Name: α-突触核蛋白聚集体的鼻内给药技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: 学习α-突触核蛋白聚集体的鼻内给药技术，用于研究帕金森病中病理蛋白从嗅黏膜向嗅球的传播机制。该方法利用小鼠模型，为理解疾病进展提供非手术研究手段。

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所有实验均由Rie Hikawa提供支持。我们感谢松泽保子在文书工作方面的协助。本研究得到了日本学术振兴会科学研究费补助金（M.S.，编号JP19K23779、JP20K16493和JP20H00663）的资助。

本研究使用了2月龄的C57BL/6J雄性小鼠。所有实验操作均按照国家指导原则进行。京都大学动物研究委员会已批准本研究的伦理审查并授予许可（MedKyo 23,544）。
1. α-突触核蛋白预制纤维的鼻内给药
<ol>
	<li>根据先前报道的方法在 PBS 中制备小鼠 α-突触核蛋白（α-Syn）纤维溶液（4 mg/mL）11。用透明薄膜包裹管子以防止污染。</li>
	<li>使用水浴式超声仪（材料表）对 200 µL 的 α-Syn 纤维溶液进行超声处理，以生成预先形成的 α-Syn 纤维（PFFs）。在超声水浴中加入水并放入冰块，冷却至 4 °C 后进行超声处理。总超声时间为 5 分钟，每次循环包括 30 秒超声和 30 秒间歇（共五个循环）。 
	注意：请佩戴个人防护装备，如一次性手套、口罩和护目镜，以避免接触 α-Syn。</li>
	<li>准备一支 P10 移液器（材料表）并装上 10 µL 吸头。通过腹腔（i.p.）注射使用盐酸美托咪啶、咪达唑仑和布托啡诺（MMB）混合物对每只小鼠进行麻醉。MMB 麻醉剂包含咪达唑仑（0.3 mg/kg）、美托咪啶（4 mg/kg）和酒石酸布托啡诺（5 mg/kg）。当混合咪达唑仑（1 mg/mL）0.3 mL、美托咪啶（5 mg/mL）0.8 mL、酒石酸布托啡诺（5 mg/mL）1 mL 和生理盐水 2.9 mL 时，按 0.005 mL/g 的剂量进行腹腔注射。</li>
	<li>等待 10 分钟，确保小鼠完全麻醉。若小鼠呈侧卧位且无法自行翻正，则表明麻醉充分。麻醉成功后，使用无菌棉签涂抹眼膏，防止眼睛干燥。 
	注意：若不进行麻醉，在鼻腔给药过程中难以保持小鼠仰卧姿势，且小鼠会频繁打喷嚏，导致 α-Syn 溶液无法正确给药。因此，必须进行镇静处理。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并在其身体下方垫上纸巾或其他类似材料，确保头部略微向下倾斜（图 1A、B）。此体位可防止给药的 α-Syn 溶液迅速流入肺部或食道，有助于其在鼻腔内滞留。图 1C 显示了小鼠鼻孔的位置。</li>
	<li>用 P10 移液器吸取 1 µL 的 α-Syn 溶液（4 mg/mL），并将移液器吸头靠近小鼠鼻部。缓慢形成一个圆形液滴，并使其保持在吸头末端（图 1D，红色箭头）。鼻腔给药仅对单侧鼻孔进行，另一侧作为对照。</li>
	<li>将液滴靠近小鼠一侧鼻孔，让小鼠自然吸入。观察吸入过程，并等待 30 秒至 1 分钟（图 1E）。</li>
	<li>重复步骤 1.6–1.7，直至总共给予 20 µL 的 α-Syn 溶液。所有操作完成后，丢弃手套，并使用市售清洁剂擦拭实验台面，以防 α-Syn 污染表面。 
	注意：整个操作应在生物安全柜中进行，以防止操作人员吸入 α-Syn 纤维。先前有研究显示，25 µL 是鼻腔至脑部药物递送最有效的体积18。本研究采用相近的 20 µL 体积。此外，我们使用的 PFFs 浓度与之前报道中注射至嗅球（OB）的浓度相同10，接近 400 µM（5.6 mg/mL）的 PFFs 浓度19。</li>
	<li>通过腹腔注射给予阿替美唑（3 mg/kg；材料表）以逆转美托咪啶的作用，促进小鼠恢复。当混合阿替美唑（5 mg/mL）0.6 mL 和生理盐水 4.4 mL 时，按 0.005 mL/g 的剂量进行腹腔注射。 
	注意：应提供镇痛处理，因为目前尚不明确鼻腔给予 α-Syn 对小鼠造成的应激程度。</li>
	<li>在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开无人看护。待其完全恢复后，将小鼠放回笼中。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>在鼻内给予α-Syn预制纤维后1、3、6和12个月，处死处理过的小鼠。
	<ol>
