Name: 用于固相肽合成的商用微波反应器的廉价改造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 了解如何利用廉价改造的商用微波反应器进行固相肽合成，成功制备空间位阻氨基酸寡聚体。该方法为小型学术实验室提供了经济可行的微波辅助化学合成解决方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢费尔菲尔德大学INSPIRE基金以及化学系的支持 &amp;感谢费尔菲尔德大学生物化学系以及Dorothy Szobcynski博士在实验室管理方面的专业支持。此外，作者还感谢Jillian Smith-Carpenter教授和Aaron Van Dyke教授在肽和有机合成方面的有益讨论。&#160;作者感谢文理学院出版基金的支持 &amp;费尔菲尔德大学理学院

1. 组装仪器（图1）
注意：组装仪器所需的所有组件均见于材料表中。
<ol>
	<li>组装真空出口。
	<ol>
		<li>将 2&#34; 长的 1/8&#34; 聚四氟乙烯（Teflon）管连接至乙烯-四氟乙烯共聚物（ETFE）材质的三通接头（&#34;Tee&#34;）右侧（图1，部件标号 &#34;1&#34;）。</li>
		<li>将 1/8&#34; 聚四氟乙烯管连接至一个由 ETFE 制成的阀门（图1，部件标号 &#34;2&#34;）。</li>
		<li>在该阀门（图1，部件标号 &#34;2&#34;）的另一侧连接 100 cm 长的聚四氟乙烯管。</li>
		<li>将此管穿过橡胶塞上的 1/8&#34; 孔，并用该橡胶塞密封带侧臂的锥形瓶（图1A，部件标号 &#34;8&#34;），该锥形瓶连接至真空源（管道真空或小型泵）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装氮气进气口。
	<ol>
		<li>将 2&#34; 长的 1/8&#34; 聚四氟乙烯管连接至 ETFE 三通接头（&#34;Tee&#34;）左侧（图1，部件标号 &#34;1&#34;）。</li>
		<li>将 1/8&#34; 聚四氟乙烯管连接至一个 ETFE 阀门（图1，部件标号 &#34;3&#34;）。</li>
		<li>在该 ETFE 阀门（图1，部件标号 &#34;3&#34;）的另一侧连接 100 cm 长的 1/8&#34; 聚四氟乙烯管。</li>
		<li>将 1/8&#34; 聚四氟乙烯管的远端穿过一个橡胶塞，并用该橡胶塞连接至一段连接在氮气钢瓶上的泰氟龙（Tygon）管，氮气钢瓶需配备减压阀（图1A，部件标号 &#34;7&#34;）。</li>
		<li>在减压阀的针阀关闭的状态下，调节减压阀的隔膜阀（图1A，部件标号 &#34;7&#34;），使压力达到 5–10 psi。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装吸液器/鼓泡器。
	<ol>
		<li>将三通接头（&#34;Tee&#34;）的支管（图1，部件标号 &#34;1&#34;）连接至一段 100 cm 长、外径为 1/8&#34; 的聚四氟乙烯管。</li>
		<li>将该管穿过一个预先用针刺孔的微型隔垫（图1，部件标号 &#34;6&#34;）。</li>
		<li>将管完全插入气体分散管中，并利用微型隔垫在气体分散管（图1，部件标号 &#34;4&#34;）与聚四氟乙烯管之间形成密封。</li>
		<li>将气体分散管插入试管反应容器（图1，部件标号 &#34;5&#34;）中，并将试管放入其支架中（见 图1B），该支架位于微波反应器外部。 
		注：在进行化学反应时，试管将插入微波反应器内；而在加入反应溶液或溶剂洗涤时，试管应置于微波反应器外部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将敞口容器衰减装置连接至微波反应器。此时装置已准备就绪，可供使用。</li>
</ol>
2. 准备试剂
<ol>
	<li>配制 FMOC-氨基酸溶液。对于 0.100 mmol 规模，配制 0.2 M 的 FMOC-AA-OH DMF 溶液。每个偶联循环将使用 2.5 mL 氨基酸溶液。</li>
	<li>配制二异丙基碳二亚胺（DIC）偶联试剂。配制 1.0 M 的 DIC DMF 溶液。每次偶联反应将使用 1.0 mL DIC 溶液。</li>
	<li>配制 Oxyma Pure 添加剂溶液。配制 0.5 M 的 Oxyma DMF 溶液。每次偶联反应将使用 1.0 mL Oxyma 溶液。</li>
	<li>配制脱保护溶液。配制 20% v/v 的吗啉/DMF 溶液。每次脱保护过程需要 7 mL 溶液。每脱除一次 FMOC 保护基需进行两次脱保护操作。</li>
</ol>
3. 多肽树脂的制备
<ol>
	<li>称取适量质量的 SPPS Wang 树脂（100–200 目，聚苯乙烯交联 1% 二乙烯基苯），将干燥的树脂置于试管反应容器中。例如，对于 0.100 mmol 规模的合成，若树脂载量为 0.500 mmol g-1，则需要 200 mg 树脂。</li>
	<li>向树脂中加入 3 mL DMF 溶剂，在室温下溶胀树脂 15 分钟。此步骤中，确保氮气供应处于&#34;开启/打开&#34;状态以进行搅拌，真空阀（图 1，标注为&#34;2&#34;）处于&#34;关闭&#34;状态。调节氮气供应的针阀（图 1A，标注为 7）使溶液内产生轻微鼓泡。 
