Name: 感染中的免疫代谢回路用于推进宿主定向治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 了解利用四环素诱导型合成回路研究利什曼原虫感染中的免疫代谢机制。该方法通过调控宿主蛋白表达实现寄生虫清除，为开发新型宿主定向抗感染治疗策略提供重要实验框架。

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作者感谢浦那生物技术研究与创新委员会-国家细胞科学中心（BRIC-NCCS）主任对本研究以及BRIC-NCCS生物信息学平台的支持。

Designing Tetracycline-Controlled Synthetic Circuits for Leishmaniasis Therapy

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所得结果凸显了该流程的高效性，该流程已专门用于合成回路的设计与构建。该合成回路的构建是朝向开发针对利什曼病等传染性疾病的精准医疗迈出的重要一步。通过in silico方式组装基因元件并进行确定性模拟，监测到了TetON系统显著的调控效应。值得注意的是，该回路可能导致TetR与SDHA/GFP的相互双稳态表达。SDHA的表达呈周期性，这可能表明其表达水平仅在存在多西环素时才会升高。为观察一段时间内表达模式的潜在变化，选取了100个时间单位。结果表明，该合成回路在TetR和SDHA/GFP上表现出周期性行为，这很可能归因于其正交特性21。来自iGEM元件库的基因元件组装起到了关键作用，因其提供了构建合成回路所必需的遗传组分22。基因元件的模块化排列至关重要，因为回路的翻译与功能可能受到影响，进而导致细胞中表达效率降低及调控效果不佳23。
合成回路的插入片段大小约为 1.3 kb，以确保载体总大小不会过大，从而避免可能降低转化效率的问题24。选择合适的载体是关键步骤，因为载体必须含有能够在细菌系统中提高拷贝数并实现高质粒拷贝量的必需遗传元件，同时其表达系统还需能在哺乳动物系统中良好适配25。pEGFP-N1 载体在 RAW264.7 细胞系中已有充分表征，具有紧凑的质粒结构，并包含多克隆位点26。为确保获得高浓度且高纯度的质粒，实验中采用实验室标准化的缓冲溶液进行质粒提取，并通过分光光度法测定和琼脂糖凝胶电泳（AGE）进行验证。通过限制性酶切对合成回路在 pEGFP-N1 载体中的插入进行验证，并利用琼脂糖凝胶电泳和测序分析样品。AGE 结果显示，插入片段为 1.3 kb 条带，pEGFP-N1 载体为 4.7 kb 条带，完整合成回路为 6 kb 条带。
采用 DNA:PEI 比例为 1:1、1:2 和 2:1 进行转染，其中 1:1 的比例效果最佳，且未影响细胞形态（数据未显示）。建议使用 400 µg/mL - 1000 µg/mL 浓度的 G418 对转染细胞进行筛选27。本实验选用 500 µg/mL 的 G418 进行转染细胞筛选，因其可有效抑制未转染细胞的生长，同时不损害转染细胞的增殖能力或细胞形态（数据未显示）。鉴于细胞表型在转染效率中的重要性，尤其是巨噬细胞系可能经历分化而难以转染，本研究采用低代次的 RAW264.7 细胞系进行转化28。细胞传代次数也可能是影响转染效率的关键因素，高代次可能导致转染效率降低29。Dox 是 Tet-ON 诱导系统的首选诱导剂，因其对 TetR 具有高结合效率、良好的组织分布、低毒性以及 24 小时的半衰期30。转染后，细胞用 Dox 诱导 24 小时，并观察 GFP 表达情况。对于 RAW264.7 细胞，用于合成回路诱导的 Dox 浓度为 1 µg/mL，处于推荐范围 1–2 µg/mL 之内31（数据未显示）。然而，诱导后 SDHA 浓度的调控情况尚不明确。总体而言，细胞传代次数、DNA:PEI 浓度、哺乳动物转染筛选标记物浓度以及多西环素诱导浓度的确定与标准化，是转染过程中的关键因素。
在感染后不同时间点诱导合成回路后，观察到细胞内寄生虫负荷显著降低。对感染样本与IMTI样本的寄生虫载量进行比较，发现经合成回路诱导的细胞寄生虫负荷较低，这可能归因于SDHA的表达。由于SDHA的表达与一氧化氮（NO）的产生相关，观察到IMTI细胞呈现不规则且粗糙的形态，这种形态变化在RAW264.7细胞系产生NO时亦会出现32。感染6小时后，IL-10和IL-12水平达到最高，因为已有文献报道这两种细胞因子在此时间点均会上调，并进一步发生表型修饰，导致IL-10的产生多于IL-1219。由于转染后及IMTI样本中IL-10和IL-12水平未发生显著变化，因此进行了细胞因子谱分析，以检测促炎性和抗炎性细胞因子反应。
