Name: 基于多孔底物的电穿孔与跨上皮电阻抗监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 了解多孔底物电穿孔技术，结合跨上皮电阻抗监测方法，用于优化细胞递送效率并维持高细胞存活率。该技术为神经科学与细胞生物学研究提供了重要的实时分析工具。

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感谢美国国家科学基金会（NSF，资助编号：1826135、1936065、2143997）、美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH National Institutes of General Medical Sciences，资助编号：P20GM113126，内布拉斯加生物分子整合通讯中心，以及资助编号：P30GM127200，内布拉斯加纳米医学中心）、内布拉斯加协作倡议（Nebraska Collaborative Initiative）以及Voelte-Keegan生物工程支持项目的资金支持。本研究中的设备在纳米工程研究核心设施（NanoEngineering Research Core Facility, NERCF）制造，该设施部分由内布拉斯加研究倡议（Nebraska Research Initiative）资助。

本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。
1. 试剂准备与细胞培养
<ol>
	<li>在500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素，配制细胞培养基。分装成十一份各50 mL的等分试样，以降低污染风险，并于4 °C下冷藏保存。</li>
	<li>根据制造商说明书，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制1 mL浓度为25 µg/mL的人血浆纤连蛋白储备液。</li>
	<li>用DMEM配制15 mL浓度为0.1 mg/mL的碘化丙啶储备液，以便进行不同载荷浓度的实验。</li>
	<li>将A431细胞培养于含有12 mL上述制备的细胞培养基的T75培养瓶中。每1–2天传代一次，以维持50%的汇合度。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>纤连蛋白包被
	<ol>
		<li>选取十二个插入式培养小室和两个24孔板。将插入式培养小室放入一个24孔板中，排列成两行，每行六个。将第二个24孔板暂置一旁，待后续使用。</li>
		<li>在1.5 mL离心管中，将52 µL纤连蛋白储备液与1,248 µL PBS混合，配制1,300 µL浓度为1 µg/mL的纤连蛋白溶液。</li>
		<li>向每个插入式培养小室中加入100 µL纤连蛋白溶液。将24孔板置于37 °C培养箱中孵育3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整细胞浓度以获得优化的细胞密度
	<ol>
		<li>在纤连蛋白孵育结束前约1小时，从培养箱中取出A431细胞的T75培养瓶，准备进行细胞收集。</li>
		<li>用移液器吸除培养瓶中的培养基，并用5 mL PBS清洗。同样方式吸除PBS，然后加入3 mL胰蛋白酶。孵育3–4分钟，轻敲培养瓶侧壁以完全解离细胞。</li>
		<li>向培养瓶中加入6 mL细胞培养基，用移液器剧烈吹打以解离残留细胞，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。在100 × g 和20 °C条件下离心5分钟。</li>
		<li>用移液器小心吸除离心管中的细胞培养基和胰蛋白酶，注意不要扰动细胞沉淀。向离心管中加入1 mL培养基，用移液器反复吹打（避免产生气泡）以打散细胞沉淀并重悬细胞。</li>
		<li>在200 µL离心管中，用移液器加入10 µL细胞悬液、40 µL细胞培养基和50 µL台盼蓝染液，充分混匀。</li>
		<li>吸取10 µL染色混合液，注入血细胞计数板中。利用染色混合液的10%稀释比例，计数细胞并估算15 mL离心管中的总细胞数。 
