Name: 通过荧光原位杂交对福尔马林固定石蜡包埋样品中的基因扩增进行稳健检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: 了解荧光原位杂交技术在福尔马林固定石蜡包埋样本中检测基因扩增的优化方法。该技术可清晰识别HER2等癌基因扩增模式，为癌症进展研究提供可靠数据。

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S.W. 是德克萨斯州癌症预防与研究所（RR210034）的支持学者

本研究方案已获得德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会（IRB）的批准。所有患者在手术前均已签署知情同意书。
1. 试剂与材料准备
<ol>
	<li>在通风橱中，缓慢将 8.212 mL 盐酸（HCl，37% w/w 或 12.1 N）加入 491.788 mL 去离子水中，配制 0.2 N 盐酸（HCl）溶液。2O. 室温（RT）保存。 
	警告：应缓慢将酸加入水中，切勿将水加入酸中。</li>
	<li>将 1.47 g 三水合柠檬酸钠溶于 400 mL 去离子水中，配制 pH 6.0 的 10 mM 柠檬酸溶液2O. 使用 HCl 调节 pH 至 6.0，然后用 ddH₂O 定容至 500 mL。2O. 将缓冲液在室温下保存。</li>
	<li>通过加入100 μL Tween-20至1 mL水中，配制10% Tween-20溶液 &#181;L 的吐温-20 至 900 &#181;ddH₂O 升2O. 在室温下保存。</li>
	<li>通过将5 mL IGEPAL CA-630加入45 mL ddH₂O中，配制10% IGEPAL溶液。2O. 在室温下保存。</li>
	<li>将 44.1 g 三水合柠檬酸钠（二水合物）和 87.65 g 氯化钠（NaCl）溶于 900 mL 去离子水中，配制 20x SSC 溶液（pH 7.0，3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠）。2O. 使用 HCl 调节 pH 至 7.0，然后用 ddH₂O 定容至 1000 mL。2O. 将缓冲液在室温下保存。</li>
	<li>将100 mL 20x SSC加入900 mL ddH₂O中，配制2x SSC溶液。2O. 如有必要，加入0.5 mL防腐剂（材料表。在室温下保存。</li>
	<li>通过混合910 &#181;L 的 ddH2O, 500 &#181;20x SSC 50 L &#181;10% Tween-20 溶液 40 L &#181;L RNase A、1 mL 50% 硫酸葡聚糖和 2.5 mL 甲酰胺。分装为每份 1 mL，于 -20 ℃ 保存 &#730;C.</li>
	<li>将100 mL 2x SSC、15 mL 10% IGEPAL与385 mL ddH₂O混合，配制0.4x SSC含0.3% IGEPAL的溶液。2O. 在室温下保存。</li>
