Name: 通过剖腹手术对后备母猪进行胚胎移植手术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 了解通过剖腹手术对后备母猪进行胚胎移植的详细操作流程。本方法涵盖术前准备、手术步骤及术后护理，为培育基因修饰猪提供可靠技术支持。

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我们感谢巴西圣保罗大学兽医学院（FMVZ/USP）的马科动物兽医医院和反刍动物兽医医院、圣保罗研究基金会（FAPESP，资助号 2022/11459-3）、EMS Pharma 公司、国家科学技术发展委员会（CNPq，资助号 405254/2022-9）以及位于巴西圣保罗州伊图市的 Água Branca 猪场。

本研究经巴西圣保罗大学兽医与动物科学学院动物研究使用伦理委员会批准，方案编号为6088030523。实验使用了9头来自巴西圣保罗州伊图市Água Branca核心猪场的7月龄后备母猪，在第二次发情检测后立即投入使用9。研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 动物准备
<ol>
	<li>术前禁食动物12小时，并限制饮水4小时。</li>
	<li>使用40 mm × 12 mm针头，将10 mg/kg的氯胺酮和0.2 mg/kg的咪达唑仑抽入同一支50 mL注射器中。将注射器连接至静脉输液装置，以便给药，同时保持与动物的安全距离，使其能够自由活动。</li>
	<li>给予麻醉前用药 通过 注射至外耳道后方的斜方肌内</li>
	<li>用20 G导管穿刺耳缘静脉，并连接至宏观输液装置，术中以0.9% NaCl溶液按10 mL/kg/h速率进行液体治疗。</li>
	<li>以4 mg/kg的丙泊酚静脉注射诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。</li>
	<li>使用喉镜和带套囊的9号气管插管对动物进行经口插管10.</li>
	<li>使用1.5%至2%异氟烷吸入维持麻醉。同时通过评估生理参数监测麻醉深度，包括心率（应维持在每分钟100至120次）、血氧饱和度（应保持在99%至100%）、肌肉松弛程度、有无自主运动以及反射反应。 
	注意：应监测并控制体温，保持在37.5–38.5 °C之间。必要时，除异氟烷外，可使用丙泊酚以维持参数稳定。盐酸芬太尼应以每20分钟0.02 mg/kg的剂量作为镇痛剂给药。所有参数应每5分钟记录一次。</li>
	<li>术前镇痛采用静脉注射单次剂量0.002 mg/kg的芬太尼，以及肌肉注射4 mg/kg的盐酸曲马多，注射部位为臀肌或斜方肌。</li>
	<li>将心脏电极置于胸部区域，用于术中监测心率。每5分钟记录一次心率、直肠温度和血氧饱和度。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
	<li>将母猪置于手术台上，呈仰卧位。</li>
	<li>用手术手套覆盖动物的四肢，以尽量减少手术区域的污染。</li>
	<li>使用手术剪在倒数第二对乳腺之间去除腹部腹侧的毛发。</li>
	<li>使用浸有氯己定的消毒刷，从脐部瘢痕区域向最后一对乳腺进行环形擦拭，完成术前皮肤消毒。随后用干净的湿敷料擦去氯己定。</li>
	<li>确保外科医生和助手进行外科消毒，并在手术期间穿戴无菌手术衣和手套。 
	注意：动物应在与手术区域分开的准备区进行手术前准备。</li>
	<li>在手术台上准备好下列已适当消毒的手术器械 材料表.</li>
	<li>使用无菌纱布和氯己定消毒剂对最终手术区域进行消毒，从切口部位开始，以鱼骨状模式向两侧扩展清洁。</li>
	<li>用氯己定消毒剂重复此操作三次，然后使用酒精氯己定重复该操作。</li>
	<li>用无菌手术巾完全覆盖动物，若手术巾无预开窗口，则使用剪刀在手术巾上剪出一个约10 × 20 cm²的矩形开口。</li>
	<li>将手术巾覆盖在倒数第二对腹股沟乳腺上，使用4个巴考夹将手术巾固定在动物皮肤上。</li>
	<li>使用手术刀切开皮肤，形成一条长约10 cm的切口。</li>
	<li>使用止血钳和/或2号可吸收缝线实现皮下血管的止血。</li>
	<li>用手指或精细尖头剪刀分离皮下组织，加深切口以到达目标位置 白线 在腹部肌肉组织中。 
	注意：触诊腹部正中线，可感觉到腹白线为较坚韧且呈纤维性的区域；观察腹直肌的分离情况，并在解剖过程中注意组织质地的变化，以识别该结构 白线 准确地11.</li>
	<li>用艾利斯钳夹住肌肉组织并提起，进行穿刺切开 白线 用手术刀。</li>
	<li>将示指插入切口以评估有无粘连。使用钝头/钝头或精细/钝头剪刀，沿中线白线向尾侧和头侧小心延长切口，注意避免损伤其他器官及深层结构。</li>
	<li>切口长度应足以使术者的一只手能够进入腹腔，以定位并牵出子宫角和/或卵巢。可使用Gosset拉钩以方便进入腹腔，并在手术结束时便于将肌肉层单层缝合。</li>
	<li>如果一侧子宫角位于卵巢前方，应轻柔地沿其走向追踪至子宫角尖端及同侧卵巢。在此过程中，需评估子宫内是否存在液体，因为液体可能影响妊娠。</li>
	<li>找到卵巢后，轻轻牵拉并小心暴露。评估是否存在排前卵泡、出血性黄体、周期性黄体和白体，以判断后备母猪的同步化是否符合预期。</li>