在感染6小时、IMT以及24小时IMTI样本中检测了TNF-α、IFN-γ和TGF-β的表达水平。为了清除细胞内寄生虫，TNF-α和IFN-γ起着关键作用，因其可通过一氧化氮（NO）的产生诱导氧化爆发。M2极化的巨噬细胞表达TGF-β，后者可下调促炎性细胞因子33。24小时IMTI样本中TNF-α和IFN-γ的表达水平高于TGF-β，表明在转染并感染L. major后，巨噬细胞可能已极化为表达促炎性细胞因子的表型。因此，本研究揭示了转染合成回路后所诱导的表型改变，并阐明了感染动态。由于合成回路的诱导显著增强了促炎性细胞因子的表达，相较于抗炎性细胞因子，其作为治疗手段的潜力值得进一步探究。综上所述，该研究不仅建立了合成回路的构建与递送流程，还通过上调遭受Leishmania攻击的宿主细胞中促炎性细胞因子的表达，在利什曼病模型中验证了其治疗潜力。

整体性和整合性医学的进步揭示了免疫细胞代谢改变与其在感染性疾病中调节免疫细胞表型能力之间的重要关联。免疫代谢学为阐明人类常见感染性疾病的发病机制提供了新的视角，同时通过发现新的干预靶点，为疫苗和药物的开发提供了有前景的技术1。在包括利什曼病在内的多种感染性疾病中，均已观察到免疫细胞的代谢重编程。Leishmania spp. 是导致利什曼病的病原体，其中Leishmania major （L. major）引起皮肤利什曼病（CL）。L. major 作为胞内寄生虫，对宿主细胞（尤其是巨噬细胞）的代谢产生显著影响，以促进其自身的增殖与存活2。巨噬细胞通常可极化为经典活化型（M1）或替代性活化型（M2）亚群：M1细胞通过氮代谢途径分泌大量促炎性细胞因子并产生一氧化氮（NO）；而M2细胞则表现出较高的抗炎性细胞因子水平，并通过氮代谢展现出高精氨酸酶活性3。因此，这两种表型不仅在免疫应答上存在差异，在其代谢通路上也各不相同。
利什曼病的系统生物学旨在通过药物设计与开发，识别用于设计新型治疗手段的分子靶点。信号网络和代谢通路的重建有助于将利什曼病作为一个整体模型来理解，并为识别驱动疾病状态的关键组分提供洞见。数学建模是理解利什曼病复杂性的最受青睐的应用分析方法之一4。免疫代谢网络与数学模型帮助识别出琥珀酸脱氢酶（SDHA）是M1表型的关键组分，该表型表达以清除寄生虫5。合成生物学在利什曼病的诊断、疫苗开发和治疗方面具有应用价值。通过合成生物学工具，可实现以代谢为靶点的免疫反应调控。为了调控肌醇磷酸神经酰胺合成酶（该酶调控鞘脂代谢并改变宿主免疫信号通路），研究人员使用了一个具有双稳态行为的基因回路，对L. major感染模型的内在鲁棒性进行人工调控6,7。因此，系统生物学与合成生物学可为Leishmania模型系统中精准医学的发展提供基于模型的基因工程平台。
M1 表型的特征是免疫代谢信号网络的表达，其中炎性细胞因子的产生与代谢通路协同增强寄生虫的清除。M1 极化表现为促炎性细胞因子的生成，如白细胞介素-12（IL-12）、γ-干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）。在 M1 表型中高度富集的代谢通路包括糖酵解、磷酸戊糖途径以及截短的三羧酸循环（TCA 循环）5。截短的 TCA 循环通过提高琥珀酸和柠檬酸水平，驱动一氧化氮（NO）的生成，从而促进寄生虫清除机制3。由 SDHA 介导的琥珀酸积累可激活转录因子缺氧诱导因子1-α（HIF-1α），进而诱导 IL-1β 的产生8。在 M2 表型中，可观察到脂肪酸氧化、谷氨酰胺利用增加以及葡萄糖的氧化磷酸化增强，同时伴有抗炎性细胞因子的产生，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）3。M2 型巨噬细胞以线粒体延长为显著特征，从而提高能量生成效率。它们利用脂肪酸、葡萄糖和谷氨酰胺作为底物驱动 TCA 循环，通过更高效的氧化磷酸化生成 ATP，以促进寄生虫的生长与增殖9。负责通过截短 TCA 循环积累琥珀酸的 SDHA 酶不仅可促进 NO 的生成，还可通过电子传递链启动琥珀酸依赖性的氧气消耗10。在利什曼原虫感染的巨噬细胞中，SDHA 的表达水平下调了 2.17 倍，提示有氧呼吸可能也受到抑制11。为了增加琥珀酸的消耗，诱导促炎性细胞因子介导的 NO 生成并促进寄生虫清除，SDHA 的表达至关重要。
该合成回路可提供精准靶向治疗，可能改变病变系统，实现双稳态振荡，从而在时空水平上恢复健康表型。合成回路的递送与表达使系统具备动态性和鲁棒性。推动合成生物学发展的一个关键因素在于能够以模块化方式组装基因元件和功能单元，从而构建复杂的结构并实现定制化的功能12。传统表达技术相关的局限性促使基于四环素操纵子的可诱导质粒合成回路应运而生，从而实现质粒的快速评估以及在多种细胞类型中的高效递送13。四环素响应阻遏蛋白（TetR）以二聚体形式存在时，对四环素操纵子（TetO）具有强结合亲和力，可有效抑制转录。然而，当其与配体强力霉素（dox）结合后，TetR发生构象改变，从而从TetO上解离，继而允许转录无障碍进行。该回路可实现对蛋白质翻译的调控14。因此，通过既定方法，设计出基于四环素操纵子的可诱导质粒合成回路，可在pEGFP-N1载体中表达SDHA。对回路转化效率及其产物的评估有助于了解递送的有效性。通过载体的限制性酶切，验证了克隆效率。此外，观察了转染后的RAW264.7小鼠巨噬细胞系（源自Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞）在强力霉素剂量依赖下的绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。同时，转染细胞中寄生虫清除效应与合成回路的表达相互印证。此外，在转染并诱导合成回路的细胞中，随着感染时间点的延长，促炎性细胞因子的诱导与表达亦被观察到，这直接关联于合成回路的功能发挥。