	<li>将5 mL 10% IGEPAL加入495 mL 2x SSC溶液中，配制含0.1% IGEPAL的2x SSC溶液。室温保存。</li>
	<li>使用前新鲜配制蛋白酶K消化缓冲液，加入1 &#181;蛋白酶K L 加至99 &#181;L 的 Tris-EDTA 缓冲液</li>
	<li>将1 mg DAPI溶解于1 mL ddH₂O中，配制1 mg/mL DAPI储存液。2O. 在 -20 ℃ 保存 &#176;C，并避光。通过加入1 &#181;L 的 DAPI 储存液至 999 &#181;2x SSC 溶液的 L。避光保存至使用。</li>
</ol>
2. 样品预处理
注意：此处使用的载玻片含有样本。
<ol>
	<li>将载玻片在 60–90°C 下烘烤 20 分钟或过夜（图 1）。 
	注意：此步骤有助于熔化石蜡。通常，加热 20 分钟已足够，也可延长至过夜以适应实验安排。</li>
	<li>将载玻片浸入 Coplin 染色缸中的二甲苯或其替代品中 10 分钟以脱蜡。用新鲜的二甲苯或其替代品重复此步骤一次。后续所有预处理和洗涤步骤均在 Coplin 染色缸中进行。 
	注意：二甲苯替代品是安全且环保的二甲苯替代物。其中一种替代品（参见材料表）的效果与二甲苯相当甚至更优。尽管二甲苯替代品产生的气味较轻，但仍建议在通风橱内使用。若无法获得二甲苯替代品，所有步骤均可兼容基于二甲苯的脱蜡过程，无需任何修改。</li>
	<li>用 100% 乙醇洗涤 5 分钟以去除残留的二甲苯替代品。</li>
	<li>用 70% 乙醇浸泡 5 分钟以使组织复水。</li>
	<li>将载玻片在室温下浸入 0.2 N 盐酸（HCl）中 20 分钟。 
	注意：HCl 可有效提取酸溶性蛋白（如碱性核蛋白），从而提高 DNA 对 FISH 探针的可及性11。</li>
	<li>将载玻片浸入 10 mM 热柠檬酸溶液中，在 90–95 °C 下孵育 20 分钟。 
	注意：高温下的柠檬酸处理同样可提取酸溶性蛋白。两种酸处理均被认为可去除细胞外基质蛋白，从而降低自发荧光12。建议在将柠檬酸溶液加至载玻片前，先将其预热至目标温度范围。微波加热是一种便捷的方式。水浴（如使用 sous vide 烹饪器）则是高温孵育最有效且经济的方法。</li>
	<li>用 2x SSC 快速冲洗载玻片以中和 pH。</li>
	<li>加入 100–200 µL 蛋白酶 K 消化缓冲液（用量需完全覆盖组织，具体取决于切片大小），消化组织并在室温下孵育 1 分钟。 
	注意：蛋白酶 K 消化可进一步提高 FISH 探针的可及性并降低自发荧光。消化时间应根据组织类型进行优化。大多数情况下，1 分钟的消化时间已足够。过度消化会导致细胞核呈晕环状形态，此时应缩短消化时间。</li>
	<li>立即终止蛋白酶 K 消化，并通过将载玻片依次浸入 70% 乙醇（2 分钟）、85% 乙醇（2 分钟）和 100% 乙醇（2 分钟）进行脱水。</li>
</ol>
3. 荧光原位杂交与成像
<ol>
	<li>通过稀释2来制备FISH杂交混合液 &#181;FISH 探针原液 8 微升 &#181;L杂交缓冲液，然后将其加至载玻片上。用盖玻片覆盖样本。 