		注：本实验方案中，假设细胞浓度为5,000,000 个细胞/mL。</li>
		<li>将目标接种密度乘以插入式培养小室膜的表面积，再除以细胞悬液中计数所得的细胞数/mL，然后乘以1,000，计算出每个插入式培养小室所需的细胞悬液体积（µL）。
	<ol>
		<li>为计算所需细胞悬液的总体积，将上述数值乘以10（确保足够用于9个样本，因12个插入式培养小室中有3个为空白对照），并将结果向上取整至最接近的整数。本例中，本实验共需135 µL细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
		<li>在另一个15 mL离心管中，将先前计算所得的135 µL细胞悬液与1,865 µL细胞培养基混合，配制2,000 µL调整后的细胞溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种细胞
	<ol>
		<li>纤连蛋白孵育完成后，吸除每个插入式培养小室中多余的纤连蛋白溶液。</li>
		<li>向每个插入式培养小室中加入100 µL无菌去离子水，清洗两次。按照加入顺序依次吸除水，以确保各小室清洗时间一致。</li>
		<li>再次向每个插入式培养小室中加入100 µL细胞培养基进行清洗。同样按照加入顺序依次吸除培养基，以确保各小室清洗时间一致。</li>
		<li>细胞样本插入式培养小室
	<ol>
		<li>用移液器向每个插入式培养小室中加入200 µL调整后的细胞溶液。为确保各小室细胞汇合度一致，在分配前需先在离心管中混匀细胞溶液，分配后再次在每个小室中轻轻吹打混匀。</li>
	</ol>
	</li>
		<li>阴性对照插入式培养小室
	<ol>
		<li>向每个插入式培养小室中加入200 µL细胞培养基。为保持与细胞样本组的一致性，用移液器在每个小室中轻轻吹打混匀细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记与孵育
	<ol>
		<li>使用永久性记号笔在第二个24孔板上画线，将其划分为两列，每列三孔宽（用于设置三重复实验条件），并将每列再划分为若干行。在网格的每个区域标注相应的实验参数。</li>
		<li>向每个将要放置插入式培养小室的孔中加入1 mL细胞培养基。将插入式培养小室从准备用的24孔板转移至标记好的实验用24孔板的相应位置，并在37 °C下孵育至少12小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 实验步骤
<ol>
	<li>递送实验
	<ol>
		<li>将1.5 mL的0.1 mg/mL PI溶液移液至电极阵列的每个孔中。将插入物放入电极阵列的每个孔内，将插入物的脚部嵌入对齐凹槽中，使插入物与孔的上表面齐平（图1A，B）。</li>
		<li>将顶部电极印刷电路板（PCB）旋紧至电极阵列孔的顶部，并将电极阵列连接至PSEP设备。</li>
		<li>将电极阵列置于37 °C培养箱中至少1小时，以使温度达到平衡。</li>
		<li>单击图形用户界面（GUI）左上角&#34;膜&#34;旁边的下拉菜单，然后单击400 nm GBO。对&#34;电解质&#34;、&#34;细胞&#34;、&#34;细胞接种密度&#34;和&#34;细胞持续时间&#34;重复此步骤，分别选择DMEM、A431、200和12。 
		注：这些值仅用于记录目的，不影响设备功能。请根据需要调整这些值以确保数据追踪的准确性。</li>
		<li>在GUI右侧的脉冲后时间持续时间（min）编辑框中输入1，将默认的脉冲后测量时间更改为1分钟。其余所有设置保持默认状态。 
		注：默认脉冲参数生成一个具有30伏电压、20 Hz频率、1 ms持续时间和200个脉冲的方波形。默认TEEI测量参数为0.5伏电压，以及100 Hz、1,000 Hz、10,000 Hz和100,000 Hz的频率。</li>
		<li>单击运行按钮，并在提示时为1-3号孔和4-6号孔输入适当的名称。单击确定以开始实验。</li>
		<li>程序执行完毕后，将电极阵列从培养箱中取出，并将插入物转移回实验孔板中的原始位置。</li>
