感染中的免疫代谢回路推动宿主导向治疗的发展

系统生物学有助于深入理解感染模型中的生物网络与机制，而合成生物学则能够实现精准治疗。我们正在探索利什曼原虫（Leishmania major）感染中的免疫代谢过程，以及生物合成回路在疾病消退中的潜力，从而革新免疫疗法。近年来，合成生物学在开发新型且有效的抗利什曼病策略方面展现出巨大前景。

近期的一些研究进展涉及工程化合成细胞因子、双稳态合成回路CRISPR-Cas9，以及作为治疗手段的合成肽。我们的实验方案针对的是宿主蛋白，该蛋白被寄生虫调控以维持其生存。因此，我们不仅研究该回路对寄生虫的影响，也研究其对宿主的影响。

此外，我们研究了合成回路在递送至宿主后对正交性和模块化功能的影响。首先，在计算机上打开 TinkerCell 软件，点击“parts”标签。从元件库中选择 CMV 启动子组件，并将其放置在画布上，以表示合成回路中的巨细胞病毒启动子。

然后在画布上获取与四环素操纵子类似的阻遏蛋白结合位点，并将其放置在启动子附近，与CMV启动子相连接。将内部核糖体进入位点和编码区拖放到画布上，并与已有的遗传元件整合。将编码区重命名为四环素响应性阻遏蛋白。

合并这些遗传元件以促进合成元件的构建。在画布上添加一段可被猪捷申病毒12A切割的间隔区。引入一个额外的编码区域，即琥珀酸脱氢酶（SDHA），作为合成构建体中的目的基因，并将其与其他元件整合在一起。

在 SDHA 编码区的邻近位置，插入另一段可被细胞蛋白酶猪捷申病毒 12A 切割的间隔区。引入代表报告基因的编码区，并将其标记为 GFP。在 GFP 旁边，添加一个终止子。

为了验证功能性基因回路的形成，点击回路的任意部分。点击后，该回路将显示为红色。在反应选项卡中，为四环素响应性阻遏蛋白、SDHA 和 GFP 分配调控速率，以界定合成回路内的翻译反应。

从部件选项卡中添加一个小分子，并将其命名为 doxycycline。为了给 doxycycline 分配一个波函数，进入部件与连接选项卡，选择输入，然后点击波输入。在反应选项卡中，点击抑制反应。

将多西环素（dox）与四环素响应阻遏蛋白之间的反应速率拖放到画布上。要设置多西环素（dox）与四环素响应阻遏蛋白之间的反应动力学，可双击多西环素（dox）上的波形函数图标，并将 doxycycline.sin. amplitude 调整为 10。

为了实现四环素响应阻遏蛋白与阻遏蛋白结合位点之间的转录调控反应，从反应选项卡中选择该反应，并将其放置在四环素响应阻遏蛋白与四环素操纵子之间的画布区域。双击各个组分和反应，以设置模拟的初始浓度和参数。点击模拟，选择确定性模拟方法，并对电路进行100个时间单位的模拟。

通过控制面板调整模拟图，观察SDHA和四环素响应抑制蛋白的图形模式。打开标准生物元件注册库，点击搜索并输入遗传组分的名称。为获取CMV启动子的核苷酸序列，点击获取元件序列，并将文件保存为文本文件。

为了获得 SDHA 的蛋白质编码序列，打开 NCBI 网站，在搜索框旁边的下拉菜单中选择“核苷酸”。在搜索框中输入 succinate dehydrogenase 和 Mus musculus，以查找核苷酸序列。点击 CDS 选项，获取 SDHA 的编码序列，并将该序列保存到文本文件中。

将所有遗传调控元件的核苷酸序列依次合并到一个文件中。在Kozak序列之后紧接添加起始密码子ATG，并去除内部的终止密码子，以避免新生多肽的形成。打开Expasy网站，粘贴该核苷酸序列。

点击“翻译序列”选项，然后选择5'至3'第一阅读框，并去除终止密码子。首先，在37摄氏度下培养RAW264.7细胞，直至细胞融合度达到90%。准备以下样品，以确定所诱导的合成回路对寄生虫的清除效果。

从25平方厘米的培养瓶中刮取RAW264.7细胞。将细胞悬液在300G条件下离心5分钟，并将沉淀重悬于1毫升完全DMEM培养基中。取10微升重悬的细胞悬液转移至100微升的离心管中。

向细胞中加入 10 µL 的 0.5%台盼蓝溶液，充分混匀。取 10 µL 细胞与台盼蓝混合液加入细胞计数板，从四个计数区域获取细胞数量。将细胞以每孔 2 × 10⁴ 个的密度接种于盖玻片底 96 孔板中，每孔重复两份，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。

为制备感染六小时的样品，取1毫升处于静止期的利什曼原虫（Leishmania major）前鞭毛体，以7,273G离心10分钟，然后将沉淀重悬于500微升DMEM完全培养基中。计数后，将2×10⁵个L. major前鞭毛体加入载玻片底96孔板中。在37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中孵育六小时。

孵育后，用PBS洗涤细胞三次。为制备IMT和IMTI样品，将两份10的5次方个L. major前鞭毛体分别培养6、12、18和24小时。在1.5毫升离心管中加入24微升低血清培养基和1微克合成回路质粒。

在另一个1.5毫升离心管中，加入24微升低血清培养基和1微升聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）。用移液器反复吹打至少10次以充分混匀，并在室温下孵育5分钟。将PEI混合物转移至含有DNA的1.5毫升离心管中，充分混匀。

将离心管孵育10分钟。弃去96孔盖玻片底板各孔中的培养基，用PBS洗涤细胞3次。使用移液器将DNA-PEI混合物逐滴加入细胞中，并轻轻摇动培养板。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。随后，向细胞中加入200 µL新鲜的低血清培养基，轻轻摇动培养板，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。次日，弃去培养基。

用 PBS 洗涤细胞两次后，向细胞中加入含有遗传霉素和多西环素的 DMEM 完全培养基，并培养 24 小时。合成回路的模拟显示 SDHA 和四环素阻遏蛋白均表现出振荡动力学特性。将合成回路导入 Escherichia coli DH5-alpha 后，获得了对卡那霉素具有抗性的转化菌落，表明转化效率较高。

使用合成回路转染并用多西环素诱导后，IMT细胞中GFP的表达随时间显著增加。转染并诱导合成回路后，感染的巨噬细胞内寄生虫负荷显著降低。感染后6小时，白细胞介素10和白细胞介素12的细胞因子水平最高，转染并诱导合成回路后，这些细胞因子水平无显著差异。

在24小时IMTI样本中观察到肿瘤坏死因子α、γ-干扰素和转化生长因子β显著升高，表明促炎性细胞因子的表达上调。