	注意：此调节设置适用于后续所有以氮气进行的搅拌操作。</li>
	<li>树脂溶胀 15 分钟后，在减压下抽除 DMF 溶剂：关闭 N2 阀（图 1，标注为&#34;3&#34;）；打开真空阀（图 1，标注为&#34;2&#34;），抽除 DMF 溶剂。当溶剂即将完全移除时，打开 N2 阀（图 1，标注为&#34;3&#34;）。</li>
	<li>重复步骤 3.2 和 3.3 共 2 次，以充分溶胀树脂。</li>
</ol>
4. 脱除FMOC保护基
注意：树脂可预先负载多种C端残基的FMOC保护氨基酸。因此，在溶胀树脂后，通常首先进行FMOC去除步骤。
<ol>
	<li>测试管反应容器位于微波反应器外部，且与真空阀相连图1，标记的 &#34;2&#34;）封闭后，直接向试管中加入7 mL 20%哌啶/DMF或20%吗啉/DMF。</li>
	<li>打开氮气阀（图1，标记的 &#34;3&#34;）以振荡珠子。 
	注意：固相肽合成树脂可预先装载C端氨基酸残基，并由FMOC保护。</li>
	<li>通过微波反应器插入含有珠子的试管 &#34;敞口容器&#34; 衰减器图1B反应器的金属端口</li>
	<li>使用微波炉在 90 °C 加热 2 分钟 动态模式：设置 温度目标 到 90 °C, 50 W 功率，保持时间 = 2.0 分钟 （参见 补充文件 1 通过微波炉的红外传感器监测温度；微波炉将自动降低功率以维持反应温度。（参见关于微波条件下脱保护的报告）。</li>
	<li>从微波反应器中取出含有珠子的试管。</li>
	<li>在真空条件下吸除DMF溶液及反应副产物：关闭N2 瓣膜图1，标记的 &#34;3&#34;）。打开真空阀（图1，标记的 &#34;2&#34;）。当溶液即将被抽干时，打开 N2 瓣膜（图1，标记的 &#34;3&#34;).</li>
	<li>关闭真空阀（图1，标记的 &#34;2&#34;加入3 mL DMF冲洗试管和气体分散管。</li>
	<li>在真空条件下吸除 DMF 溶剂洗涤液：关闭 N2 瓣膜（图1，标记的 &#34;3&#34;）。打开真空阀（图1，标记的 &#34;2&#34;。当溶液即将被抽干时，打开 N2 瓣膜（图1，标记的 &#34;3&#34;).</li>
	<li>重复步骤 4.7 和 4.8 两次，共用 DMF 溶剂洗涤三次。</li>
	<li>重复FMOC去除步骤4.1–4.9，共进行两次连续的去保护步骤。</li>
</ol>
5. FMOC 氨基酸的偶联
<ol>
	<li>将试管反应容器放置在微波反应器外部的支架中。</li>
	<li>手动向试管中的树脂加入 2.5 mL 0.2 M FMOC 氨基酸（5 倍摩尔过量）、1.0 mL 1.0 M DIC 缩合剂溶液（10 倍摩尔过量）和 1.0 mL 0.5 M 氧化物添加剂溶液（5 倍摩尔过量）。</li>
	<li>打开氮气阀门（图 1，标注为 &#34;3&#34;），以实现树脂珠的搅拌。</li>
	<li>通过开放容器衰减器（图 1B，反应器的金属端口）将装有树脂珠的试管插入微波反应器中。将溶液加热至 100 °C 并维持 10 分钟。使用微波炉的动态模式，设置目标温度为100 °C，功率 60 W，保温时间 = 10.0 分钟（参见补充文件 1中关于微波内偶联反应的报告）。通过微波炉的红外传感器监测温度；微波炉将自动降低功率以维持反应温度。</li>
	<li>从微波反应器中取出装有树脂珠的试管。</li>
	<li>在真空条件下抽吸 DMF 溶剂和反应副产物：关闭 N2 阀门（图 1，标注为 &#34;3&#34;）；打开真空阀门（图 1，标注为 &#34;2&#34;）；当溶液几乎被抽尽时，重新打开 N2 阀门（图 1，标注为 &#34;3&#34;）。</li>
	<li>关闭真空阀门（图 1，标注为 &#34;2&#34;）；加入 3 mL DMF 以冲洗试管和气体分散管。</li>
	<li>在真空条件下抽吸 DMF 洗涤液：关闭 N2 阀门（图 1，标注为 &#34;3&#34;）；打开真空阀门（图 1，标注为 &#34;2&#34;）；当溶液几乎被抽尽时，重新打开 N2 阀门（图 1，标注为 &#34;3&#34;）。</li>
	<li>重复步骤 5.7 和 5.8 两次，共进行三次 DMF 溶剂洗涤。</li>
</ol>
6. 重复固相肽合成（SPPS）循环
<ol>
	<li>重复第4节（Fmoc脱保护）和第5节（Fmoc氨基酸偶联）中的所有步骤，直至合成出目标序列的肽段。 
	注意：务必在微波反应仪外部、室温条件下，将试剂溶液直接加入试管反应容器中。此外，在将试管放入微波反应仪之前，须提前启动氮气搅拌。</li>
</ol>
7. 肽段切割
<ol>
	<li>将树脂转移至带砂芯的塑料注射器中。</li>
	<li>配制裂解液：每100 mg树脂使用1 mL体积，其中含95%三氟乙酸（TFA）、2.5%水和2.5%三异丙基硅烷（TIPS）。</li>
	<li>在室温下裂解肽链2小时，期间持续或间歇振荡。</li>
	<li>将肽产物在10 mL预冷的乙醚中沉淀。</li>
	<li>用少量乙腈/0.1%水溶液TFA重新悬浮沉淀物，并冷冻干燥过夜。</li>
</ol>