		<li>在200 µL离心管中，将2 µL Hoechst 33342和5 µL钙黄绿素AM与123 µL细胞培养基混合。</li>
		<li>轻轻将10 µL染色液移液至每个脉冲后的插入物中，并将插入物放回培养箱中孵育5分钟。</li>
		<li>将孔板转移至配备5倍放大物镜的荧光显微镜的板架上。使用明场及各染料的荧光进行成像。在触发相机前，将插入物中心对准物镜。 
		注：PI、钙黄绿素AM和Hoechst 33342的激发波长分别为558 nm、495 nm和353 nm。发射波长分别为575 nm、519 nm和465 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TEEI测量实验
	<ol>
		<li>将1.5 mL细胞培养基移液至电极阵列的每个孔中。将细胞样本插入物放入1-3号孔，对照插入物放入4-6号孔，将插入物的脚部嵌入对齐凹槽中，使插入物与孔的上表面齐平。</li>
		<li>将顶部电极PCB旋紧至电极阵列孔的顶部，并将电极阵列连接至PSEP设备。</li>
		<li>将电极阵列置于37 °C培养箱中至少1小时，以使温度达到平衡。</li>
		<li>单击图形用户界面（GUI）左上角&#34;膜&#34;旁边的下拉菜单，然后单击400 nm GBO。对&#34;电解质&#34;、&#34;细胞&#34;、&#34;细胞接种密度&#34;和&#34;细胞持续时间&#34;重复此步骤，分别选择DMEM、A431、200和12。 
		注：这些值仅用于记录目的，不影响设备功能。请根据需要调整这些值以确保数据追踪的准确性。</li>
		<li>其余所有设置保持默认状态。 
		注：默认脉冲参数生成一个具有30伏电压、20 Hz频率、1 ms持续时间和200个脉冲的方波形。默认TEEI测量参数为0.5伏电压，以及100 Hz、1,000 Hz、10,000 Hz和100,000 Hz的频率。</li>
		<li>单击运行按钮，并在提示时为1-3号孔和4-6号孔输入适当的名称。单击确定以开始实验。</li>
		<li>程序执行完毕后，将电极阵列从培养箱中取出，并将插入物转移回实验孔板中的原始位置。</li>
		<li>在200 µL反应管中，将2 µL Hoechst 33342、5 µL钙黄绿素AM和10 µL PI与113 µL细胞培养基混合。</li>
		<li>将10 µL染色液移液至每个脉冲后的插入物中，并将插入物放回培养箱中孵育5分钟。</li>
		<li>将孔板转移至配备5倍物镜的荧光成像显微镜的板架上。使用明场及各染料的荧光进行成像。在触发相机前，将插入物中心对准物镜。 
		注：PI、钙黄绿素AM和Hoechst 33342的激发波长分别为558 nm、495 nm和353 nm。发射波长分别为575 nm、519 nm和465 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用 CellProfiler 流程分析图像数据
	<ol>
		<li>使用 GitHub 上提供的自定义 CellProfiler 工作流程处理递送和 TEEI 测量实验图像：https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TEEI 分析
	<ol>
		<li>在图形用户界面（GUI）中点击 分析 选项卡。</li>
		<li>在 GUI 底部将 阻抗类型指示器 切换至 TEEI。</li>
		<li>点击左上角框中的箭头，显示数据文件中的所有实验名称。从 TEEI 测量实验中选择全部 细胞样本数据。</li>
		<li>点击右侧下一个框中的箭头，显示数据文件中的所有实验名称。从 TEEI 测量中选择全部 对照插入数据。</li>
		<li>点击 运行。将显示一个基础图表，包含在最低测量频率下的选定细胞样本数据。</li>
		<li>在 GUI 右侧的样本选项框中，点击箭头以显示所有已选的插入数据。可通过选择相应数据并点击下方的 移除 来剔除异常值。 
		注意：上一次点击 移除 按钮时从分析中删除的任何数据，均可通过点击 撤销 按钮恢复。</li>