		<li>将小鼠放入诱导箱中，给予七氟烷（&#62;6.5%），持续至呼吸停止超过&#62;60秒。取出小鼠，并通过右心房切开迅速放血，以确保安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将25G针头（材料表）插入心脏心尖部位。以4 mL/min的速度用15 mL PBS灌注小鼠，随后用15 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS进行灌注。</li>
	<li>用剪刀剪下头部，并用手术刀在头皮上做一个约2 cm的切口。从底部向鼻部方向，用剪刀在颅骨侧面剪开颅骨（图2A，B）。为获取嗅球（OBs），需完全去除覆盖在嗅球区域的颅骨（图2B，黄色圆圈）。</li>
	<li>将头部翻转，切断脑神经，然后用镊子小心取出脑组织（图2C，D）。获取带有完整嗅球的脑组织（图2E）。为获得完整的嗅球，需用镊子小心剪断连接嗅球与颅骨的嗅神经（图2D，黄色圆圈）。</li>
	<li>将脑组织样本置于含4% PFA的PBS中，于4 °C过夜固定。脑组织样本固定时间不得超过24小时。 
	注意：过度固定会降低免疫组织化学染色效果。如需长期保存，应将脑组织样本置于70%乙醇或含0.1%叠氮化钠的PBS中，以维持无菌状态。</li>
</ol>
3. 嗅球的免疫组织化学染色
<ol>
	<li>使用自动组织处理机（材料表）按照以下方法对样品进行石蜡包埋。
	<ol>
		<li>先在70%乙醇中浸润120分钟，随后在100%乙醇中浸润8次，每次60分钟。然后在100%二甲苯中浸润3次，每次120分钟。</li>
		<li>在60 °C的石蜡中浸润120分钟，随后在60 °C的石蜡中再次浸润240分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下方法将样品包埋于石蜡中。
	<ol>
		<li>使用模块化组织包埋中心（材料表）在60 °C条件下将样品包埋于石蜡中，并在冰上冷却。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用切片机（材料表）将样品切成8 µm厚的切片18。</li>
	<li>按照以下方法进行脱蜡处理。
	<ol>
		<li>在100%二甲苯中浸润2次，每次5分钟，随后在100%乙醇中浸润2次，每次3分钟。</li>
		<li>在70%乙醇中浸润3分钟，在PBS中洗涤3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下方法进行抗原修复。
	<ol>
		<li>在100%甲酸中浸润15分钟，在磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗2分钟。</li>
		<li>在120 °C下高压灭菌10分钟，随后自然冷却。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含1%过氧化氢的甲醇溶液中浸润10分钟，在PBS中洗涤5分钟。</li>
	<li>在载玻片上加入500 µL含5%脱脂奶粉的PBS溶液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>在载玻片上加入500 µL抗磷酸化α-突触核蛋白抗体（p-α-Syn，1/10000）的PBS溶液，4 °C孵育过夜。用PBS洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>在25 °C下用通用免疫过氧化物酶聚合物（抗兔，材料表）孵育1小时。用PBS洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色试剂盒（材料表）显色5分钟。</li>
	<li>在苏木精溶液中浸润1分钟（材料表）。在流动水中分化10分钟。</li>
	<li>按照以下方法进行封片。
	<ol>
		<li>在70%乙醇中浸润5分钟。在100%乙醇中浸润2次，每次5分钟。</li>
		<li>在100%二甲苯中浸润2次，每次5分钟。使用封片介质（材料表）封片。向载玻片上滴加100 µL封片介质，并加盖盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一体化显微镜在20倍和40倍放大倍数下采集图像（材料表）。</li>
</ol>

&#945;-Synuclein Propagation: Intranasal Administration in Parkinson&#39;s Disease

<ol><li>Tysnes, O. B., Storstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Parkinson's disease.</a> J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

