中N为转录本数量，2为假设的PCR扩增效率，即每轮PCR循环荧光信号增加的倍数48。</li>
</ol>

Optimized RNA Extraction for qRT-PCR in Individual Tardigrades

作者声明无任何利益冲突需要披露。

本研究提出了一种用于单个缓步动物qRT-PCR的高效RNA提取方法。将STST方法与现有的单个缓步动物RNA提取试剂盒直接比较后发现，STST RNA提取方法获得的肌动蛋白RNA转录本产量高出&gt;200倍，每样本成本降低至一美元以下，且提取时间缩短了30%。为将STST应用于一个相关的生物学问题，我们评估了短期热激反应的表达谱。结果发现，正如预期，HSP70β2和HSP90α的转录本在热处理1小时后均显著上调。
尽管STST方案相较于先前的方法已有显著改进，但仍存在若干局限性，为后续优化与评估提供了空间。首先，我们尚未评估STST检测极低表达水平转录本的能力。对于低丰度转录本，可能需要针对模板浓度进行优化调试。其次，虽然STST方法的成功率约为80%（定义为获得肌动蛋白Ct值小于31的提取物所占百分比），但有时仍无法获得足量可用的cDNA，这可能是由于RNase活性或裂解不充分所致。优化对RNase活性的抑制可能有助于提高成功率。最后，该方法在RNA质量方面仍有提升空间。正如本研究所示，可采取措施规避RNA降解及随后片段化的影响，并减轻其对qRT-PCR结...