		<li>当图表中显示所需数据后，点击 完成 以进入下一个图表。</li>
		<li>对剩余的细胞样本数据和对照数据重复步骤 4.2.6 和 4.2.7。当最终数据集通过点击 &#34;完成&#34; 确认后，完整的分析图表将显示出来。</li>
		<li>保存分析图表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

TEEI Method for Electroporation Analysis and Delivery Prediction in A431 Cells

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

图2C 显示了每个PSEP波形电压对应的TEEI增加量和相对于基线的减少量。TEEI的增加量呈抛物线形变化，在约20伏时达到峰值后下降，而TEEI相对于基线的减少量则随电压升高呈指数增长。图2D 中的递送效率和死亡率百分比反映了类似趋势：递送效率呈抛物线形变化，在约30伏时达到峰值，而死亡率则随波形电压的升高呈指数增加。
导致TEEI升高的潜在机制之一，是由于在带负电荷的基底微通道中发生电渗作用，这一现象由外加电场引起18,19。TEEI响应究竟是源于电渗流体流动引起的细胞肿胀所产生的机械刺激——这一因素已知在电穿孔过程中会发生20，还是源于波形本身的电刺激，目前尚不明确。但可以确定的是，细胞单层的健康状态和完整性对于在细胞膜上实现电穿孔所需的适当电压降至关重要。因此，本方法中最关键的步骤是细胞接种以及确保形成完整的细胞单层。该状态可通过成像观察细胞单层以及通过基础TEEI值来确认。对于A431细胞，平均TEEI约为7 Ω·cm²，而HEK293T细胞的平均值略低，约为5 Ω·cm²（图2Aii），这可能是由于形态学差异导致细胞间连接面积不同所致。
由于多孔基底电穿孔需要电场，会发生电解反应，导致电极腐蚀12,21。在本实验中，底部电极为正极，用于递送带正电荷的碘化丙啶（PI），因此其腐蚀现象尤为明显。通过实验确定，底部印刷电路板（PCB）在需要更换前可重复使用约20次，之后将出现显著的负面影响13。为清洁电极阵列以供重复使用，需先用移液器吸除各腔室中残留的细胞培养液或转染试剂。将每个腔室注入约四分之三体积的70%乙醇，并将顶部电极PCB放置在电极阵列上，使顶部电极浸没于乙醇中。乙醇需在电极阵列中静置至少10分钟，之后吸除乙醇，并将电极阵列置于一旁晾干。
可以通过移除基质、对插入物进行灭菌，并用来自其他来源的基质替换原有基质，从而重复使用购买的插入物。市面上可购得具有相同孔密度和直径的6孔插入物，可用于制备四个24孔插入物尺寸的替换基质。将先前使用过的插入物灭菌后，在新的培养皿中加入10 µL紫外光固化环氧树脂。将插入物的基质面浸入环氧树脂液滴中，使其底面均匀涂覆，然后小心地将新的基质覆盖在插入物的孔洞上。通过肉眼确认环氧树脂形成完整的环状密封，确保连接处无任何缝隙。在紫外光下固化30秒，并将翻新的插入物存放于洁净的24孔板中，以避免在再次使用前损坏新基质。
如前所述，尽管推测所观察到的 TEEI 升高可在多种细胞类型中发生，但目前仅在 A431 和 HEK293T 细胞系中得到验证13（图 1C），二者均为贴壁细胞。可通过选择不同细胞系、选用具有不同孔径特性的膜、将纤连蛋白包被替换为其他细胞外基质蛋白并调整其浓度，或更换运载物等方式对本方法进行修改。然而，若对实验设置做出任何改动，可能需要重新优化电脉冲波形。为优化波形，可开展 TEEI 测量实验，每次仅改变一个波形参数（例如电压），每组包含三个样本。通过检测至少九个健康样本中 TEEI 的最大增幅来确定最佳电压。对每个波形参数重复此过程，在优化下一个参数时使用已优化的新参数值。需注意，波形参数可能存在多个局部最优值（例如，某一脉冲持续时间下的最佳电压可能并非另一脉冲持续时间下的最佳电压，依此类推）。
多孔基底电穿孔技术的优势十分广泛。尽管其他细胞内递送方法已存在较长时间，但很少有方法能像PSEP一样同时具备高通量和高度可控性1,13。此外，该平台采用TEEI测量技术，能够揭示电穿孔过程中的中间步骤。TEEI读数可反映细胞状态，指导电穿孔参数的选择，并有助于深入理解特定的细胞行为与机制13,17。通过TEEI测量，该平台还能够实现无标记递送13，从而在实验中减少对昂贵生物标志物和试剂的依赖，实现快速优化。这些在细胞内递送领域的贡献，使该技术成为基础生物学研究和生物医学应用中极具潜力的递送平台。