Versatile Home-Built Microwave-Assisted System for Peptide Synthesis

<ol><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+Synthesis+of+a+Tetrapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide.</a> J Am Chem Soc. 85 (14), 2149-2154 (1963).</li>
<li>Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+prize%3A+Merrifield+wins+in+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nobel prize: Merrifield wins in chemistry.</a> Nature. 311 (5988), 699-699 (1984).</li>
<li>Jaradat, D. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirteen+decades+of+peptide+synthesis%3A+key+developments+in+solid+phase+peptide+synthesis+and+amide+bond+formation+utilized+in+peptide+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Thirteen decades of peptide synthesis: key developments in solid phase peptide synthesis and amide bond formation utilized in peptide ligation.</a> Amino Acids. 50 (1), 39-68 (2018).</li>
<li>Paradís-Bas, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+the+synthesis+of+%26%2334%3Bdifficult+peptides.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The road to the synthesis of &#34;difficult peptides.&#34.</a> Chem Soc Rev. 45 (3), 631-654 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Study+of+diketopiperazine+formation+during+solid-phase+peptide+synthesis+of+tirzepatide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Study of diketopiperazine formation during solid-phase peptide synthesis of tirzepatide.</a> ACS Omega. 7 (50), 46809-46824 (2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylation+in+amino+acids+and+peptides%3A+Scope+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">N-methylation in amino acids and peptides: Scope and limitations.</a> Biopolymers. 109 (10), e23110(2018).</li>
<li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+coupling+reagents%2C+more+than+a+letter+soup%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Peptide coupling reagents, more than a letter soup.</a> Chem Rev. 111 (11), 6557-6602 (2011).</li>
<li>Subirós-Funosas, R., Nieto-Rodriguez, L., Jensen, K. J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMU%3A+scope+and+limitations+of+the+latest+innovation+in+peptide+acyl+transfer+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peptide+Sci%22%5BJournal%5D)">COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents.</a> J Peptide Sci. 19 (7), 408-414 (2013).</li>
<li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMU%3A+A+third+generation+of+uronium-type+coupling+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peptide+Sci%22%5BJournal%5D)">COMU: A third generation of uronium-type coupling reagents.</a> J Peptide Sci. 16 (1), 6-9 (2010).</li>
<li>Wenschuh, H., Beyermann, M., Rothemund, S., Carpino, L. A., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+solid-phase+synthesis+via+Fmoc-amino+acid+fluorides%5BTitle%5D)+AND+%22Tet+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple solid-phase synthesis via Fmoc-amino acid fluorides.</a> Tet Lett. 36 (8), 1247-1250 (1995).</li>
<li>Wenschuh, H., Beyermann, M., Krause, E., Carpino, L. A., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+solid+phase+assembly+of+peptides+bearing+contiguous+highly+hindered+Aib+residues+via+Fmoc+Aib+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Efficient solid phase assembly of peptides bearing contiguous highly hindered Aib residues via Fmoc Aib fluoride.</a> Tetrahedron. 34 (23), 3733(1993).</li>
<li>Wenschuh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fmoc+amino-acid+fluorides+-+convenient+reagents+for+the+solid-phase+assembly+of+peptides+incorporating+sterically+hindered+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Fmoc amino-acid fluorides - convenient reagents for the solid-phase assembly of peptides incorporating sterically hindered residues.</a> J Org Chem. 59 (12), 3275-3280 (1994).</li>
<li>Manne, S. R., De La Torre, B. G., El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OxymaPure+coupling+reagents%3A+beyond+solid-phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">OxymaPure coupling reagents: beyond solid-phase peptide synthesis.</a> Synthesis. 52 (21), 3189-3210 (2020).</li>
<li>Collins, J. M. Microwave-enhanced synthesis of peptides, proteins, and peptidomimetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JM+%22Microwaves+in+Organic+Synthesis%22">Microwaves in Organic Synthesis</a>. Hoz, A., Loupy, A. , Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA: Weinheim, Germany. 897-959 (2012).</li>
<li>Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+heating+in+solid-phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Microwave heating in solid-phase peptide synthesis.</a> Chem Soc Rev. 41 (5), 1826-1844 (2012).</li>
<li>Pedersen, S. L., Sørensen, K. K., Jensen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+microwave-assisted+SPPS%3A+Optimization+of+protocols+and+synthesis+of+difficult+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Sci%22%5BJournal%5D)">Semi-automated microwave-assisted SPPS: Optimization of protocols and synthesis of difficult sequences.</a> Peptide Sci. 94 (2), 206-212 (2010).</li>