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;L 吸头</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X 限制性酶切缓冲液</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>限制性酶切</td></tr><tr><td>1mL 吸头</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 吸头</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm² 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>50mL 离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt 青色/橙色上样缓冲液</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳上样</td></tr><tr><td>96 孔玻底培养板</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>用于共聚焦成像和转染</td></tr><tr><td>96 孔平底微量检测板</td><td>Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳装置</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>细菌用层流洁净台</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>用于转化实验</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>细胞培养用层流洁净台</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>涂布棒</td><td>Fischer Scientific</td><td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>适用于 1.5mL 离心管的离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>适用于 50mL 离心管的离心机</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>CO₂ 培养箱</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>质粒浓度测定</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 凝胶成像系统</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>DEPC 处理水 1000 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>用于转染细胞的诱导表达</td></tr><tr><td>干式加热块</td><td>Labnet</td><td></td><td>用于转化及限制性内切酶失活</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>国家细胞科学中心</td><td></td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>Evos 明场显微镜</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td>用于合成回路构建</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>FV31S-SW 软件</td><td>Olypmus</td><td></td><td>图像采集</td></tr><tr><td>遗传霉素</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>克隆用 Gibson 组装法</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>合成回路构建</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>统计分析</td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>用于转化及菌落筛选</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>用于培养 &lt;em&gt;E.coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>Micro Filt 垂直层流洁净台</td><td>Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 快速 8 管条，0.1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>用于 qRT-PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 8 孔盖条</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>用于 qRT-PCR</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&amp;gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>TaqMan 探针</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>TaqMan 探针</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>TaqMan 探针</td></tr><tr><td>小鼠 IL-10 ELISA 试剂盒</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>用于 ELISA</td></tr><tr><td>小鼠 IL-12 ELISA 试剂盒</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>用于 ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky 触摸屏酶标仪 + &amp;mu;Drop 板</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>用于 ELISA</td></tr><tr><td>MX-M 微孔板混匀器，96 孔细胞培养板混匀器，转速可调 0-1500 rpm，实验室摇床振荡器</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>国家生物技术信息中心</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td>用于合成回路构建</td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer 计数室）</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>无通气口 25cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;培养瓶</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>用于寄生虫培养</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>试剂配制</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 软件</td><td>Olypmus</td><td></td><td>图像处理</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>用于共聚焦成像</td></tr><tr><td>OPTI-MEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>转染用培养基</td></tr><tr><td>携带合成回路的 pEGFP-N1 载体（已克隆）</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15070063</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Fischer