电穿孔是一种将细胞暴露于电场中的技术，可在细胞膜上形成临时孔隙，使包括蛋白质、RNA和DNA在内的分子能够通过这些孔隙进入细胞1,2。目前应用最广泛的是批量电穿孔（BEP）。BEP通过将含有数百万个细胞的电解质溶液注入电转杯中，施加高电压，使分子通过扩散或内吞作用进入细胞1。BEP具有高通量以及多种商业化系统可选等优势。然而，BEP在递送过程中也存在局限性。由于细胞相对于电极的位置不一致，以及相邻细胞对电场的屏蔽效应，导致BEP过程中细胞所受电场强度存在显著差异3,4。此外，BEP所需的高电压对细胞活力有明显的负面影响5。自2011年首次提出以来6，一种称为多孔基底电穿孔（PSEP）的技术受到越来越多关注，尽管该技术有时也被称为局域电穿孔或纳米/微米电穿孔1,7,8。与BEP所用的悬浮细胞不同，PSEP是在贴壁于多孔基底上的细胞上进行的。不仅大多数人类细胞系更倾向于贴壁生长状态9，而且基底上的孔洞还能聚焦电流，使跨膜电位（TMP）局限于细胞膜的特定区域10,11。这种局域化效应使得所需施加的电压显著降低，从而减少细胞损伤并提高细胞存活率。上述多种效应共同作用，有助于控制细胞膜上孔隙的形成，实现更一致且高效的分子递送1,5,12。
最近一项研究介绍了一种PSEP装置，该装置配备六孔镀金电极阵列，可用于承载市售的多孔膜插件13（图1A、B），这一方法最初由Vindis等人提出14。该装置能够施加电脉冲，并实时测量细胞单层的电学阻抗，即跨上皮电阻（transepithelial electrical impedance, TEEI）13。该设备的用户界面可对电穿孔波形和极性进行完全控制。重要的是，通过实时阻抗测量可在无需昂贵试剂或荧光标记物的情况下预测递送效果，这一概念被称为无标记递送（label-free delivery）15。
PSEP 平台由两个主要的定制电子部件组成：设备的主体部分，其内部包含脉冲发生器和 TEEI 测量设备；以及电极阵列，用于插入多孔基底并进行电穿孔操作。所有定制电子元件和 3D 打印部件的示意图均可在 GitHub 上获取：https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI。除了定制电子元件外，该平台正常运行还需要一台计算机。定制软件需要 MATLAB（版本 2021a 或更高）来运行，并使用 Microsoft Excel 存储和访问用于分析的数据。该程序控制定制电子设备，并提供图形用户界面（GUI）以调整各项设置。这些程序也已在 GitHub 上公开：https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI。
初步数据表明，该过程可能适用于不同类型的贴壁细胞（图1C），但本文仅讨论使用Brooks等人确定的适用于A431细胞系的最佳参数来制备A431细胞的方法13。此外，由于碘化丙啶（PI）载荷具有细胞毒性，因此需进行两个实验：第一个实验使用高浓度PI转染培养基以量化递送效率，第二个实验则仅使用细胞培养基以在较长时间尺度上测量TEEI。这两个实验采用相同的电穿孔波形，从而可对结果进行关联分析（图1D）。
<img alt="细胞阻抗研究：电极示意图、PCB装置、TEEI随时间变化图及TEEI增长与效率关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1电极阵列组装示意图及基础数据 (A) 电极阵列孔内插入件的CAD模型。B) 电极阵列的 CAD 模型。 (C) 特定细胞系因PSEP导致的阻抗增加，每种细胞系n = 3。误差棒：均值标准误。D递送效率 与TEEI 增强相关性数据。递送效率通过将递送实验中在 PI 和钙黄绿素图像中均被标记的细胞数量除以 Hoechst 鉴定出的总细胞数来计算。细胞计数使用自定义的 CellProfiler 流程完成，每种电压下 n = 6。误差棒：（x 轴和 y 轴）均值标准误。该图改编自 Brooks 等人。13 经许可。