<li>Zeko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectroscopy+and+density+functional+theory+calculations+of+13C+isotopologues+of+the+helical+peptide+Z-Aib+6+-OtBu%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectroscopy and density functional theory calculations of 13C isotopologues of the helical peptide Z-Aib 6 -OtBu.</a> J Phys Chem B. 118 (1), 58-68 (2014).</li>
<li>Gord, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation-specific+spectroscopy+of+capped%2C+gas-phase+Aib+oligomers%3A+Tests+of+the+Aib+residue+as+a+310-helix+former%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Conformation-specific spectroscopy of capped, gas-phase Aib oligomers: Tests of the Aib residue as a 310-helix former.</a> Phys Chem Chem Phys. 18 (36), 25512-25527 (2016).</li>
<li>Fischer, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-conformation+spectroscopy+of+capped+aminoisobutyric+acid+dipeptides%3A+the+effect+of+C-terminal+cap+chromophores+on+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Single-conformation spectroscopy of capped aminoisobutyric acid dipeptides: the effect of C-terminal cap chromophores on conformation.</a> J Phys Chem A. 123 (19), 4178-4187 (2019).</li>
<li>Hjørringgaard, C. U., Pedersen, J. M., Vosegaard, T., Nielsen, N. C., Skrydstrup, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automatic+solid-phase+synthesis+of+peptaibols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">An automatic solid-phase synthesis of peptaibols.</a> J Org Chem. 74 (3), 1329-1332 (2009).</li>
<li>Haynes, S. R., Hagins, S. D., Juban, M. M., Elzer, P. H., Hammer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+solid-phase+synthesis+of+%CE%B1%2C%CE%B1-dialkylated+amino+acid-rich+peptides+with+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peptide+Res%22%5BJournal%5D)">Improved solid-phase synthesis of α,α-dialkylated amino acid-rich peptides with antimicrobial activity.</a> J Peptide Res. 66 (6), 333-347 (2005).</li>
<li>Zieleniewski, F., Woolfson, D. N., Clayden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-phase+concatenation+of+Aib+residues+to+form+long%2C+water-soluble%2C+helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Automated solid-phase concatenation of Aib residues to form long, water-soluble, helical peptides.</a> Chem Commun. 56 (80), 12049-12052 (2020).</li>
<li>CEM Corporation. Manual peptide synthesis. Discover SPSS. , https://cem.com/discover-spps (2023).</li>
<li>Theis, C., Degenkolb, T., Brückner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+selective+trifluoroacetolytic+scission+of+native+peptaibols+and+model+peptides+using+HPLC+and+ESI-CID-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodivers%22%5BJournal%5D)">Studies on the selective trifluoroacetolytic scission of native peptaibols and model peptides using HPLC and ESI-CID-MS.</a> Chem Biodivers. 5 (11), 2337-2355 (2008).</li>
<li>Ya-Ting Huang, A., Kao, C. -L., Selvaraj, A., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+dendrimer+synthesis%3A+a+promising+approach+to+transform+dendrimer+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-phase dendrimer synthesis: a promising approach to transform dendrimer construction.</a> Materials Today Chemistry. 27, 101285(2023).</li>
<li>Flemmich, L., Bereiter, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of modified RNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 63 (22), e202403063(2024).</li>
<li>Li, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+electrosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solid-phase electrosynthesis.</a> Acc Chem Res. 56 (24), 3694-3703 (2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍的装置采用一种简单、新颖且低成本的方法，在微波辅助固相肽合成（SPPS）过程中去除溶剂、过量试剂和副产物，同时可引入氮气进行搅拌。与传统的SPPS反应容器（在容器底部使用烧结滤板）不同，本装置在真空条件下利用气体分散管对容器进行抽吸。因此，反应容器仅为普通的试管，并置于微波反应仪制造商推荐的位置，在&#34;敞口容器衰减器&#34;内进行加热。
我们的主要创新是通过一种方法从试管中去除溶剂和反应副产物 &#34;气体分散管&#34; 在真空条件下。在微波辐照下的化学转化过程中，以及在用溶剂洗涤时（N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或 N-甲基吡咯烷酮（NMP）中，通过导管分散氮气来搅动SPPS树脂珠。真空和氮气由ETFE阀门控制，以优化对溶剂的耐受性。SPPS废液收集于侧管锥形瓶中。所有组件通过1/8英寸聚四氟乙烯（PTFE）管道连接。&#34; 聚四氟乙烯管。虽然我们使用 &#34;房屋&#34; 真空，使用机械真空泵同样可行。 图1，上方为实验装置的示意图。
成功的固相肽合成（SPPS）不仅需要适当的设备，还需要精确控制温度、时间和化学试剂的化学反应方案。采用Clayden等人22所描述的方案，我们已成功合成了若干种若非难以实现、便是无法通过传统的室温SPPS方法制备的多肽。在氨基酸偶联步骤中，我们使用二异丙基碳二亚胺（DIC）和Oxyma作为偶联试剂混合物，并在100 °C下辐照反应10分钟。Oxyma被认为可在偶联过程中抑制氨基酸残基的消旋化13。对于FMOC脱保护，我们采用含20%吗啉的DMF溶液，在90 °C下辐照2分钟，并重复该步骤一次。在各反应步骤之间，使用DMF对SPPS树脂珠（Wang树脂）进行反复清洗（3次）。
使用该手动装置，我们以每残基约40分钟的速度制备了难以合成的多肽。目前尚未研究该速度可能的优化方案。例如，我们认为微波反应器内的反应时间可能可缩短至 &#34;总反应时间，&#34; 与……相反 &#34;目标温度下的持续时间，&#34; 不会降低实验效果。这是由于在趋近目标温度时所花费的时间接近渐近线（参见 补充文件 1 （详见操作细节。）此外，原则上，可以不从微波反应器中取出反应容器而直接加入所有试剂和溶剂。然而，我们更倾向于在每一步骤中均能对树脂进行观察和检查。
尽管我们的应用案例是固相肽合成（SPPS），但应注意，固相方法正越来越多地应用于多种合成反应，例如树状大分子25、RNA26以及电化学合成27。许多其他应用场景也可能从微波辅助中受益，而本装置正适用于此类情况。最后，尽管该装置的设计初衷是用于微波辅助的SPPS，但其核心反应容器为试管，因此该装置也可用于常规的室温SPPS，以及在升温条件下进行的SPPS，例如置于油浴中进行的反应。