缓步动物是一类小型多细胞动物，以其在对大多数其他生命形式致命的极端条件下仍能存活的能力而闻名1。例如，这类动物能够承受几乎比对人类致死剂量高1000倍的电离辐射&#160;2,3,4,5,6,7,8,9,10，能够耐受几乎完全脱水11,12,13,14,15，在无外源添加冷冻保护剂的情况下耐受冻结16,17,18，甚至在脱水状态下耐受太空的真空环境19,20。由于其在极端环境中独特的生存能力，这类动物已成为研究复杂多细胞生物耐受极端环境机制的基础模型1,21,22,23。
直到最近，对这些非凡动物进行稳定的遗传操作（包括转基因和生殖系基因修饰）仍然难以实现24,25。因此，目前揭示极端耐受性分子机制的大多数实验均通过RNA测序进行转录谱分析。已有大量有价值且信息丰富的RNA测序数据集，涵盖了缓步动物在多种极端条件下的响应，包括辐射8,9,26,27,28、热应激29、冷冻应激12以及干燥脱水27,30,31,32,33。其中一些研究采用了总RNA提取与纯化方法，增进了我们对极端耐受性的分子理解。然而，从大量个体中提取总RNA会阻碍对基因表达个体间差异的分析，从而错失更精细数据集可能提供的丰富信息。尤为重要的是，这些研究通常分析的是异质性动物群体，其中既包括能够耐受环境胁迫的个体，也包括未能存活的个体。因此，这类研究的结果往往因对多种甚至差异极大的应答状态进行平均化处理而受到干扰。为解决这一问题，Arakawa 等人于2016年34开发了一种精巧的低输入量RNA-seq流程，该流程采用RNA提取试剂盒，并结合线性PCR扩增步骤，可使用单个34,35,36或&#160;多个30,37,38动物作为起始材料。这些研究为我们理解缓步动物的极端耐受性奠定了基础22。有趣的是，该方案还已被应用于以七只动物为起始材料的qRT-PCR分析24。
在大多数模式生物中，通过 RNA-seq 鉴定出潜在靶基因后，通常会进一步进行 qRT-PCR，以验证 RNA-seq 所发现的转录水平变化，并高分辨率地评估候选基因的表达动态变化过程。为了验证所鉴定基因的功能，此类研究常继之以 RNAi 介导的分子靶点敲低实验。39,40 极端耐受能力的分析12,41每个RNAi敲降的效率通常通过qRT-PCR检测转录本丰度的下降来直接验证。然而，在缓步动物中，RNAi是一个劳动密集型过程，因为每条dsRNA必须通过个体的显微注射手动递送。39,40由于该策略通量较低，因此开发一种适用于从单个缓步动物个体进行qRT-PCR的快速、低成本RNA提取方法，将对缓步动物研究具有重要价值。尽管已有方法可用于从单个缓步动物中提取RNA，但这些方案尚未将其提取过程与qRT-PCR相结合，而是依赖基于光密度的检测方法12,40,41. 鉴于这些挑战，我们致力于开发一种能够从单个样本中稳定提取出适用于qRT-PCR的足量且高质量RNA的实验方案 H. exemplaris.
该方法改编自为秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）开发的单个动物RNA提取方案42，并针对H. exemplaris进行了优化。该提取方法包含六次快速冻融步骤，通过物理方式破坏角质层，从而实现RNA提取及后续的cDNA合成。与Boothby 2018年描述的批量RNA提取方法相比43，STST方法将提取时间缩短了24倍以上；与Arakawa等人2016年描述的单个缓步动物RNA提取试剂盒相比34，时间缩短了30%。此外，与RNA提取试剂盒制备过程相比，样本与实验人员的操作交互次数从5次减少至仅1次，从而降低了外源性核糖核酸酶污染的风险。在检测高表达基因时，STST方法可从单个缓步动物中获得足够的cDNA，用于进行25次定量RT-PCR反应，每次反应仅需总cDNA体积（25 μL）中的1 μL。然而，对于低丰度转录本，模板浓度需通过实验经验确定。
通过研究短时间热激（35°C下持续20分钟）条件下编码热休克蛋白90α（HSP90α）和热休克蛋白70β2（HSP70β2）的基因差异表达，评估了STST方法在分析基因表达动态变化方面的有效性。在大多数真核生物中，HSP70β2和HSP90α在短时间热激暴露（20分钟）后会迅速上调42。在H. exemplaris中的分析显示，从单个经热处理的缓步动物提取的HSP70β2和&#160;HSP90α编码RNA在短时间热暴露后，其表达量均呈现统计学上显著增加。这些结果表明，STST方案可用于随时间分析个体动物中基因表达的动态变化。
STST提取方法可通过实现快速且低成本的RNA提取，并随后通过qRT-PCR比较转录水平，从而作为RNA-seq等现有实验方法的有效补充。该方法还将有助于比仅使用光密度测定更定量地评估人工注射个体中RNA干扰的效率和渗透性。最后，由于其他缓步动物物种具有相似的角质层结构和物理特性，该方法很可能也适用于分析其他缓步动物物种的基因表达44。