Scientific</td><td>YBP364500</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>电源装置</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>标准生物元件注册库</td><td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>用于合成回路构建</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12091021</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基</td><td>国家细胞科学中心</td><td></td><td>用于寄生虫培养</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>用于培养 &lt;em&gt;E.coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>质粒浓度测定</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Plus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Life technologies</td><td>272006777</td><td>用于 qRT-PCR</td></tr><tr><td>StepOne 软件版本 2.3</td><td>Life technologies</td><td></td><td>用于 qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X)，不含 AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker Cell</td><td></td><td></td><td>合成回路构建与模拟</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准分子量标记</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>Tris-乙酸-EDTA 缓冲液</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>缓冲液/试剂配制</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>限制性内切酶</td></tr></tbody></table>

感染中的免疫代谢回路推动宿主导向治疗的发展

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

免疫代谢是利什曼病进展的关键决定因素。基于合成生物学的方法因其能够靶向驱动利什曼病的宿主相关因子，作为治疗干预的一种策略，已受到广泛关注。合成生物学以正交且模块化的方式对遗传元件进行工程化设计，从而精确调控生物系统，并赋予细胞新的功能。本研究旨在阐明一种系统性流程，用于开发基于可诱导四环素调控（TetON）的合成基因线路，以递送琥珀酸脱氢酶作为治疗剂，促进清除细胞内Leishmania寄生虫。文中所述方案详细描述了合成基因线路的设计及其后续验证过程。该策略还聚焦于将合成基因线路整合至质粒骨架中作为递送载体。此外，采用基于聚复合物纳米颗粒的递送系统，在不破坏细胞形态的前提下，将合成基因线路递送至小鼠巨噬细胞系。本研究对转染细胞的筛选及合成基因线路表达的最佳诱导浓度进行了方法学标准化。观察结果显示，与感染细胞相比，转染细胞内的寄生虫负荷显著降低。在转染并诱导合成基因线路的细胞中，感染后表达促炎性细胞因子，作为促进寄生虫清除的机制之一。这凸显了基于合成生物学的方法通过靶向与疾病进展相关的宿主因子，在利什曼病治疗中的强大潜力。

合成回路中遗传元件的排列方式以及该合成回路的表达结构如（图1A）所示。相应的元件以正交且模块化的方式克隆至pEGFP-N1载体中，如图1B所示。对合成回路的模拟结果显示，SDHA和四环素阻遏蛋白（TetR）均呈现振荡动力学行为。该结果提示二者存在一种以周期性波动函数为特征的相互表达模式。SDHA浓度的升高可能归因于多西环素的诱导作用，而TetR的表达则可能源于多西环素浓度的下降（图1C）。鉴于在in silico模拟中观察到SDHA与TetR的可诱导振荡表达，本研究设计并实施了通过pEGFP-N1质粒载体递送该合成回路的策略。
本研究中鉴定的 iGEM 部件包括：TetO 对应 BBa_K1493803，Kozak 序列对应 BBa_K4344028，TetR 对应 BBa_C0040，P2A 对应 BBa_K1537016。SDHA 的 NCBI 登录号为 NM_025848。这些元件被组装成一个总长为 1317 个碱基对的多西环素诱导型 TetON 合成回路（补充文件 1）。由于 TetO 作为 DNA 调控元件发挥作用，其序列无需翻译。选择位于 Kozak 序列下游、从 5' 端 TetR 延伸至 P2A 3' 末端并在 SDHA 下游定位的序列，用于进行 in silico 翻译验证。分析结果显示该序列中不存在内部终止密码子，确保了整个序列长度上的连续翻译（补充文件 2）。该 1317 bp 合成回路的调控元件被插入至 NotI 与 XhoI 限制性酶切位点之间，位于 EGFP 的 5' 上游（图 1B）。测序结果表明插入片段已在质粒中成功克隆（Supplementary File 3）。