在之前的一项研究中，将α-Syn聚集体注入猕猴的鼻腔后，虽未观察到α-Syn聚集体本身，但可诱导黑质中多巴胺能细胞死亡及铁沉积21。据报道，连续28天每日将A53T人源α-Syn聚集体注入朊病毒启动子驱动的α-Syn转基因小鼠（M83小鼠）鼻腔，可诱导小鼠脑内出现α-Syn病理改变并产生运动症状19,22。在本研究中，我们证明单次给予野生型小鼠鼻腔α-Syn聚集体即可诱导嗅球（OB）中出现α-Syn病理改变。这一简单方法可能对研究α-Syn从鼻黏膜向嗅球传播具有重要价值。
在此方法中，α-突触核蛋白（α-Syn）纤维的充分超声处理至关重要，因为先前的研究表明，较小尺寸的α-Syn聚集体在诱导α-Syn病理方面效率最高23,24。若α-Syn纤维超声处理不足，将导致嗅球（OB）中α-Syn传播极少。由于不同超声仪的超声功率存在差异，因此有必要对该过程进行优化。在将α-Syn溶液滴入小鼠鼻孔时，保持小鼠仰卧体位也十分关键。若小鼠头部抬高，α-Syn溶液将流入肺部和食道。体位不当可能导致意外死亡或α-Syn传播不足。
在本研究中，i.p. 采用 MMB 复合麻醉剂进行麻醉。据报道，MMB 复合麻醉可提供良好的镇静和镇痛效果，且其作用可通过阿替美唑迅速逆转23。由于吸入麻醉需要使用面罩覆盖鼻部以维持麻醉状态，因此更难以进行鼻内给予 α-Syn 溶液。此外，鱼藤酮模型已被广泛研究，是一种非常有用的模型25。然而，它是一种药物诱导模型，其发病机制可能与特发性帕金森病（iPD）不同25。由于该模型可诱导 α-Syn 的传播，我们认为它更接近于 iPD。
我们的研究还表明，外源性α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体可通过鼻黏膜传播。因此，研究人员在使用α-Syn聚集体进行实验时，应采取预防措施，避免吸入α-Syn聚集体。例如，超声处理步骤中可能产生α-Syn气溶胶。我们建议使用密封型超声仪，或在生物安全柜内进行超声处理。此外，小鼠可能会打喷嚏，从而潜在地产生α-Syn气溶胶。为降低此类风险，所有操作均应在生物安全柜内进行。同时，研究人员应佩戴个人防护装备，如一次性手套、口罩和护目镜，以防止接触α-Syn。所有实验操作结束后，若实验台表面被α-Syn污染，研究人员需使用市售洗涤剂擦拭台面。既往研究报道，市售洗涤剂和SDS均可有效清除污染表面的聚集体26,27。
本研究采用石蜡切片评估嗅球（OB）中的α-突触核蛋白（α-Syn）病理变化，因为与冰冻切片相比，石蜡切片能更好地保存嗅球这一微小结构。研究结果显示，嗅球中出现了α-Syn病理改变；然而，所观察到的α-Syn病理变化较轻微且局限，主要表现为嗅小球内呈线状聚集的Lewy神经突（Lewy neurites）。
需要注意的是，本研究中未观察到实验小鼠出现明显的行为学改变。该方法诱导的α-突触核蛋白病理变化可能不足以引起行为表型的改变。需要进一步研究以阐明导致严重病理变化和行为改变的具体条件。未来，如果我们能够建立一种从鼻黏膜向嗅球更高效传播的方法，这种简单的方法将为评估α-突触核蛋白传播提供一种无需手术技术的替代方案。
 此外，我们在治疗小鼠的对侧嗅球（OB）中也使用了对照。然而，在更长期的随访中，可能会发生从前嗅核或梨状皮层向对侧OB的逆行性传播。在这种情况下，使用未经治疗的小鼠作为对照。
尽管这种简单的方法为α-突触核蛋白从鼻黏膜向嗅球传播提供了有价值的见解，但仍需进一步研究以全面理解帕金森病的潜在机制。