<table><tbody><tr><td>10 &amp;micro;L 优质低吸附屏障吸头，盒装，无菌</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td><td>简称无菌滤芯P 10移液器&amp;nbsp;吸头</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L&amp;nbsp; 优质低吸附移液吸头，盒装，无菌</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td><td>简称无菌滤芯P 1000移液器&amp;nbsp;吸头</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L&amp;nbsp; 优质低吸附屏障吸头，盒装，无菌</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td><td>简称无菌滤芯P 200移液器&amp;nbsp;吸头</td></tr><tr><td>4星直头强中等尖头镊子&amp;nbsp;</td><td>Excelta&amp;nbsp;</td><td>00-SA-DC</td><td>简称长镊子</td></tr><tr><td>96孔PCR板架带盖，混装，每单位5个板架</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td><td>简称PCR板架</td></tr><tr><td>Andwin Scientific&amp;nbsp;3M无铅高压灭菌指示胶带 1&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>简称高压灭菌胶带&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高压灭菌胶带</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td>简称PCR板封膜</td></tr><tr><td>Benchling v8</td><td>Benchling</td><td>N/A</td><td>简称Benchling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BioRad硬壳96孔PCR板</td><td>BioRad&amp;nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>简称PCR板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BULWARK FR实验服：&amp;nbsp;</td><td>Grainger&amp;nbsp;</td><td>26CF64</td><td>简称实验服</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad热循环仪&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>简称热循环仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带CFX光学模块的C1000 Touch Bio-rad热循环仪&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>简称qPCR热循环仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroccoccum hypnosporum.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Carolina</td><td>152091</td><td>简称藻类</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;PYREX可重复使用培养基储存瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>简称2 L耐高压玻璃瓶</td></tr><tr><td>Daigger &amp;amp; Company Vortex-Genie 2实验室混匀器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>3030A</td><td>简称涡旋振荡器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Direct-zol Micro Prep&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>R2060</td><td>简称RNA提取试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont 5生物镊子</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11254-20</td><td>简称精细镊子</td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500&amp;nbsp;</td><td>简称EDTA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FIJI v 2.14.0/1.54f&amp;nbsp;</td><td>ImageJ,</td><td>N/A</td><td>简称FIJI/ImageJ</td></tr><tr><td>移液器拉制仪用灯丝&amp;nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>简称灯丝</td></tr><tr><td>Fisherbrand经济型防冲击护目镜</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-181-501</td><td>简称防溅护目镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃微量移液管外径1 mm，内径0.58 mm，长度10 cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&amp;nbsp;</td><td>简称玻璃微量移液管</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151品系&amp;nbsp;</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>简称缓步动物&amp;nbsp;或H. exemplaris&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 L液氮杜瓦瓶</td><td>Agar Scientific&amp;nbsp;</td><td>AGB7475</td><td>简称耐低温容器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1651</td><td>简称cDNA合成预混液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Narishige双阶段玻璃微量移液管拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>&amp;nbsp;PC-10</td><td>简称微量移液管拉制仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>腈手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-000-314</td><td>简称腈手套&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿，聚苯乙烯，35/10 mm，带通气孔</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>简称35 mm培养皿&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PIPETMAN P10，1&amp;ndash;10 &amp;micro;L，金属弹射器</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>简称P 10移液器</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000，100&amp;ndash;1000 &amp;micro;L，金属弹射器</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>简称P 1000移液器</td></tr><tr><td>PIPETMAN P200，20&amp;ndash;200 &amp;micro;L，金属弹射器</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F144058M</td><td>简称P 200移液器</td></tr><tr><td>Pound This四色油泥&amp;nbsp;</td><td>American Science Surplus</td><td>&amp;nbsp;96517P001</td><td>简称油泥&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Prism v10.0&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>简称Prism&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无RNase，8联管0.2 mL PCR管带盖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td><td>简称无菌PCR管</td></tr><tr><td>RNasin核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>N2111</td><td>简称RNase抑制剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>泉水&amp;nbsp;</td><td>Nestle Pure Life</td><td>44221229</td><td>简称泉水</td></tr><tr><td>SsoAdvanced通用SYBR Green预混液</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>简称指示染料预混液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带光学系统和照明的体视显微镜系统&amp;nbsp;</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1</td><td>简称解剖显微镜</td></tr><tr><td>Supertek Scientific&amp;nbsp;Tirrill本生灯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S09572B</td><td>简称本生灯&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Qualitron</td><td>&amp;nbsp;DW-41-115-NEW</td><td>简称台式离心机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tempshield&amp;nbsp;低温手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-305</td><td>简称低温手套&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nunc培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>简称100 mm培养皿&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-500&amp;nbsp;</td><td>简称Tris或Tris碱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka&amp;nbsp;</td><td>93443</td><td>简称去污剂1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma aldrich</td><td>P1379-500&amp;nbsp;</td><td>简称去污剂2</td></tr><tr><td>水 - PCR/RT-PCR认证，无核酸酶</td><td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td><td>简称无菌无核酸酶水</td></tr></tbody></table>