	注意：使用的总FISH探针原液量范围为0.5–4 &#181;L，具体取决于图像质量。如果信号过弱，可增加探针用量；如果背景过高，尤其是观察到细胞核外存在荧光碎片时，应减少FISH探针用量。杂交缓冲液可使用商业探针配套提供的缓冲液，或按照第1节所述自行配制。</li>
	<li>将载玻片置于加热板上，例如载玻片槽杂交系统，于75 ℃下变性DNA &#176;在75℃条件下持续2至5分钟。随后，将载玻片转移至另一设定为37℃的加热板上 &#176;在37摄氏度的加热板上过夜杂交。 
	注意：如果热板带有用于在杂交过程中维持湿度的水盘或储水槽，则无需使用橡胶胶水密封盖玻片。</li>
	<li>杂交后，将载玻片浸入40–60 &#176;将预热的含0.3% IGEPAL CA-630的0.4x SSC洗涤缓冲液加入，然后小心移除盖玻片。在避光条件下继续洗涤两次，每次5分钟，第一次加入缓冲液后的10-15秒内进行振荡。 
	注意：将载玻片浸入洗涤缓冲液中可轻柔地去除盖玻片。</li>
	<li>在室温避光条件下，用含 0.1% IGEPAL CA-630 的 SSC 缓冲液洗涤载玻片，振荡 5 分钟，前 10–15 秒需持续振荡。</li>
	<li>为淬灭自发荧光，使用自发荧光淬灭试剂盒处理载玻片（参见 材料表) 通过施加 150 &#181;升试剂（50 &#181;L + 50 &#181;L + 50 &#181;L 的试剂 A、B、C）中孵育 2-5 分钟，然后用 2x SSC 洗涤 5 分钟。 
	注意：此为可选步骤。组织自发荧光主要来源于细胞外基质成分，例如胶原蛋白和弹性蛋白。由于溶酶体和线粒体含有脂褐素、NADPH和黄素辅酶，也会显著影响自发荧光。醛类固定剂的使用以及血液细胞的存在也可能明显增强自发荧光13,14.</li>
	<li>用 DAPI 染色 10 分钟。用 2x SSC 缓冲液冲洗 5 分钟。 
	注意：如果未使用自发荧光淬灭试剂盒处理载玻片，DAPI 染色时间可缩短至 2 分钟。</li>
	<li>将载玻片迅速浸入去离子水中不超过1秒，然后用纸巾吸去多余水分，迅速擦干。 
	注意：此步骤为可选步骤。去离子水处理可有效防止 SSC 缓冲液在载玻片上形成盐结晶，从而提高成像质量。然而，在这种低离子条件下，FISH 探针与靶向 DNA 之间的氢键会被削弱，导致探针解离和信号丢失。因此，必须将水处理步骤的时间控制得非常短暂。</li>
	<li>干燥玻片，然后用抗荧光淬灭封片剂封片。成像前用指甲油密封盖玻片。 
	注意：如果载玻片经过自发荧光淬灭试剂处理，应根据制造商说明使用抗荧光淬灭封片介质进行封片。此外，根据封片介质的类型（硬化型或非硬化型），样品需在封固和成像前固化1至24小时。建议至少过夜固化，以获得最佳成像折射率。</li>
	<li>使用60&#215; 使用油镜捕捉荧光信号。利用 DAPI 通道调节焦距。确保获取多个 Z 层切片。通常，以 1-&#181;m 间隔已足够。进行最大强度三维投影以获得最佳分辨率。应用去卷积或其他背景清除算法以进一步提高图像质量。</li>
</ol>