	<li>轻柔地移除覆盖卵巢的输卵管伞部，外翻其黏膜，并找到输卵管的开口。&#160; 
	注意：&#160;如果术者难以辨认输卵管伞端的开口，可使用圆体缝合针在输卵管壶腹部创建一个口袋，注意避免刺破血管，以便插入含有胚胎的Tomcat导管。</li>
	<li>将装有胚胎的Tomcat导管小心插入输卵管伞部的开口，直至到达输卵管壶腹部。</li>
	<li>将1 mL注射器连接至Tomcat导管，将含有胚胎的液体推入输卵管。用伞部覆盖卵巢，并将其放回腹腔。</li>
	<li>找到对侧子宫角和卵巢，重复步骤 2.17–2.21。</li>
	<li>将腹腔内的结构复位，并加入1 L预热至39 °C的生理盐水或乳酸林格液，以预防粘连，然后开始关腹缝合。</li>
	<li>用2号可吸收缝线缝合腹部肌肉组织 &#34;X&#34; 间断缝合（Sultan）</li>
	<li>使用2号可吸收缝线，以连续水平褥式缝合法缝合皮下组织。</li>
	<li>使用2号尼龙缝线行间断单纯缝合、外科缝钉或乙基氰基丙烯酸酯粘合剂关闭皮肤。在本操作中，我们选择使用粘合剂。</li>
	<li>用浸有双氧水的纱布清洁手术伤口，并用敷料擦干，以增强手术粘合剂在伤口上的固定效果。涂抹利福霉素或皮尔逊软膏，覆盖纱布，最后使用手术粘合剂。 
	注意：伤口应保持闭合并覆盖敷料5天。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>根据Luna等人提出的评分标准12，至少在术后连续3天内评估动物是否出现特征性临床疼痛表现。 
	注：该评分标准基于猪在不同疼痛程度下表现出的不同行为，如姿势、与环境的互动和兴趣、活动能力、食欲以及对受损区域的关注程度。每项评估参数的评分范围为0至3分。评估结束后，各项得分的总和反映动物所经历的疼痛强度，其中0分表示无疼痛，18分表示剧烈疼痛12。</li>
	<li>作为术后护理，每天一次通过肌肉注射（臀部或颈部肌肉）给予15 mg/kg剂量的阿莫西林和0.4 mg/kg剂量的2%美洛昔康，连续使用3天，以预防疼痛、炎症反应和感染。 
	注：若动物在所用疼痛评分量表（评分范围0–18）上的得分大于或等于6分，则需在抗炎药和抗生素基础上，额外每天一次肌肉注射（臀部或颈部肌肉）5,000 mg/头的安乃近。或者，按照当地IACUC指南规定的镇痛方案进行镇痛处理。</li>
	<li>术后第6天，去除手术粘合剂，使用浸有2%酒精氯己定溶液的纱布清洁伤口，并局部涂抹Pearson软膏，持续至第10天，此时建议拆除缝线或手术钉（如使用过）。</li>
</ol>
4. 妊娠的超声诊断
<ol>
	<li>在胚胎移植手术后30天，使用超声设备（频率范围为4.5至8.5 MHz）进行经腹妊娠超声评估。</li>
	<li>将超声耦合剂涂抹于探头，并将其置于腹股沟腹部区域附近，探头朝向内侧。 
	注：由于子宫腔内有液体存在，可观察到圆形无回声的胚胎囊泡，提示妊娠。若未观察到宫腔内液体，或&#160;虽有宫腔内液体但未能清晰显示胚胎囊泡，则提示未发生妊娠。</li>
</ol>
5. 动物安乐死
注意：&#160;对超声检查中未见符合妊娠周期大小和形态的胎儿的后备母猪实施安乐死。
<ol>
	<li>使用40 mm × 12 mm针头，将15 mg/kg的氯胺酮和2 mg/kg的咪达唑仑抽入连接静脉输液装置的同一支50 mL注射器中，作为麻醉前用药，经肌肉注射至外耳道后方颈区的斜方肌部位。</li>
	<li>用20 G导管穿刺耳缘静脉，以4 mg/kg剂量静脉推注丙泊酚进行麻醉诱导，直至出现心动过缓（遵循机构批准的操作规程）。</li>
	<li>随后，静脉注射10至20 mL的19.1%氯化钾溶液。通过观察呼吸运动消失、黏膜苍白、角膜反射消失，并用听诊器置于心脏区域确认心音消失，以判定心肺停止。</li>
	<li>从剖检后的雌性动物中采集任何类型的宫内内容物（胚胎组织、液体或黏液分泌物）13，送检进行微生物学分析以检测可能的病原体，必要时也用于克隆的基因型鉴定。肉眼检查黄体是否存在、卵巢囊肿、异常分泌物，以及子宫、卵巢和输卵管是否存在粘连14。</li>
</ol>

Optimizing Oviductal Embryo Transfer in Cloned Pigs

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<li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+pigs+for+xenotransplantation%3A+Hopes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).</li>
<li>Chen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pigs+from+porcine+embryos+generated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Production of pigs from porcine embryos generated in vitro.</a> Front Anim Sci. 3, 826324(2022).</li>