单动物单管rna提取法结合qrt-pcr比较缓步动物hypsibius exemplaris中的相对转录水平

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

缓步动物Hypsibius exemplaris是一种新兴的模式生物，以其耐受极端环境的能力而闻名。为了探究这种极端耐受性的分子机制和遗传基础，许多研究依赖于RNA测序（RNA-seq），该技术可用于从大规模群体到单个个体的不同样本量研究。随后通常使用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和RNA干扰（RNAi）分别验证RNA-seq结果，并评估候选基因的遗传必要性。此类研究需要一种高效、准确且经济的RNA提取方法，并能通过定量RT-PCR（qRT-PCR）测定转录本的相对表达水平。本文介绍了一种高效的单只缓步动物单管RNA提取方法（STST），该方法不仅能可靠地从单个缓步动物中分离RNA，还可显著减少每次提取所需的时间和成本。该RNA提取方法所获得的cDNA足以用于通过定量PCR（qRT-PCR）扩增和检测多个转录本。本方法通过分析两种热休克调控蛋白——热休克蛋白70 β2（HSP70 β2）和热休克蛋白90α（HSP90α）——编码基因在热处理个体中的动态表达变化加以验证，从而能够利用qRT-PCR评估其相对表达水平。STST方法有效补充了现有的批量及单只缓步动物RNA提取技术，使得通过qRT-PCR快速且低成本地检测单个缓步动物的转录水平成为可能。

单个缓步动物RNA提取方法的建立与优化 
基于Ly等（2015）42报道的RNA提取方案，对STST系统进行了优化，以最大化提取物的产量和质量（图1A）。通过扩增跨越外显子1和2的527 bp区域，对肌动蛋白转录本进行RT-PCR分析（这些引物序列见表1）。使用ImageJ/FIJI软件将预期的肌动蛋白条带光密度量化为荧光强度。所有凝胶中被量化的感兴趣区域面积均相等。
首先，评估了用于破坏缓步动物角质层的机械裂解方法。与先前报道的单个秀丽隐杆线虫（C. elegans）RNA提取方案不同，后者仅需蛋白酶K裂解和热激即可有效裂解动物个体42，而缓步动物的提取至少需要六次冻融循环才能实现稳定且高效的RNA提取（图2A，补充图1）。在每次冻融循环之间，...

本研究介绍了一种快速提取RNA并比较转录水平的方法，用于分析缓步动物Hypsibius exemplaris中的基因表达。该高通量方法采用物理裂解，仅需一只缓步动物作为起始材料，即可高效生成适用于定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）的cDNA。