将免疫-代谢回路引入 E. coli DH5α菌株导致转化菌落的生长，这些菌落表现出对卡那霉素的抗性，该抗生素在细菌转化过程中用作选择标记。选择平板上转化菌落数量丰富，表明感受态细胞具有较高的转化潜能，反映出所采用转化方案的高效性。图1D).
挑取单个菌落接种于 10 mL 含卡那霉素的 LB 培养基中，用于质粒的提取。10 mL 培养液所得质粒产量详见表 1。本实验采用标准方法进行质粒提取。缓冲液于质粒提取前一日新鲜配制，培养条件经过优化以最大化质粒产量。所得质粒浓度超过 1 µg/µL，260/280 和 260/230 比值分别超过 1.8 和 2.0。这些结果表明，所提取的质粒纯度较高，无蛋白质、EDTA、碳水化合物和苯酚等污染物残留。
对分离的合成回路进行了电泳迁移率偏移分析。使用NotI和XhoI限制性内切酶进行限制性酶切消化，因为这两个酶切位点是合成回路插入的位置。在1%琼脂糖凝胶上观察到两条条带，一条位于约1500 bp处，另一条位于4 kb至5 kb之间。由于插入片段大小为1317 bp，因此1500 bp处的条带很可能对应插入片段。pEGFP-N1载体的大小为4.7 kb，因此5 kb附近的条带推测为pEGFP-N1载体。由此推断，递送载体中含有完整且未受损的合成回路。此外，在未消化的完整合成回路中检测到一条约6 kb的条带，表明pEGFP-N1载体在质粒中携带了一个约1.3 kb的插入片段（图1E）。
<img alt="合成基因线路图、质粒图谱、细菌培养平板、凝胶电泳、数据图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1合成回路的设计与验证 (A) 通过遗传元件和调控组分的组装来构建合成回路的示意图。B确定性模拟图显示 SDHA 和 TetR 在 100 个时间单位时的周期性表达。C) 合成回路转化的菌落 E. coli 对卡那霉素耐药的DH5α。该单位为100倍单位，因为这是确定性模拟。D使用 NotI 和 XhoI 限制性内切酶对完整及经限制性消化的合成基因线路进行琼脂糖凝胶电泳。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>质粒浓度 (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：质粒提取后获得的合成电路构建体的产量。 该表格显示了质粒的浓度（µg/mL）及其260/280和260/230比值。
在对照组和感染细胞中，GFP的荧光强度均较低。然而，在IMT细胞中转染质粒与PEI以1:1比例组成的合成回路，并添加500 µg/mL G418及1 µg/µL多西环素（dox）诱导后，观察到GFP表达显著升高。在6小时IMTI细胞中，GFP表达也明显更高，尽管其表达水平低于IMT样本（图2A，B）。此外，在12小时IMTI、18小时IMTI和24小时IMTI样本中，GFP表达进一步增加。这种增加可能与感染时间延长有关，后者可能诱导了巨噬细胞更显著的代谢改变17。随着感染时间延长，细胞内SDHA水平也可能受到影响18。由于在这些IMTI样本中添加了dox，通过合成回路可能提高了SDHA水平，从而导致SDHA表达增加。
通过 DAPI 染色鉴定巨噬细胞内寄生虫的数量。在感染 L. major 6 小时的巨噬细胞中，每个巨噬细胞内的胞内寄生虫数量为 6 个，高于 IMTI 样本在 6 小时时每个巨噬细胞内 1-2 个胞内寄生虫的数量。转染并经多西环素诱导后，在感染的不同时间点均观察到胞内寄生虫负荷显著减少（图 2C）。观察结果表明，合成回路可能通过激活 SDHA 表达诱导了清除寄生虫的效果。
<img alt="RAW264.7细胞感染分析；荧光显微镜，强度柱状图；DAPI，488 nm通道。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：共聚焦激光扫描显微镜分析。对照组、感染组、IMT组和IMTI组样本的图像。(A) 所有实验样本中GFP表达情况，比例尺分别为：对照组50 µm，感染6 h组和IMT组50 µm，IMTI 6 h组20 µm，IMTI 12 h组、18 h组、24 h组均为10 µm。使用的通道包括DIC、DAPI、GFP，以及所有通道的合并图像。(B) 对所有实验样本（n=3）进行GFP表达的一维方差分析（One-way ANOVA），并采用Tukey校正检验（p &lt; 0.05视为具有显著性差异）。误差线表示标准差。(C) 对(A)中各组样本的100个巨噬细胞内的寄生虫载量进行一维方差分析（One-way ANOVA）并采用Tukey校正检验（n=3）（p &lt; 0.05视为具有显著性差异），误差线表示标准差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