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>双芯片一次性血细胞计数板</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>fisherbrand</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>II 级 A2 型生物安全柜</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>定制组件</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>一次性离心管（50 mL）</td><td>fisherbrand</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5670401</td><td></td></tr><tr><td>液体抽吸系统</td><td>vacuubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Labomed</td><td>TCM 400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管 200 &amp;micro;L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>移液器（0.2–2 &amp;micro;L）</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00002</td><td></td></tr><tr><td>移液器（100–1000 &amp;micro;L）</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>移液器（20–200 &amp;micro;L）</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>移液器（2–20 &amp;micro;L）</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>反应管 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert（24 孔）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0.4 &amp;micro;m 孔径，2×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cm&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt; 孔密度，透明 PET 材质</td></tr><tr><td>组织培养板（24 孔）</td><td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20mL</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

多孔基底电穿孔（PSEP）是一种新兴的电穿孔方法，可实现高通量且稳定的递送效果。与其他多种细胞内递送技术类似，PSEP 高度依赖荧光标记物和荧光显微镜来判断递送是否成功。为了深入了解电穿孔过程中的中间步骤，研究人员开发了一种集成了跨上皮电阻（TEEI）监测功能的 PSEP 平台。细胞在市售的带有多孔膜的插入式培养小室中进行培养。经过 12 小时的孵育，形成完全融合的单层细胞后，将这些插入式小室置于 PSEP 装置孔中的转染培养基内。随后对细胞单层施加用户自定义的电脉冲波形，并通过荧光显微镜确认递送效率。在电脉冲处理与荧光显微镜观察之间加入 TEEI 测量，可显著增强该工作流程，从而获取有关 PSEP 过程的额外数据；这些额外的 TEEI 数据与递送效率和细胞活力等递送指标密切相关。本文介绍了一种结合 TEEI 测量进行 PSEP 操作的实验方案。