Merrifield 在 20 世纪 60 年代引入的固相多肽合成（SPPS）彻底改变了多肽和化学合成领域，并因此荣获诺贝尔化学奖1,2。在随后的几十年中，许多研究人员对 Merrifield 的原始技术进行了优化，发展出两种主导当前 SPPS 实践的方法：基于芴甲氧羰基（FMOC）和基于叔丁氧羰基（BOC）的方法3。在 FMOC 方法中，将多肽从固相树脂上最终裂解需要使用含三氟乙酸的裂解液，而 BOC 方法则需使用氢氟酸，因此 FMOC 方法成为许多实验室的首选。
当前先进的固相肽合成（SPPS）方法在某些目标序列面前仍面临挑战。近年来，研究人员已在克服一些特殊问题方面取得进展，例如肽链聚集4、二酮哌嗪形成5以及N-甲基化氨基酸残基的引入6。为了优化偶联产率，已有数千种偶联试剂和添加剂被探索和应用7。具体而言，通过COMU8,9或酰氟10,11,12&#160;活化羧基，并结合Oxyma13和羟基苯并三唑（HOBt）等添加剂，已成功用于解决诸如含α,α-二烷基化氨基酸残基等困难偶联反应。
其他非基于试剂的方法已被用于提高困难偶联反应的产率，包括延长反应时间， &#34;双偶联&#34; 以及加热，特别是微波加热14,15,16事实上，采用微波加热的市售自动多肽合成仪是市场上商业上最成功的产品之一，因为它们能够加快反应速率，似乎可提高多肽的最终纯度，并减少溶剂浪费。然而，这些仪器可能价格昂贵，在某些情况下成本超过10万美元。
本实验室致力于制备含有强螺旋诱导性残基α-氨基异丁酸（Aib）的多肽衍生物17,18,19由于其α-碳的二烷基化产生的空间位阻，Aib notoriously 难以偶联。上述方法（酰基氟化物、微波加热20），以及巧妙的 &#34;二肽&#34; 固相肽合成化学21，已被用于应对Aib偶联的挑战。尽管在树脂外制备Aib二聚体可提高总收率，但需要额外的湿化学操作 和 升高的温度（50 °C）21此外，我们避免使用Aib的酰基氟化物，因为氟化试剂具有毒性。遗憾的是，本实验室缺乏专用的基于微波的自动SPPS合成仪以及配套的反应容器，无法有效排出SPPS过程中产生的副产物。然而，Clayden课题组最近发表的一篇报告表明，采用SPPS结合微波辐照方法在合成Aib类寡聚物方面取得了显著成功22 促使我们调整实验室的CEM Discover SP微波仪，用于SPPS合成。
我们首先研究了CEM公司提供的商用配件，该配件可将微波反应器改装为手动固相肽合成/微波装置23除了成本之外，该配件还将导致我们的微波设备无法用于其他用途 仅 手动固相肽合成（SPPS）。其他实验室用户将无法再使用微波仪的优异功能。因此，在本案例中，采用该商业配件被认为不可行。
相反，我们利用相对廉价的组件组装了一套装置，用于在毫摩尔尺度上进行微波辅助固相多肽合成（SPPS）。以下方案描述了如何使用简单且相对廉价的组件实现手动的微波辅助固相多肽合成。