检测所有样本培养基中 IL-10 和 IL-12 的水平显示，感染后 6 h 时 IL-10 和 IL-12 的浓度最高，感染 24 h 后细胞因子水平下调。转染并诱导合成回路后，IL-10 和 IL-12 水平未表现出显著差异。IMTI 时间点样本中 IL-10 和 IL-12 水平也无显著差异（图 3）。已有文献报道感染 6 h 的样本中 IL-10 和 IL-12 表达升高19,20，而本研究观察到 IL-10 和 IL-12 水平无显著变化，促使我们进一步探究合成回路对其他细胞因子的影响。
<img alt="IL-10 和 IL-12 水平的柱状图；细胞因子浓度分析；p 值&lt;0.0001。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过 ELISA 检测 IL-10 和 IL-12，以确定其在不同样本培养基中的分泌水平。 样本（n=2）包括对照组、感染6小时组、感染24小时组、IMT组、IMTI 6小时组、IMTI 12小时组、IMTI 18小时组、IMTI 24小时组。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）并进行Tukey校正检验分析（p &lt;.05 认为具有显著性）。误差线表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在感染6小时、IMT以及24小时IMTI样本中检测TNF-α、IFN-γ和TGF-β的转录水平发现，与感染组和IMT样本相比，24小时IMTI样本中TNF-α显著上调至2.5倍（图4）。在24小时IMTI样本中，IFN-γ水平较感染组和IMT样本升高了35倍。尽管TGF-β在24小时IMTI样本中也显著上调至1.5倍，但其相对倍数变化低于TNF-α和IFN-γ，表明在24小时IMTI样本中促炎性细胞因子显著上调。
<img alt="条形图比较不同感染处理下TNF-α、IFN-γ、TGF-β的相对倍数变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：细胞因子的qRT-PCR分析。 （A）TNF-α、（B）IFN-γ 和 （C）TGF-β 在感染6小时、IMT及24小时IMTI样本中的表达（n=2）。采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Tukey校正检验（p &lt; 0.05 视为具有显著性）。误差线表示标准偏差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件1：组装成合成线路的遗传元件的核苷酸序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：表达 TetR、P2A 和 SDHA 的合成线路的翻译序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：克隆至 pEGFP-N1 质粒中的合成线路的测序结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种设计、构建和递送基于四环素调控的可诱导合成回路的实验方案。通过利用本方案所提供的技术流程，可研究合成回路对寄生虫清除及细胞因子表达的影响。该方案适用于从事感染性疾病中基于合成回路治疗研究的科研人员。

免疫代谢是利什曼病进展的关键决定因素。基于合成生物学的方法已受到广泛关注，作为一种……

系统生物学有助于深入理解感染模型中的生物网络与机制，而合成生物学则能够实现精准治疗。我们正在探索利什曼原虫（Leishmania major）感染中的免疫代谢过程，以及生物合成回路在疾病消退中的潜力，从而革新免疫疗法。近年来，合成生物学在开发新型且有效的抗利什曼病策略方面展现出巨大前景。近期的一些研究进展涉及工程化合成细胞因子、双稳态合成回路CRISPR-Cas9，以及作为治疗手段的合成肽。我们的实验方案针对的是宿主蛋白，该蛋白被寄生虫调控以维持其生存。因此，我们不仅研究该回路对寄生虫的影响，也研究其对宿主的影响。此外，我们研究了合成回路在递送至宿主后对正交性和模块化功能的影响。首先，在计算机上打开 TinkerCell 软件，点击“parts”标签。从元件库中选择 CMV 启动子组件，并将其放置在画布上，以表示合成回路中的巨细胞病毒启动子。然后在画布上获取与四环素操纵子类似的阻遏蛋白结合位点，并将其放置在启动子附近，与CMV启动子相连接。将内部核糖体进入位点和编码区拖放到画布上，并与已有的遗传元件整合。将编码区重命名为四环素响应性阻遏蛋白。合并这些遗传元件以促进合成元件的构建。在画布上添加一段可被猪捷申病毒12A切割的间隔区。引入一个额外的编码区域，即琥珀酸脱氢酶（SDHA），作为合成构建体中的目的基因，并将其与其他元件整合在一起。在 SDHA 编码区的邻近位置，插入另一段可被细胞蛋白酶猪捷申病毒 12A 切割的间隔区。引入代表报告基因的编码区，并将其标记为 GFP。在 GFP 旁边，添加一个终止子。