<li>Wieczorek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laparoscopic+embryo+transfer+in+pigs+-+comparison+of+different+variants+and+efficiencies+of+the+method%5BTitle%5D)+AND+%22Pol+J+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method.</a> Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).</li>
<li>Martinez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+development%2C+and+application+of+a+non-surgical+deep+uterine+embryo+transfer+technique+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs.</a> Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).</li>
<li>Wieczorek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+in+minimally+invasive+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A new concept in minimally invasive embryo transfer.</a> Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).</li>
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<li>Chen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pigs+from+porcine+embryos+generated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Production of pigs from porcine embryos generated in vitro.</a> Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).</li>
<li>Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+boar+contact+on+follicular+development+and+on+estrus+expression+after+weaning+in+primiparous+sows%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows.</a> Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).</li>
<li>Costea, R., Ene, I., Pavel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pig+sedation+and+anesthesia+for+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Pig sedation and anesthesia for medical research.</a> Animals. 13, 3807(2023).</li>
<li>Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+anatomy+of+the+porcine+ventral+abdominal+wall+as+a+basis+for+training+ventral+hernia+repair+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Abdom+Wall+Surg%22%5BJournal%5D)">Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques.</a> J Abdom Wall Surg. 3, (2024).</li>
<li>Luna, S. P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+UNESP-Botucatu+pig+composite+acute+pain+scale+%28UPAPS%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS).</a> PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).</li>