Enhancing FISH Analysis for Oncogenic Drivers in Cancer Tissue Samples

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

S.W. 是 Dimension Genomics Inc. 科学咨询委员会的成员。

FISH 是一种快速且经济的细胞遗传学诊断方法。特别是在确定癌症中是否存在 ecDNA 时，FISH 证据仍是金标准1。对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行 FISH 检测，可快速判断患者活检样本中的基因状态，从而实现更迅速的诊断，并在疾病进展过程中持续追踪其变化。该技术对于已为病理学目的采集的临床样本检测尤为有价值。
本方案包含多个关键步骤。第一步是彻底脱蜡。残留的石蜡可能干扰FISH杂交。如果在步骤2之后样本仍呈现蜡状，应使用新鲜的二甲苯或其替代品再次处理。
其次，蛋白质提取和消化至关重要。这些步骤不仅能增强DNA对FISH探针的可及性，还能显著降低自发荧光。本方案包含三个去蛋白步骤。尽管使用0.2 N HCl和10 mM柠檬酸的处理较为简单，但蛋白酶K消化可能需要优化。使用蛋白酶K时最常见的错误是过度消化，会导致细胞核呈现晕环状。缩短消化时间可改善细胞核形态。此外，建议同时消化的样本不超过四个，以尽量减少第一个与最后一个样本之间的处理时间差异。需要注意的是，即使完整的细胞核在高倍镜和高分辨率显微镜下也可能呈现晕环状，这是因为细胞核不在同一焦平面上。因此，建议采集多个Z轴层扫描图像，并进行最大值投影以观察细胞核形态。
最后，建议淬灭自发荧光。尽管酸提取和蛋白酶K消化可显著降低蛋白质来源的背景信号，但荧光代谢物仍可能影响成像质量。
尽管 FISH 在识别局灶性基因扩增方面具有无与伦比的空间分辨率，但它也存在局限性。首先，与 PCR 或基于下一代测序（NGS）的方法相比，其通量和检测内容有限。通常，在无需特殊设备的情况下，一张切片上仅能应用一到三种不同颜色的 FISH 探针。然而，自动化技术的进步已使得高通量、高含量的 FISH 技术（如in situ测序21）成为可能。其次，FISH 探针的设计需要预先掌握目标序列信息。目前针对癌症中反复出现的局灶性扩增事件的研究，已推动了预设计 FISH 检测面板的开发，可用于实验室和临床应用。例如，在小细胞肺癌中，MYC 家族癌基因常以染色体外 DNA（ecDNA）形式扩增，从而介导化疗耐药性。因此，靶向 MYC、MYCL 和 MYCN 基因的 FISH 检测面板可加快对活检样本治疗反应的判断。相比之下，NGS 能够对目标基因进行更无偏倚的筛查。然而，在基于 NGS 的技术中，只有通过计算成本较高的分析进行全基因组测序22，才能实现对 ecDNA 的表征。
综上所述，我们提供了针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中局部基因扩增研究的可靠且全面的操作指南。通过分析荧光原位杂交（FISH）信号模式，可以明确判断基因位点是否发生扩增以及其扩增方式。我们预期将机器学习技术引入间期细胞核图像分析23，以提取有关拷贝数及扩增形式（染色体或染色体外DNA，ecDNA）的细胞遗传学信息，从而简化分子诊断流程，并加深对癌症致病机制的理解。

局灶性癌基因扩增的研究至关重要，因为它驱动癌症的发生、发展和治疗耐药性1。重要的是，癌基因和免疫调节基因可能以染色体外DNA（ecDNA）的形式扩增，其不对称遗传促进了癌症中的遗传异质性2,3。ecDNA已被证实与治疗耐药性和不良临床预后相关4,5,6。
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本是病理学实验室中重要的存档资源，为回顾性研究提供了丰富的信息。然而，由于固定过程中核酸发生片段化、降解和交联，通过PCR或测序技术从FFPE标本中提取分子数据具有较大挑战性7在可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织分子分析的多种技术中，荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）已被证实可有效用于可视化特定的DNA序列8.
尽管现代分子诊断技术不断进步，FISH 能够在单细胞水平上可视化和定量基因扩增，从而为肿瘤发生机制及临床预后提供宝贵的见解。通过使用与目标基因互补的荧光标记探针，FISH 可便捷地确定癌基因的定位，并推断单个细胞内癌基因扩增的形式（例如 ecDNA），而这一点通过其他技术手段通常难以实现或成本高昂。因此，FISH 为评估肿瘤异质性和克隆演化提供了一种经济有效的方法9。此外，自动化、成像技术和计算分析的进步促进了 FISH 数据的高通量分析，使得在大规模组织样本队列中对基因扩增进行可靠定量成为可能10。
然而，将FISH技术应用于FFPE组织样本时存在固有的挑战，包括交联伪影和背景自发荧光。克服这些障碍需要对每个实验步骤进行细致优化，以确保结果的准确性和可重复性。本文提供了一套逐步完善且经过全面优化的实验方案，用于在FFPE组织样本中应用FISH技术检测基因扩增。通过使用靶向ERBB2（HER2）基因位点的探针，我们证明了FISH能够可靠地检测乳腺癌患者FFPE样本中的ERBB2扩增状态，甚至可以判断ERBB2是否以染色体外DNA（ecDNA）形式扩增。结合现有文献与我们的实验结果，本文阐明了基于FISH分析的方法学考量、技术难点及潜在陷阱。同时，我们还讨论了在多种癌症类型中进行基因扩增谱型分析的临床意义，强调其在预后评估及个体化治疗策略中的潜在价值。
总之，本文强调了FISH作为一种研究FFPE组织标本中基因扩增的重要工具的价值，为肿瘤生物学提供了无与伦比的洞察，并指导肿瘤学领域的临床决策。随着技术的持续优化及其与互补性分子检测方法的整合，基于FISH的分析有望进一步加深我们对癌症发病机制的理解，并在精准医学时代改善患者的预后。