为了验证功能性基因回路的形成，点击回路的任意部分。点击后，该回路将显示为红色。在反应选项卡中，为四环素响应性阻遏蛋白、SDHA 和 GFP 分配调控速率，以界定合成回路内的翻译反应。从部件选项卡中添加一个小分子，并将其命名为 doxycycline。为了给 doxycycline 分配一个波函数，进入部件与连接选项卡，选择输入，然后点击波输入。在反应选项卡中，点击抑制反应。将多西环素（dox）与四环素响应阻遏蛋白之间的反应速率拖放到画布上。要设置多西环素（dox）与四环素响应阻遏蛋白之间的反应动力学，可双击多西环素（dox）上的波形函数图标，并将 doxycycline.sin. amplitude 调整为 10。为了实现四环素响应阻遏蛋白与阻遏蛋白结合位点之间的转录调控反应，从反应选项卡中选择该反应，并将其放置在四环素响应阻遏蛋白与四环素操纵子之间的画布区域。双击各个组分和反应，以设置模拟的初始浓度和参数。点击模拟，选择确定性模拟方法，并对电路进行100个时间单位的模拟。通过控制面板调整模拟图，观察SDHA和四环素响应抑制蛋白的图形模式。打开标准生物元件注册库，点击搜索并输入遗传组分的名称。为获取CMV启动子的核苷酸序列，点击获取元件序列，并将文件保存为文本文件。为了获得 SDHA 的蛋白质编码序列，打开 NCBI 网站，在搜索框旁边的下拉菜单中选择“核苷酸”。在搜索框中输入 succinate dehydrogenase 和 Mus musculus，以查找核苷酸序列。点击 CDS 选项，获取 SDHA 的编码序列，并将该序列保存到文本文件中。将所有遗传调控元件的核苷酸序列依次合并到一个文件中。在Kozak序列之后紧接添加起始密码子ATG，并去除内部的终止密码子，以避免新生多肽的形成。打开Expasy网站，粘贴该核苷酸序列。点击“翻译序列”选项，然后选择5'至3'第一阅读框，并去除终止密码子。首先，在37摄氏度下培养RAW264.7细胞，直至细胞融合度达到90%。准备以下样品，以确定所诱导的合成回路对寄生虫的清除效果。从25平方厘米的培养瓶中刮取RAW264.7细胞。将细胞悬液在300G条件下离心5分钟，并将沉淀重悬于1毫升完全DMEM培养基中。取10微升重悬的细胞悬液转移至100微升的离心管中。向细胞中加入 10 µL 的 0.5%台盼蓝溶液，充分混匀。取 10 µL 细胞与台盼蓝混合液加入细胞计数板，从四个计数区域获取细胞数量。将细胞以每孔 2 × 10⁴ 个的密度接种于盖玻片底 96 孔板中，每孔重复两份，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。为制备感染六小时的样品，取1毫升处于静止期的利什曼原虫（Leishmania major）前鞭毛体，以7,273G离心10分钟，然后将沉淀重悬于500微升DMEM完全培养基中。计数后，将2×10⁵个L. major前鞭毛体加入载玻片底96孔板中。在37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中孵育六小时。孵育后，用PBS洗涤细胞三次。为制备IMT和IMTI样品，将两份10的5次方个L. major前鞭毛体分别培养6、12、18和24小时。在1.5毫升离心管中加入24微升低血清培养基和1微克合成回路质粒。在另一个1.5毫升离心管中，加入24微升低血清培养基和1微升聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）。用移液器反复吹打至少10次以充分混匀，并在室温下孵育5分钟。将PEI混合物转移至含有DNA的1.5毫升离心管中，充分混匀。将离心管孵育10分钟。弃去96孔盖玻片底板各孔中的培养基，用PBS洗涤细胞3次。使用移液器将DNA-PEI混合物逐滴加入细胞中，并轻轻摇动培养板。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。随后，向细胞中加入200 µL新鲜的低血清培养基，轻轻摇动培养板，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。次日，弃去培养基。用 PBS 洗涤细胞两次后，向细胞中加入含有遗传霉素和多西环素的 DMEM 完全培养基，并培养 24 小时。合成回路的模拟显示 SDHA 和四环素阻遏蛋白均表现出振荡动力学特性。将合成回路导入 Escherichia coli DH5-alpha 后，获得了对卡那霉素具有抗性的转化菌落，表明转化效率较高。使用合成回路转染并用多西环素诱导后，IMT细胞中GFP的表达随时间显著增加。转染并诱导合成回路后，感染的巨噬细胞内寄生虫负荷显著降低。感染后6小时，白细胞介素10和白细胞介素12的细胞因子水平最高，转染并诱导合成回路后，这些细胞因子水平无显著差异。在24小时IMTI样本中观察到肿瘤坏死因子α、γ-干扰素和转化生长因子β显著升高，表明促炎性细胞因子的表达上调。

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