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是第二常见的神经退行性疾病，其特征为运动症状，如运动迟缓、静止性震颤和肌肉僵直1。PD 还表现为非运动症状，包括嗅觉功能障碍、认知损害、抑郁、幻觉、便秘和直立性低血压。其病理特征为黑质中多巴胺能神经元的死亡以及α-突触核蛋白（α-synuclein, α-Syn）聚集形成的路易小体（Lewy bodies）2。
值得注意的是，α-Syn 是一种由 140 个氨基酸组成的蛋白质，在正常情况下以可溶性单体（或四聚体）的形式存在。然而，在异常条件下，可溶性单体会转化为不溶性的高分子量聚集体，包括寡聚体和纤维。据报道，α-Syn 向寡聚体和纤维的转变与细胞毒性相关3。
近期研究表明，α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体可在神经元之间以类朊病毒的方式传播。基于大量尸检研究，Braak 等人于2003年提出假说，认为路易小体病理以某种相对刻板的模式在脑内进行渐进性扩散（Braak假说）4,5。2008年，对接受胎儿中脑移植的帕金森病（PD）患者进行尸检发现，来源于胎儿组织的多巴胺能神经元中出现了路易小体6,7。这些研究提示，α-Syn聚集体可从病变脑组织传播至移植组织，从而支持了Braak假说。
基于这些观察结果，利用原代神经元培养和将α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体注射入小鼠脑内的实验，成功再现了类似路易小体聚集体的扩散现象，进一步提供了α-Syn以类似朊病毒方式传播的证据8,9。
Braak 等人表明，帕金森病（PD）中的路易体病理变化起始于嗅球（OB）和/或迷走神经背核（dmX）4。根据 Braak 的假说，已有若干研究报道将来自 PD 患者脑组织的 α-Syn 聚集体或路易体提取物注射至实验动物的嗅球和胃肠道中10,11,12。2018 年的一项研究证实，将 α-Syn 聚集体注入野生型小鼠的嗅球可诱导 α-Syn 病理沿嗅觉通路传播，并导致嗅觉功能障碍13。我们先前将 α-Syn 聚集体接种至 α-Syn 转基因小鼠的嗅球中，发现这会引起海马萎缩及记忆功能损害14。
2022年，我们将α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体接种到一种小型非人灵长类动物——狨猴的嗅球（OB）中，结果导致α-Syn病理沿嗅觉通路传播、嗅球萎缩以及广泛的脑部葡萄糖代谢减低10。
然而，如果α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体从嗅球（OB）开始传播，就会引发一个关键问题：α-Syn聚集体最初是通过何种机制出现的？Saito等人先前报道了在鼻黏膜中存在路易小体15。通过实时震荡诱导转化（RT-QUIC）分析，在帕金森病（PD）和多系统萎缩（MSA）患者的鼻黏膜中检测到了α-Syn聚集体的存在16。值得注意的是，对快速眼动睡眠行为障碍（RBD）患者鼻黏膜样本的分析显示α-Syn水平升高，而RBD被认为是PD的前驱阶段17。该研究提示，α-Syn病理可能早在PD的前驱期就已存在于鼻黏膜中。
尽管这些发现提示了从鼻黏膜到嗅球的潜在通路，但支持这一假设的实验依据仍然有限。为弥补这一空白，我们将α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体注入小鼠鼻腔，研究α-Syn病理从鼻黏膜向嗅球的传播。实验结果表明，在野生型小鼠中单次经鼻给予α-Syn聚集体可诱导嗅球中出现α-Syn病理，为从鼻黏膜到嗅球的传播通路提供了实验依据。

<table><tbody><tr><td>一体化荧光显微镜 BZ-X710</td><td>KEYENCE</td><td>N/A</td><td>一体化显微镜</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Nacalai tesque</td><td>02739-32</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor II</td><td>Sonicbio</td><td>BR2006A</td><td>水浴式超声破碎仪</td></tr><tr><td>酒石酸布托啡诺</td><td>明治制药</td><td>WAK-52850</td><td></td></tr><tr><td>纤维素管</td><td>MISUMI</td><td>UC20-32-100</td><td></td></tr><tr><td>DeepWellMaximizer</td><td>TAITEC</td><td>MBR-022UP</td><td>摇床</td></tr><tr><td>DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)</td><td>BioDynamics Laboratory Inc.</td><td>DS255</td><td>感受态细胞</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107961</td><td>显微镜快速封片剂</td></tr><tr><td>Graefe 超细镊子 弯齿型</td><td>FST</td><td>11152-10&amp;nbsp;</td><td>镊子</td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>剪刀</td></tr><tr><td>Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)</td><td>日清医工</td><td>414341</td><td>通用免疫过氧化物酶聚合物，抗兔抗体</td></tr><tr><td>ImageJ 版本 1.52p</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/</td></tr><tr><td>innova4200</td><td>New Brunswick scientific</td><td>9105085</td><td>恒温摇床</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Nacalai tesque</td><td>19742-94</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基，Lennox 型</td><td>Nacalai tesque</td><td>20066-24</td><td></td></tr><tr><td>Leica EG 1150 H</td><td>Leica</td><td>14 0388 86 108</td><td>模块化组织包埋中心</td></tr><tr><td>Leica TP 1020</td><td>Leica</td><td>14 0422 85108</td><td>全自动组织脱水机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Fuji Film</td><td>135-17473</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM325 旋转式切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>902100</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>丸石制药</td><td>4987-211-76210-0</td><td></td></tr><tr><td>新型G型苏木精染液</td><td>武藤化学</td><td>65-9197-38</td><td>苏木精溶液</td></tr><tr><td>新型静脉穿刺带翼针头 D型，25G</td><td>TERUMO</td><td>NN2332R</td><td>25G 针头</td></tr><tr><td>Optima TLX 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1197</td><td>超速离心机</td></tr><tr><td>P10 移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10002P</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Leica</td><td>39601095</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Nacalai tesque</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>过氧化物酶DAB染色试剂盒</td><td>Nacalai tesque</td><td>25985-50</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>BCA 法蛋白定量</td></tr><tr><td>pRK172</td><td>Addgene</td><td>#134504</td><td>质粒</td></tr><tr><td>Q-Sepharose Fast Flow.&amp;nbsp;</td><td>cytiva</td><td>17051001</td><td>离子交换树脂</td></tr></tbody></table>