<table><tbody><tr><td>CEM Discover SP 微波反应器</td><td>CEM</td><td></td><td>已停用。&amp;nbsp; 最近已被 Discover 2.0 取代</td></tr><tr><td>二异丙基碳二亚胺（DCC）</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>赛默飞世尔科技化学品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型气体分散管&amp;nbsp;</td><td>Chemglass</td><td>CG-207-02</td><td>中等孔隙度</td></tr><tr><td>微型隔膜</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3022-20</td><td>&quot;核磁共振管&quot; 隔膜类型</td></tr><tr><td>吗啉</td><td>赛默飞世尔科技化学品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Fmoc保护的氨基酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oyxma Pure</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>侧臂锥形瓶</td><td>各种供应商</td><td></td><td>废物收集</td></tr><tr><td>&quot;Tee&quot;</td><td>Idex</td><td>P-713</td><td>ETFE</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管 1/8&quot;,&amp;nbsp;</td><td>Restek</td><td>25306</td><td>OD × 0.063&quot; ID，3 m</td></tr><tr><td>试管（用于微波反应器外部的反应容器支架）&amp;nbsp;</td><td>各种供应商</td><td></td><td>(30 × 175)</td></tr><tr><td>试管（反应容器）</td><td>康宁玻璃</td><td>9820-25X</td><td>Pyrex 25 x 200 mm，无边&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>瓣膜</td><td>Idex</td><td>P-721</td><td>ETFE（2倍）</td></tr><tr><td>Wang SPPS 树脂，1% 交联二乙烯苯，100-200 目</td><td>Advanced ChemTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于固相多肽合成的商用微波反应器的低成本改装方案

An Inexpensive Adaptation of a Commercial Microwave Reactor for Solid Phase Peptide Synthesis

本文介绍了一种自制的固相多肽合成（SPPS）装置，该装置借助微波辐射和加热辅助进行反应。与传统的SPPS反应容器不同，传统容器通过位于容器底部的烧结滤板排出溶剂和副产物，而本装置则采用在真空条件下工作的气体分散管来移除溶剂、副产物及过量试剂。同一根气体分散管还在偶联和脱保护等反应步骤中提供氮气，用于搅拌SPPS树脂珠。微波加热有利于空间位阻较大的氨基酸残基的SPPS偶联反应，例如α-氨基异丁酸（Aib），这是一种α,α-二烷基化氨基酸残基。该自制装置已成功用于通过手动Fmoc SPPS方法合成以Aib残基为主的七肽和八肽，这类多肽在标准室温条件和常规试剂下偶联极为困难。此外，典型的商用微波SPPS反应器仅专用于SPPS合成，导致非SPPS用户无法使用。相比之下，本装置可在完成SPPS后轻易从商用微波反应器中移除，从而保留了微波反应器在常规化学反应微波加速中的通用性。