本方案建立了一种利用 TEEI 测量来研究电穿孔中间过程并预测递送效率的方法，特别针对 A431 细胞系和 PI 货物。尽管本文后续讨论了对该方案的修改，但需注意的是，尽管具体数值可能发生变化，响应的整体趋势保持一致。例如，TEEI 数据低于初始基线表明细胞死亡，而 TEEI 值相对于最小值的最大增幅则对应递送效率13。下文将探讨这些总体趋势及其意义。
如图2A所示，在使用PSEP平台时可能出现多种TEEI测量结果和细胞成像趋势。本实验方案的理想结果是获得一条类似于图2Ai中所示优化健康数据的曲线。该曲线被定义为理想结果，因其未出现低于基线的下降，表明细胞死亡极少甚至没有。此外，优化后的健康曲线从最低值起TEEI上升幅度最大，表明递送效率较高13。这些推断得到了PSEP处理后细胞单层成像结果的支持，图像显示细胞死亡可忽略不计，细胞单层健康且完全汇合（图2Aiii）。此外，使用相同PSEP波形的成功递送实验可由图2B所示图像进行表征。适当的电穿孔波形应用和货物浓度可实现较高的递送一致性和细胞活力。
细胞单层的健康状态和汇合度对于基于TEEI的递送预测成功应用至关重要16,17。即使采用优化的波形，不健康或不完整的细胞单层仍会导致TEEI响应减弱，如图2Aii中优化但不健康的数据所示。然而需注意，该结果对应的图像（图2Avi）仍符合Brooks等人13对TEEI响应的解释。响应曲线未低于基线，表明细胞死亡接近于零（图2C、D）。此外，从最低点起的增幅减小反映了递送效率受到负面影响，因为单层中细胞数量减少导致总的PI递送量降低（图2C、D）。
如果施加未优化的波形，可能会观察到TEEI响应更显著的下降。根据施加的总能量及其时间范围，未优化的波形可能导致效率降低，甚至接近完全破坏细胞单层（图 2Ai、iii、v）。未优化和极度未优化的曲线均显示出较基线显著下降，表明细胞大量死亡。然而，波形越不优化，越会阻碍细胞恢复，导致递送效率降低。
递送效率通过将递送实验中PI和钙黄绿素图像中均被标记的细胞数量除以Hoechst识别的总细胞数来计算。死亡率通过将TEEI测量实验中被PI标记的细胞数量除以Hoechst识别的总细胞数来计算。两项指标的细胞计数均使用定制的CellProfiler流程进行确定。
<img alt="TEEI 随时间与电压变化的曲线图及荧光显微图像；细胞健康分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：常见条件下的 TEEI 响应曲线与成像结果。 （A）（i）TEEI 响应数据，显示优化与非优化条件下 TEEI 变化的百分比。（ii）在优化波形条件下，健康与非健康单层细胞之间的 TEEI 响应比较。（iii-v）代表性成像结果，展示在优化与非优化波形条件下可能的实验结果，显示细胞死亡（红色）和活细胞（绿色）。（vi）在施加优化波形条件后非健康单层细胞的代表性成像结果，显示细胞死亡（红色）和活细胞（绿色）。（B）图像显示成功的 PI 递送（红色）、活细胞（绿色）以及细胞核位置（蓝色）。所有图像均已增亮以提高清晰度。比例尺：1000 µm。（C）在给定电压下，TEEI 从 PSEP 前基线降至 PSEP 后最低值，以及从 PSEP 后最低值升至 PSEP 后峰值的变化情况。（D）在给定电压下的递送效率与细胞死亡百分比。误差线表示标准误（SEM，n = 6）。（C,D）经许可转载自 Brooks 等人13。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

多孔基质电穿孔（PSEP）可实现稳定、高通量的递送，并保持高细胞存活率。跨上皮电阻（TEEI）测量的引入为PSEP的中间过程提供了深入见解，并实现了无标记递送。本文介绍了一种同时进行PSEP递送实验与TEEI测量分析的方法。

多孔基质电穿孔（PSEP）是一种新兴的电穿孔方法，可实现高通量且稳定的递送。与其他许多方法类似……