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5748</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>50% 硫酸葡聚糖溶液</td><td>EMD Millipore Sigma</td><td>S4030</td><td>探针杂交缓冲液</td></tr><tr><td>ERBB2 (HER2) FISH 探针</td><td>Empire Genomics</td><td>ERBB2-20-RE</td><td>FISH 探针</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>组织脱水和水化</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>205821000</td><td>探针杂交缓冲液</td></tr><tr><td>Formula 83（二甲苯替代物）</td><td>CBG Biotech</td><td>CH0104A</td><td>去除石蜡</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td>样本预处理</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J19628K2</td><td>玻片洗涤</td></tr><tr><td>Proclin 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>SSC 缓冲液防腐剂（可选）</td></tr><tr><td>蛋白酶 K（800 单位/mL）</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td>蛋白质消化</td></tr><tr><td>RNase A（20 mg/mL）</td><td>New England Biolabs</td><td>T3018L</td><td>探针杂交缓冲液</td></tr><tr><td>Slide Moat 杂交系统</td><td>Boekel Scientific</td><td>280001</td><td>样本变性与杂交。可使用其他加热板替代。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S2713</td><td>SSC 缓冲液</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>Fisher BioReagents</td><td>FLBP3271</td><td>SSC 缓冲液和样本预处理</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) 缓冲液</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2473500</td><td>蛋白酶 K 消化缓冲液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td>探针杂交缓冲液</td></tr><tr><td>Vectashield 抗荧光淬灭封片介质</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H190010</td><td>玻片封片</td></tr><tr><td>Vector TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>SP8400</td><td>自发荧光淬灭试剂盒</td></tr></tbody></table>

福尔马林固定石蜡包埋样本中基因扩增的荧光原位杂交稳健检测

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

局灶性基因扩增，例如染色体外DNA（ecDNA），在癌症发生及治疗耐药中发挥重要作用。尽管基于测序的方法能够无偏倚地鉴定ecDNA，基于细胞遗传学的技术（如荧光原位杂交） 原位 荧光原位杂交（FISH）在临床样本中检测染色体外DNA（ecDNA）方面仍具有时间和成本效益。FISH在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中的应用为检测基因扩增提供了独特途径，尤其适用于无法获得可存活样本进行核型分析的情况。然而，目前该技术尚缺乏统一的操作流程。本方案提供了全面且经过完全优化的分步操作指南，用于在FFPE组织样本中开展FISH以检测基因扩增（包括ecDNA），并旨在克服和标准化此类样本所特有的技术挑战。通过遵循本方案，研究人员可重复地获得高质量的成像数据，以评估基因扩增状态。