单动物单管RNA提取法结合qRT-PCR比较缓步动物Hypsibius exemplaris中的相对转录水平

缓步动物赫西比俄斯·埃克塞姆普拉里斯（Hypsibius exemplaris）是一种新兴的模式生物，以其在极端环境条件下生存的能力而闻名。为探究其分子……

我们的研究重点是揭示极端耐受性缓步动物——典范小猪熊虫（Hypsibius exemplaris）中神经弹性的分子机制。我们研究缓步动物在暴露于极端环境后神经系统的改变。我们已发现，缓步动物在经历极端环境后，其神经解剖结构和运动功能发生了大规模的变化。将缓步动物作为分子生物学研究的模式生物相对较新。因此，许多技术尚未针对缓步动物的应用进行充分优化。尽管我们在转录组学、蛋白质组学和转基因技术方面已取得了显著进展，但用于目标蛋白验证和功能评估的方法与工具仍不够完善。目前从单个缓步动物中提取 RNA 的现有方案尚未应用于 qPCR，或需要多个个体进行提取。为了推进我们对缓步动物分子神经生物学的研究，我们需要一种能够从单个个体中提取并定量 RNA 的方法，以实现三个目标：第一，验证 RNA 测序结果；第二，评估对单个注射个体进行 RNA 干扰（RNAi）的效率；第三，探究种群中个体间转录变化的差异。我们的方法在三个方面对先前的技术进行了改进。与之前的单个缓步动物提取方法相比，该方法将提取时间缩短了约30%。我们的方法还通过省去线性PCR扩增步骤，使提取成本降低了100倍以上。最后，由于省去了纯化步骤（该步骤常导致RNA大量损失），我们的方法效率比以往方法高出200倍。我们的研究结果将使缓步动物研究人员能够以低成本且高效的方式，通过单个缓步动物的qRT-PCR来定量相对转录水平。我们认为该方法可用于高度定量地评估RNAi敲低效率、验证测序结果，并探究不同个体在转录响应上的差异。首先，将本生灯或其他可控火焰源调至低火点燃。用双手各持一根玻璃微量移液管的一端，将其中部置于火焰上，直至玻璃开始熔化。待其软化后，迅速将两端拉开，形成两个尖锐的尖端。然后，使用一对无菌精细镊子轻轻敲断微量移液管的尖端，以调节其锐利程度。将玻璃微量移液器固定在微量移液器拉制仪上，避免接触加热丝。作为优化的起始条件，设置加热极温度为78摄氏度，采用单一拉制步骤，拉制重量为182.2克。启动加热丝加热，使玻璃微量移液器在重力作用下断裂，形成两根具有尖锐末端的微量移液器。将拉制好的玻璃微量移液管存放于密闭的100毫米培养皿中，并用石蜡或黏土固定，以防止尖端折断。首先，获取所需尺寸的拉制玻璃微量移液管，然后配制互补DNA合成主混合液（Master Mix）和缓步动物裂解缓冲液。根据每只缓步动物使用2 µL裂解缓冲液，分装足量的裂解缓冲液用于提取。向裂解缓冲液中加入核糖核酸酶抑制剂，使其终浓度达到每微升4单位。短暂涡旋混匀溶液，然后在室温下于台式离心机中以2000×g离心5秒。将溶液置于冰上保存。使用带无菌滤芯的P1000移液器从培养物中吸取所需数量的缓步动物，并将其转移至无菌的35毫米培养皿中。用1毫升经高压灭菌的无菌泉水洗涤缓步动物三次，以去除藻类污染物。将培养皿置于解剖显微镜下，使用25倍至50倍的放大倍数，用带滤芯的P10移液器将一只缓步动物转移到新的无菌35毫米培养皿中。接着，用无菌带滤芯的P200移液器，以100微升无菌无核酸酶水清洗该只缓步动物。将清洗后的缓步动物转移至洁净无菌的PCR管中，加入一至二微升无菌无核酸酶水。在解剖显微镜下以 25 倍放大倍数观察缓步动物。为便于去除水分，将拉制的玻璃毛细管移出管外，轻轻敲断其尖端。利用玻璃毛细管的毛细作用去除水分，直至缓步动物周围仅剩一小泡水。向离心管中加入两微升缓步动物裂解缓冲液。短暂涡旋后，在室温下以2000g离心5秒，并将样品置于冰上保存。然后将含有缓步动物的样品放入PCR管架中，并牢固固定。用长柄粗齿镊子夹住样品架，轻轻将其浸入液氮中，直至样品完全冻结。接着将样品架从液氮中取出，置于冰上。开始解冻样品，每隔15秒观察一次，直至样品明显变为透明状。重复冻融过程五次后，将样品置于冰上。向含有缓步动物裂解液的 PCR 管中加入 2 µL 互补 DNA 合成主混合液。轻轻弹击管壁，于室温下以 2000×g 离心 5 秒，然后将样品置于冰上。现在，将样品加入热循环仪中，并启动 cDNA 合成程序。合成完成后，立即将离心管置于冰上。用 21 微升无菌无核酸酶水将样品稀释至终体积 25 微升。与未采用冻融循环的方案相比，优化后的方案使互补DNA产量提高了三倍，其中六次循环为最佳条件。当存在残留水分时，RNA提取未能成功，表明为确保稳定的裂解效果，彻底去除多余水分至关重要。每只缓步动物的RNA产量约为14.24纳克。该方案在肌动蛋白转录本得率方面比RNA提取试剂盒高效200多倍，这通过显著降低的Ct值以及强烈的凝胶条带扩增得以证明。

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