α-突触核蛋白聚集体鼻内给药技术

Technique for Intranasal Administration of &#945;-Synuclein Aggregates

帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是存在路易小体，即α-突触核蛋白（α-Syn）的聚集物。最近有研究提出，该疾病通过α-Syn聚集物从嗅球（OB）或迷走神经背核以类朊病毒方式传播而发生和发展。尽管OB中α-Syn聚集物的来源尚不明确，但最近有研究提示其可能从嗅黏膜传播而来。我们先前在小鼠模型中证实，鼻内给予α-Syn聚集物可诱导小鼠OB中出现α-Syn病理改变。在本研究中，我们介绍了一种可诱导小鼠OB中α-Syn病理改变的α-Syn聚集物鼻内给药方法。该方法操作极为简便直接，我们相信它将成为阐明OB中α-Syn病理起源及α-Syn经嗅觉系统传播通路研究中的有力工具。

图3 展示了嗅球（OB）中α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体的多个示例。在本研究中，我们将α-Syn聚集体注入单侧鼻腔。两个鼻腔由鼻中隔分隔，每个嗅球分别将嗅觉感觉神经元投射至对应的鼻腔。因此，对侧的嗅球可作为对照。
在治疗侧的嗅球中，给药后1个月和3个月均未观察到磷酸化α-突触核蛋白（P-α-Syn）病理改变（图3A、B）。给药后6个月和12个月，在治疗侧嗅球的嗅小球层中观察到类似路易神经突的磷酸化α-突触核蛋白聚集物（图3C、D、F、G）。在对照侧的嗅球中未观察到此类聚集物（图3E）。
我们可以通过计数α-Syn聚集体或使用ImageJ（材料表）检测其大小等参数来评估α-Syn病理变化。例如，我们此前已在该模型中计数并报道了α-Syn聚集体的数量20。在处理侧的嗅球（OB）中，类Lewy neurite样聚集体在12个月内显著增加（单因素方差分析，随后进行Dunnett检验，p &lt; 0.01；图3H）。而在对照侧的嗅球中，α-Syn聚集体极少。
先前的一项研究表明，注射到小鼠脑内的PFFs在一周内被降解，同时内源性小鼠α-Syn被转化为α-Syn聚集体19。在本研究中，随着时间推移α-Syn病理的增加表明，通过单次鼻内给予PFFs，内源性小鼠α-Syn已转化为α-Syn聚集体。这些结果表明，α-Syn病理可从嗅觉黏膜传播至嗅球（OB）。
<img alt="将α-突触核蛋白聚集体递送至小鼠大脑的实验装置与示意图，用于神经学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66943/66943fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠鼻腔给药方法。（A）将小鼠置于仰卧位，头部略微向下倾斜。（B）小鼠的鼻孔以黄色箭头标出。（C, D）将α-突触核蛋白纤维溶液滴入小鼠鼻孔（C，红色箭头），并迅速吸入（D，红色箭头）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66943/66943fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="逐步解剖嗅球的过程，解剖学示意图，神经科学研究方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66943/66943fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：获取完整嗅球的操作步骤示意图。（A）使用剪刀沿矢状面和侧面剪开颅骨（黄色虚线）。（B）完全移除覆盖在嗅球（OBs）上的颅骨。（C）将头部翻转，小心取出脑组织，切断脑神经。（D）切断附着在颅骨上的嗅神经。（E）带有完整嗅球的全脑标本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66943/66943fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡分析；组织切片，治疗组/对照组中的Lewy神经突，显微镜观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66943/66943fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：嗅球小球区域中的磷酸化α-突触核蛋白（P-α-Syn）聚集物。（A-G）嗅球（OB）在经鼻给药后不同时间点的磷酸化α-突触核蛋白（P-α-Syn，EP1536Y）免疫组织化学染色结果，其中（A-D）为给药侧分别在1、3、6和12个月（1 m、3 m、6 m和12 m）的结果，（E）为对照侧在经鼻给药后12个月的结果。（C, D）类似Lewy神经突的丝状α-Syn聚集物出现在小球周围。（F, G）放大图像分别为经鼻给药后6个月和12个月时Lewy神经突样p-α-Syn的高倍镜图像。（H）嗅球给药侧与对照侧Lewy神经突样p-α-Syn沉积量的比较（n = 4–5）。图中数据以均值±标准误表示。采用单因素方差分析，随后进行Dunnett's检验；**&lt;0.01。该图改编自先前的报道20。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66943/66943fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>

