AAV 系统和小鼠模型，用于研究缺血性卒中后亚急性和慢性转导细胞中 Neurod1 的异位表达

我们正在探索 AAV 介导的神经源性转录因子异位表达作为缺血性卒中的潜在治疗方法。我们的重点是查看中风后亚急性和慢性期表达 GFAP 细胞中 Neurod1 的表达是否会增加转导的神经元并与运动功能的改善相关。最近的研究结果表明，具有相同 AAV 的皮层中的基因表达因区域而异我们的研究发现，GFAP 启动子在内侧前额叶皮层中比在运动皮层中更活跃，这表明转导的细胞对特定启动子的反应不同。

因此，涉及神经源性转录因子的治疗应针对目标大脑区域进行调整。目前的挑战包括由于 ET-1 的注射速率和脑区之间的转导效率等变量而导致的卒中病灶大小的变化。跨脑区和小鼠品系的 AAV 滴度和趋向性会影响转导效率，从而影响中风后异位 Neurod1 表达的细胞评估。

将星形胶质细胞转化为神经元的主要挑战是区分重编程的神经元和预先存在的神经元。我们的实验室旨在通过开发新工具来确认这种重编程发生在体内。最终，我们试图了解神经元转录因子的异位表达如何促进脑损伤动物的恢复。

首先，从腔室中取出麻醉的动物并将其放在干净的表面上。清洁鼠标的手术区域后，将其鼻子放入立体定位鼻锥中，并使用耳杆稳定颅骨。使用 10 号手术刀刀片，从眼睛中点后面到顶骨，平行于矢状面做一个垂直切口。

然后，轻轻缩回皮肤以露出头骨。接下来，使用棉签破坏颅骨上的筋膜，让颅骨干燥以完全暴露前囟。使用高速立体定位钻，在右侧感觉运动皮层的坐标处钻三个毛孔。

然后，用配备 26 英寸长针头的 0.375 号注射器更换钻头。将 1.5 微升溶解在无菌 PBS 中的 400 微摩尔内皮素-1 溶液装入注射器中。释放少量内皮素-1 以观察针尖的液滴，确保良好的流动。

将针尖穿过颅骨降低到中间的毛刺孔中，而不刺穿硬脑膜。对齐后，将针头降低到大脑中 1 毫米。使用 Hamilton 注射器，一次分配 0.1 μL，并等待 1 分钟后再注射下一个 0.1 μL。

为防止针头在注射之间和注射后堵塞，释放少量内皮素-1，直到针尖出现一滴。注射前使用无菌棉签擦去多余的内皮素-1。最后，使用 4-0 无菌缝合线缝合颅骨上覆盖的皮肤以闭合伤口。

麻醉内皮素 1 处理的小鼠后，将小鼠转移到立体定位框架上。使用手术剪刀剪断伤口上的缝合线。用镊子去除结痂并缩回皮肤以露出颅骨。

然后，使用无菌棉签擦干颅骨表面并找到毛刺孔。设置立体定位装置的机械臂。放置一个带有 26 号注射器的针头支架，针头长度为 0.375 英寸。

现在，将 3.4 μL AAV 溶液装入注射器中。将针尖降低穿过颅骨，进入第一个最前面的毛刺孔。确保针头不会刺穿硬脑膜，然后以 1 毫米的速度降低到大脑中。

使用 Hamilton 注射器，一次分配 0.1 μL 注入 1 μL AAV 溶液，如前所述。然后使用 4-0 Polysorb 聚酯缝合线缝合颅骨上的覆盖皮肤以闭合伤口。将鼠标从立体定位框架上取下，并将其转移到恢复区干净、预热的动物笼子中。