我们的研究致力于改进多孔基底电穿孔技术。研究表明，利用微米和纳米通道来实现电穿孔的局部化具有显著优势，但仍存在一些尚未解决的问题，尤其是在电穿孔过程的中间阶段对效应进行监测和表征方面。最近的一些进展包括我们采用跨上皮电学阻抗监测技术，以及利用基于纳米通道的电穿孔来生成外泌体或测量细胞膜张力。PSCP 实验目前仍主要依赖转染前后的荧光成像来确定递送效果和细胞存活率。此外，许多基于 PSCP 的研究对脉冲参数的报告不足，且鲜有研究致力于验证常见细胞类型的最优参数。我们所针对的主要研究空白在于，缺乏关于 PSEP 在细胞恢复阶段影响的系统性报道。然而，我们对 TEEI 测量结果的分析表明，TEEI 的变化与细胞活力和递送效率相关，这使我们也能确定最佳的 PSEP 波形参数。今后我们的主要研究重点将是明确导致 TEEI 升高的机制。理想情况下，这些发现将有助于进一步优化 PSEP 工艺，实现更高效的递送。开始纤维连接蛋白包被时，选取12个插入式培养小室和两个24孔板。将插入式培养小室放入一个孔板中，排列成两行，每行六个。在1.5毫升离心管中，将52微升纤维连接蛋白储备液与1.2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制浓度为1微克/毫升的纤维连接蛋白溶液。向每个插入物中加入100微升纤连蛋白溶液。将插入物置于培养板中，在37摄氏度下孵育3小时。孵育结束后，移除每个插入物中多余的纤连蛋白溶液。用移液器向每个小室中加入 100 微升无菌蒸馏水，清洗小室两次。按照与加液相同的顺序移除液体，以确保各小室之间的清洗时间一致。随后用 100 微升细胞培养基清洗小室，然后从小室中移除培养基。接下来，将200微升A种子液加入插入式培养皿中，用于31细胞悬液的阴性对照；用移液器将200微升细胞培养基加入插入式培养皿中。使用永久性记号笔，在第二块培养板上画一条线，将其分为两列，每列宽三个孔，并将每列进一步划分为若干行。在网格中用相关参数标记每个区域。向每个孔中加入一毫升细胞培养基。将插入物从制备板转移至已标记实验板的相应位置，并在37摄氏度下孵育12小时。首先，用移液器将1.5毫升浓度为0.1毫克/毫升的碘化丙啶溶液加入电极阵列的每个孔中。将插入物放入电极阵列的每个孔内，使插入物的脚嵌入对齐凹槽中，确保插入物与孔的上表面齐平。将顶部电极印刷电路板拧紧至电极阵列孔的上方，并将电极阵列连接至多孔基底电穿孔（PSEP）装置。将电极阵列放入37摄氏度的培养箱中进行温度平衡。在界面左上角的“membrane”下拉菜单中点击，选择400纳米GBO。在界面右侧的“post pulse time duration minute”编辑框中输入1。现在点击运行按钮，当系统提示时，为1至3号和4至6号孔输入相应的名称，然后点击确定以开始实验。一小时后，从培养箱中取出电极阵列，将插入物转移回实验板中的原始位置。在200微升离心管中，将2微升Hoechst 33342和5微升钙黄绿素AM与123微升细胞培养基混合。轻轻将10微升染色液用移液器加入每个电脉冲后插入孔中，并将插入孔放回培养箱孵育5分钟，随后将培养板转移至配备5倍物镜的荧光显微镜的载物台。使用明场及各染料的荧光进行成像。向电极阵列的每个孔中加入1.5毫升细胞培养基。将细胞样本小室插入第1至第3孔，对照小室插入第4至第6孔，确保小室底部凸脚嵌入对齐凹槽中。将顶部电极印刷电路板拧紧至电极阵列板的顶部，并将电极阵列连接至PSEP设备。将电极阵列置于37摄氏度培养箱中进行温度平衡。在 gooey 界面左上角的膜下拉菜单中点击，然后选择 400 纳米 GBO。接着点击运行按钮，当系统提示时，分别为 1 至 3 号孔和 4 至 6 号孔输入适当的名称，然后点击确定以开始实验。一小时后，从培养箱中取出电极阵列，并将插入物转移回实验板中原来的孔位。将宿主细胞32342、钙黄绿素AM和碘化丙啶加入细胞培养基混合液中，轻轻吹打混匀后，向每个电穿孔后的插入式培养小室中加入10 µL染色液，再将小室放回培养箱中孵育5分钟。使用荧光显微镜对细胞样本小室进行成像，分别采集明场图像以及各染料的荧光信号。优化后的健康细胞曲线显示，跨上皮电阻（TEEI）在脉冲序列电穿孔（PSEP）成像后未出现低于基线的情况，且TEEI上升幅度最大；细胞单层成像结果显示细胞死亡极少，细胞单层健康且完全汇合。优化后的非健康状态数据则表现为TEEI响应减弱。在PSEP成像后发现，由于单层细胞数量较少，细胞死亡接近于零，但递送效率降低。使用未优化的波形导致TEEI反应显著下降，表明细胞死亡明显增加，递送效率下降。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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