使用我们的设备制备的肽序列示例如图2和图3所示。表1总结了我们所使用的溶液、微波参数及洗涤步骤。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）的验证结果见图中所示。这些肽的质量回收率均高于80%。值得注意的是，所有这些序列均包含多个相邻的α,α-二烷基化氨基酸之间的偶联。这类残基通过肽键形成进行连接是肽合成中最困难的反应之一。
<img alt="氮气鼓泡装置示意图及溶剂脱气实验；包含真空系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66937/66937fig01.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：自制微波辅助手动固相多肽合成（SPPS）装置。（A）示意图，显示：1）ETFE三通接头；2）连接至真空系统的ETFE阀门；3）连接至氮气的ETFE阀门；4）气体分散管，位于5）Pyrex玻璃试管反应容器内；6）核磁共振（NMR）型隔垫，用于将1/8英寸聚四氟乙烯（Teflon）管连接至气体分散管；7）针阀，用于控制氮气流速；8）侧臂烧瓶，用于收集反应废液。各组件的生产厂家及目录编号见材料表。（B）组装完成的装置照片。编号与图1A相同。缩写：SPSS = 固相多肽合成（solid phase peptide synthesis）；ETFE = 乙烯-四氟乙烯共聚物（ethylene tetrafluoroethylene）；NMR = 核磁共振（nuclear magnetic resonance）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱分析、化学结构、垂直柱状图中的杂质水平及光谱数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66937/66937fig02.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过微波固相肽合成法合成并经MALDI-TOF确认的肽1的结构。（A）使用CHCA作为基质。质荷比m/z = 880.18处的峰为钾加合物[MK+]，计算值m/z=880.45。（B）粗品肽1的HPLC图谱。流动相梯度为在0.1%水溶液TFA中，MeCN从20%线性增加至80%，运行时间20分钟。检测波长=222 nm。缩写：SPSS = 固相肽合成；MALDI-TOF = 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；CHCA = α-氰基-4-羟基肉桂酸；HPLC = 高效液相色谱；MeCN = 乙腈；TFA = 三氟乙酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="展示化学结构、m/z 峰和离子鉴定的质谱分析示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66937/66937fig03.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过微波固相肽合成法合成并经 MALDI-TOF 确证的肽 2 的结构。（A）使用 CHCA 作为基质。m/z = 1022.7 处的峰归属于钾加合物 [MK+]，计算值 m/z = 1023.5。m/z = 966.5 处的峰初步归属于C端恶唑酮经脱水形成，计算值 m/z = 967.524。（B）粗品肽 2 的 HPLC 色谱图。流动相梯度为在 0.1% 水溶液 TFA 中，20 分钟内乙腈（MeCN）从 20% 线性升至 80%。检测波长 = 222 nm。缩写：SPSS = 固相肽合成；MALDI-TOF = 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；CHCA = α-氰基-4-羟基肉桂酸；HPLC = 高效液相色谱；MeCN = 乙腈；TFA = 三氟乙酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>步骤</td>
			<td>溶液/溶剂</td>
			<td>体积 (mL)</td>
			<td>时间 (分钟)</td>
			<td>温度 (°C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>去保护</td>
			<td>20% 吗啉</td>
			<td>7</td>
			<td>2</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>洗涤</td>
			<td>DMF</td>
			<td>4, 4, 4</td>
			<td>-</td>
			<td>室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>去保护</td>
			<td>20% 吗啉</td>
			<td>7</td>
			<td>2</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>洗涤</td>
			<td>DMF</td>
			<td>4, 4, 4</td>
			<td>-</td>
			<td>室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>偶联</td>
			<td>Fmoc-AA-OH, OXYMA, DIC</td>
			<td>5, 2, 2</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>洗涤</td>
			<td>DMF</td>
			<td>4, 4, 4</td>
			<td>-</td>
			<td>室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>重复</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>结束</td>
			<td>裂解</td>
			<td>TFA/TIPS/H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>&gt;120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：0.1 mmol 规模微波辅助固相肽合成（SPPS）一个循环的步骤：FMOC 脱保护、洗涤及 FMOC-氨基酸偶联。 使用0.2 M FMOC-AA-OH、0.5 M OXYMA、1.0 M DIC。每步试剂均通过移液器手动加入试管中。缩写：SPPS = 固相肽合成；FMOC = 氟甲氧羰基；DIC = 二异丙基碳二亚胺。
补充文件 1：CEM Discover SP 微波反应器报告，用于去除 Fmoc 保护基团以及 CEM Discover SP 微波反应器报告，用于偶联 Fmoc 保护的氨基酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937_Supporting%20information.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

介绍了一种用于在商用微波反应器中进行固相多肽合成的简单、低成本且新颖的装置。

一种自制的固相多肽合成（SPPS）装置，可在微波辐射和加热辅助下进行反应，本文对此进行了介绍。与……相比，……

我们的研究团队开发了一种利用微波反应器在固相肽合成中制备空间位阻氨基酸寡聚物的方法。尽管用于此目的的商用设备价格昂贵，但我们的装置在制备这些寡聚物方面已被证明是成功且经济有效的。对于我们这样的学术研究人员而言，一台100,000美元的自动化微波固相肽合成仪超出了我们的预算范围。我们构建的装置能够将微波辅助化学合成与固相多肽合成的优势相结合。该装置在经济上适用于小型学术实验室，使我们这类实验室能够采用微波辅助合成方法，利用固相多肽技术制备空间位阻氨基酸的寡聚物。空间位阻氨基酸通常偶联产率较低。然而，这类氨基酸在多肽药物中的应用日益广泛，例如流行的减肥药物Wegovy。我们的装置将有助于研究人员在其工作中使用空间位阻氨基酸残基。首先，将一段长约2英寸、外径为1/8英寸的聚四氟乙烯（Teflon）管连接到由乙烯-四氟乙烯共聚物（ETFE）制成的T形接头的右侧。然后将该1/8英寸外径的聚四氟乙烯管连接至一个由ETFE制成的阀门上。再将一段100厘米长的聚四氟乙烯管连接至该阀门的另一端。将此导管插入橡胶塞的1/8英寸孔中，并用该橡胶塞密封连接至真空系统的侧臂三角烧瓶。组装氮气进气口时，将两英寸长的聚四氟乙烯（Teflon）导管连接到ETFE T形接头的左侧，并将该特氟龙导管连接至ETFE阀门。然后，将一段100厘米长、外径为1/8英寸的聚四氟乙烯导管连接到ETFE阀门的另一侧。将聚四氟乙烯管的远端穿过橡胶塞，并用该橡胶塞连接到装有减压阀的氮气瓶上的泰氟龙管。在减压阀的针阀关闭的情况下，通过减压阀的隔膜阀调节压力至5至10磅每平方英寸。组装抽吸器或鼓泡器时，将T形管的支管连接至一段长度为100厘米、外径为1/8英寸的聚四氟乙烯管。将此导管插入先前用针头刺穿的微型隔膜中。接着，将导管完全插入气体分散管内。利用微型隔膜在气体分散管与聚四氟乙烯导管之间形成密封。将气体分散管插入试管反应容器中，并将试管放入微波反应器外部的试管架上。首先，向树脂中加入 3 毫升 DMF 溶剂，在室温下溶胀 15 分钟。确保氮气供应已开启以进行搅拌，且真空阀处于关闭状态。使用氮气供应的针阀使溶液中产生轻微的气泡。15分钟后，关闭氮气阀，打开真空阀，抽除DMF溶剂。当溶剂几乎完全除去时，打开氮气阀。将试管反应容器置于微波反应器外部，关闭真空阀，向试管中直接加入7毫升20%哌啶的DMF溶液或20%吗啉的DMF溶液。打开氮气阀以搅动树脂珠。通过敞口容器衰减器将含有树脂珠的试管插入微波反应器中。使用微波炉的动态模式，将温度目标设为 90 摄氏度，功率设为 50 瓦，保持时间设为两分钟。通过红外传感器监测温度。现在，从微波反应器中取出含有珠粒的试管。吸取DMF溶液时，关闭氮气阀，打开真空阀，抽吸溶液。当溶液即将被吸尽时，打开氮气阀，然后关闭真空阀。加入 3 毫升 DMF 冲洗试管和气体分散管。吸取 DMF 溶剂洗涤液，操作如前所述。手动向试管中的树脂加入 2.5 毫升 FMOC 氨基酸、1.0 毫升 DIC 偶联剂溶液和 Oxyma 添加剂溶液。打开氮气阀以搅动珠子。将装有珠子的试管通过敞口容器衰减器插入微波反应器中。使用微波在动态模式下加热溶液。将温度目标设为100摄氏度，功率设为60瓦，保持时间为10分钟。通过红外传感器监测温度。随后从微波反应器中取出含有微珠的试管，吸除DMF溶剂和反应副产物，操作方法如前所述。关闭真空阀。加入三毫升 DMF 冲洗试管和气体分散管。当溶液几乎完全去除时，打开氮气阀。