我们采用来自 HER2 阳性和阴性乳腺癌的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，以展示 FISH 成像的结果。HER2（由ERBB2基因编码）的扩增是一个有利的标志物，因为针对 HER2 的分子靶向治疗已有多种可用且疗效显著的方案。相反，三阴性乳腺癌患者由于缺乏 HER2、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的表达，治疗选择有限，预后较差。因此，确定HER2状态在乳腺癌的研究与治疗中至关重要15。
在三阴性乳腺癌样本中，大多数细胞核显示两个独立的点状信号，代表HER2/ERBB2 FISH信号。由于切片偏差，部分细胞核可能仅显示一个点状信号（图2，左）。相比之下，HER2阳性样本中FISH信号丰富，呈现两种不同模式。一种模式表现为信号点在细胞核内弥散分布（图2，中），这是ecDNA形态的典型特征，因为ecDNA可能不占据特定且有序的核内区域16。此外，ecDNA在有丝分裂过程中不对称分离，导致拷贝数变异，从而引起细胞核间信号异质性17。部分细胞核可能偶尔出现信号簇集，提示存在ecDNA集线（hubs）18（图2，右）。另一种HER2扩增类型主要表现为杆状、致密的聚集结构，该形态可能提示基于染色体的扩增机制，例如均一染色区（homogeneously staining regions, HSR）19或断裂-融合-桥（breakage-fusion-bridge, BFB）循环20。值得注意的是，ecDNA、HSR和BFB扩增可在同一细胞核中共存。因此，建议观察多个细胞核以推断局灶性扩增的具体形式。
<img alt="组织制备示意图：过程包括脱蜡、蛋白质提取、FISH 杂交。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：FFPE 样本中 FISH 的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="HER2、ecDNA、HSR样细胞系使用DAPI、ERBB2 FISH进行比较；荧光显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：乳腺癌FFPE样本中典型的FISH图像。 放大倍数：600倍；比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案提供了一种可重复的方法，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中可视化基因扩增。

局部基因扩增，例如染色体外DNA（ecDNA），在癌症发生及治疗耐药性中发挥重要作用。然而……

癌基因扩增是癌症发生的关键驱动因素。利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行细胞遗传学表征，是研究癌基因扩增的一种经济有效的方法。本文提供了针对局部基因扩增及FFPE样本检测的可靠且全面的操作指南。通过分析FISH信号模式，可以明确判断基因座是否扩增以及扩增的方式。以染色体外DNA形式扩增的癌基因在人类癌症中普遍存在，例如肺癌、乳腺癌和脑癌。全基因组测序和FISH是检测染色体外DNA最常用的方法。将FISH技术应用于FFPE组织具有挑战性，因为交联假象和背景自发荧光常常影响数据质量。本方案包含一系列优化步骤，如蛋白质提取与消化、加热变性以及自发荧光淬灭技术，以提高在FFPE样本上进行FISH实验时的数据质量，从而为患者癌症进展提供有价值的见解。我们将研究染色体外DNA的分子功能以及癌细胞如何维持染色体外DNA。最终，我们的目标是消除它们以治疗癌症。首先，在老化后获取已制备样本的载玻片。为预处理载玻片，需将其依次浸入盛有适当溶液的考普林瓶中，处理指定时间。使用 100 至 200 微升蛋白酶 K 消化缓冲液消化组织，在室温下孵育 1 分钟。为终止消化反应，立即将玻片依次浸入乙醇溶液中，每种溶液各 2 分钟。将 FISH 杂交混合液加至玻片上，并用盖玻片覆盖样本。将载玻片置于热板上，例如在75摄氏度的载玻片杂交系统中加热2至5分钟。然后将载玻片转移至另一设定为37摄氏度的热板上，过夜杂交。接着，将载玻片浸入温热的洗涤缓冲液中，并小心移除盖玻片。在避光条件下使用适当的试剂清洗并染色载玻片。将载玻片迅速浸入去离子水中，时间不超过一秒，随后置于纸巾上。待其干燥后，用抗荧光淬灭封片剂封片。将盖玻片盖上，并用指甲油封固，然后进行成像。使用60倍油镜，采集多个Z轴层扫描的荧光信号。最后，进行最大强度三维投影以获得最佳分辨率，并应用去卷积或其他背景清除算法。在三阴性乳腺癌样本中，细胞核内的FISH信号主要显示每个细胞核有两个不同的点状信号，代表HER2 ERBB-2信号。相比之下，HER2阳性样本则表现出丰富的FISH信号，提示存在不同的基因扩增模式。此外，部分HER2阳性样本的细胞核中可能出现信号簇，提示存在染色体外DNA富集中心，这些中心是基因扩增增强的焦点区域。

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福尔马林固定石蜡包埋样本中基因扩增的荧光原位杂交稳健检测

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