本方案描述了一种鼻内给予α-突触核蛋白聚集体的方法。该方法有助于研究帕金森病中α-突触核蛋白从嗅黏膜向嗅球的传播过程。

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种神经退行性疾病，其特征是存在路易小体，即α-synuclein的聚集物……

帕金森病被认为通过α-突触核蛋白聚集体的类朊病毒样传播而发生和发展。在本研究中，我们试图探讨帕金森病中α-突触核蛋白病理在嗅球的起源。最近，人们认为α-突触核蛋白病理以类朊病毒的方式进行传播，起始于嗅球或迷走神经背核。尽管嗅球中α-突触核蛋白聚集体的起源尚不明确，但最近的研究表明，其传播可能源自嗅黏膜。我们发现，在小鼠模型中通过另一种途径给予α-突触核蛋白聚集体可诱导嗅球出现α-突触核蛋白病理改变。该简单方法为评估α-突触核蛋白从嗅黏膜向嗅球传播提供了无需手术技术的新途径。鼻内给予α-突触核蛋白聚集体是一种非常简单直接的方法。首先，穿戴个人防护装备，例如一次性手套、口罩和护目镜。用磷酸盐缓冲液（PBS）配制浓度为4毫克/毫升的小鼠α-突触核蛋白纤维溶液，并用透明薄膜包裹试管以防止污染。然后，将超声破碎仪的超声水浴中加水，并加入冰块将其冷却至四摄氏度。取200微升纤维溶液进行超声处理，以生成α-突触核蛋白预形成的纤维，持续超声五分钟。将麻醉后的小鼠仰卧置于纸巾上，头部略微向下倾斜。接下来，用P10移液器吸取1 µL浓度为4 mg/mL的α-突触核蛋白溶液，并将移液器吸头靠近小鼠鼻部，使液体在吸头末端形成一个圆滴。随后，将溶液经鼻单侧给予小鼠。等待30秒至1分钟，让小鼠自然吸入该溶液。重复此步骤，直至给予20微升α-突触核蛋白。给予α-突触核蛋白后，若溶液发生任何污染，需使用市售洗涤剂清洁操作台，并丢弃手套；随后以3毫克/千克剂量通过腹腔注射给予阿替美唑，以促进小鼠恢复。待小鼠完全恢复后，将其放回笼中。首先，通过鼻内途径向小鼠给予α-突触核蛋白预制纤维。处死小鼠后，用手术刀在头皮上做一个两厘米长的切口。使用剪刀从颅骨基部向鼻部方向侧向剪开颅骨。为获取嗅球，需完全去除覆盖在嗅球上的颅骨，然后将头部翻转并切断脑神经。用镊子小心取出脑组织，保持嗅球完整。为保留嗅球，应在其与颅骨连接处小心切断嗅神经。将脑组织样本置于用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛中，于 4°C 下保存过夜。在处理侧的嗅球中，经三个月后未观察到 α-突触核蛋白病理变化，但在六个月和十二个月后，在处理侧的肾小球中可见类似路易神经突的磷酸化 α-突触核蛋白聚集物。在对照侧的嗅球中则未见此类聚集物。在治疗侧，12个月内嗅球中类似路易小体的α-突触核蛋白聚集物数量显著增加，而对照侧此类聚集物极少。

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α-突触核蛋白聚集体鼻内给药技术

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