an-inexpensive-adaptation-commercial-microwave-reactor-for-solid

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

用于固相肽合成的商用微波反应器的廉价改造

基于非水相、三步放射性化学过程，开发了一种简便的一步法合成 N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟代苯甲酸酯（[18F]SFB）的方法。采用微波加热，整个过程可在30分钟内完成；若进一步通过制备型HPLC纯化，则耗时60分钟。衰变校正后的放射性化学产率（RCY）为35–50%（n &gt;...

微波辅助一锅法合成N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟代苯甲酸酯 ([18F]SFB)

本文描述了一种利用HMBA树脂上“安全捕获”裂解方法高效固相合成功能化双肽三聚体的方案。...

采用“安全捕获”法固相合成功能化双肽

以下方案提供了通过巯基-烯烃光点击反应形成逐步增长型聚乙二醇-多肽水凝胶来包封胰岛β细胞的技术。该材料平台不仅为细胞包封提供了细胞相容性的微环境，还可实现用户可控地快速回收在水凝胶内形成的细胞结构。...

从逐步生长的PEG-肽水凝胶中生成与回收β细胞球体

本视频将演示一种快速高效的方法，用于对聚乙二醇进行甲基丙烯酸酯化，从而实现链式聚合反应和水凝胶的合成。视频还将展示如何将甲基丙烯酰胺官能团引入肽分子中，详细介绍评估官能团化效率的常用分析方法，提供故障排除及高级修饰的建议，并演示典型的水凝胶表征技术。...

微波辅助聚乙二醇和树脂上肽的功能化及其在链式聚合和水凝胶形成中的应用

本文介绍了一种快速的蛋白质酶解消化方案，该方案采用自制的流通式胰蛋白酶微反应器，并与电喷雾电离（ESI）质谱仪联用。文中详细描述了微反应器的制备、实验装置的搭建以及数据采集过程。...

使用流通式微反应器快速酶解蛋白质以进行质谱检测

本文概述了一种利用微波辐射合成环肽的简单且通用的方法。该方法能够在保留侧链和药效团部分的同时，合成具有多种不同构象的骨架环肽，从而可用于筛选生物活性构象。...

利用微波辐射构建骨架环状肽库作为潜在抗寄生虫治疗药物

我们介绍一种利用光诱导的硫醇-烯/硫醇-炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽的实验方案。...

通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。...

1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

杂芳基化合物是有机合成、药物化学和生物化学中重要的分子。利用钯催化进行微波辅助的杂芳基化反应，可提供一种将杂芳基直接连接到酮类底物上的快速高效方法。...

微波辅助下利用过渡金属催化的酮类化合物直接杂芳基化反应

本文介绍了一种合成信息编码的肽模拟寡聚物的方案，并利用胺类和醛类作为动态共价反应对，以及路易斯酸性稀土金属三氟甲磺酸盐作为多功能试剂，指导这些肽模拟物进行序列定向的自组装，形成分子梯状结构。...

信息承载型肽模拟物的合成及其序列导向的动态共价自组装

了解如何利用廉价改造的商用微波反应器进行固相肽合成，成功制备空间位阻氨基酸寡聚体。该方法为小型学术实验室提供了经济可行的微波辅助化学合成解决方案。

一种用于固相多肽合成的商用微波反应器的低成本改装方案

探索更多视频