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<li>Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlthouse%2C+GC+%22Diseases+of+swine.+11th+ed%22">Diseases of swine. 11th ed</a>. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).</li>
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</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突

已有其他研究团队在进行克隆猪或基因修饰克隆猪研究时采用过本研究所描述的手术方法，并有实施该技术后成功分娩的报道15,16,17,18,19,20。自2017年以来，利用不同细胞系产生的体细胞核移植（SCNT）胚胎，其妊娠率和分娩率约为20%–30%（共264次移植），平均每窝产仔数为3.2 ± 0.4头3,21。该技术效率较低的原因涉及多种因素，包括受体母猪所用的同步化方案、受体母猪与移植胚胎发育阶段之间的同步性、胚胎移植部位、用于SCNT的卵母细胞及所获得胚胎的质量、供核体细胞的质量及其细胞周期阶段，以及移植胚胎的数量21。
根据本研究，所述手术在对后备母猪进行克隆胚胎（至4细胞期）外科移植时，表现出高效、快速且安全的特点，实现了超声妊娠诊断阳性，并在剖检后于子宫腔内观察到胚胎结构，妊娠期约为妊娠12至20天22另一种将体细胞核移植胚胎移植到母猪输卵管的侵入性较小的方法是腹腔镜移植。然而，该技术的效率因多种因素而存在较大差异，范围从不到20%到超过80%，这些因素包括解剖结构的差异、所用导管的类型以及胚胎移植部位。4,6,23,24,25,26,27通过腹腔镜移植2-4细胞期猪胚胎时 通过 将漏斗部给予6头母猪，Wieczorek 等人4 在手术后28至31天未获得阳性妊娠结果，该结果与将导管插入输卵管时存在困难、导管插入输卵管深度不足以及导管导致漏斗部穿孔有关。因此，胚胎移植方法 通过 对母猪输卵管进行剖腹手术似乎仍然是最有效的方法。
母猪进行剖腹产胚胎移植手术的外科风险较小；但需要注意的是，麻醉过程中可能出现恶性高热，这在长白猪和大白猪等商业猪种中较为常见28。在本研究中，所有手术母猪在麻醉期间均未出现恶性高热的临床症状。此外，皮下区域较大血管可能发生轻微局部出血，但使用止血钳或可吸收缝线缝合即可轻易控制。在使用手术刀进行穿刺切口以及使用剪刀沿白线（linea alba）扩大切口时，也存在意外切伤腹腔内器官（如膀胱或肠袢）的可能性。因此，外科医生在切开白线及缝合腹壁肌肉时必须格外小心，避免损伤下方的结构。
外科医生的手动灵巧性对于正确操作卵巢并小心地将其外置至关重要，需避免卵巢蒂血管破裂。当难以定位卵巢时，可先找到一侧子宫角并沿其延伸方向追踪，直至到达靠近卵巢的子宫-输卵管交界处的子宫角尖端，以此作为手术起始步骤。操作过程中应注意避免因过度 manipulating 这些器官而导致卵巢和子宫发生粘连。术中使用39 °C的乳酸林格液或生理盐水对这些结构进行湿润，有助于预防粘连形成29。对输卵管的操作，尤其是伞部区域，应极为轻柔，以避免牵拉和破裂。尽管可选择单侧胚胎移植（仅移植至一侧输卵管）以减少对子宫的过度操作并缩短手术时间，但双侧移植可能更为安全且更具优势，特别是在发生一侧输卵管意外破裂或无法确认胚胎是否准确植入目标位置的情况下。此外，与单侧移植相比，双侧移植更受推荐，因其可提高妊娠率及产仔数16,30。囊肿的存在与规律性或不规律性发情返回相关，约有10%的卵巢囊肿雌性个体可能持续处于乏情状态。其成因多样，包括应激、激素处理方案的使用或遗传因素等31,32。&#160;在本案例中，尽管严格按照激素生产商推荐的剂量和给药时间进行同期发情处理，仍出现了卵泡囊肿。
了解如何通过输卵管伞端的开口定位输卵管开口，对于将胚胎准确植入适当位置至关重要。为避免胚胎植入位置错误，建议在屠宰场获取的标本上，预先进行训练，练习将充满液体（例如水）的Tomcat导管经输卵管开口插入。当移液管插入正确位置时，注入液体后可观察到输卵管体积增大。值得注意的是，随胚胎转移的液体量越少，妊娠成功率越高33。&#160;若术者发现难以找到输卵管开口，可在输卵管壁上制作一个小袋，通过该小袋插入导管。尽管后一种方法更快且对输卵管的操作较少，但术者需避开血管，并确保导管已正确插入输卵管管腔内。
尽管该手术术后感染的风险较低，但仍可能因动物饲养环境的清洁程度、手术持续时间、敷料维持时间是否充分，以及预防性抗生素和抗炎药物等治疗方案是否正确使用等因素而发生感染。其中一头经手术处理的后备母猪出现感染的最可能原因是，该动物在麻醉苏醒后不久敷料即脱落。尽管对该后备母猪的手术伤口每日使用生理盐水浸湿的纱布进行清洁，并局部涂抹皮尔逊软膏，但这些措施仍不足以防止上行性污染，最终需采用冷水冲洗伤口、引流处理、全身性抗生素治疗，并额外延长3天的抗炎治疗。尽管发生了皮下感染，该后备母猪在超声检查中仍显示出妊娠迹象。
在之前的手术中使用尼龙缝线和外科缝钉闭合皮肤后，本次我们选择使用氰基丙烯酸乙酯粘合剂，以减少拆线时的应激反应，并避免残留缝线或缝钉。残留的缝线或缝钉可引发局部轻微炎症，导致脓疱形成。氰基丙烯酸乙酯粘合剂已在外科手术中安全应用，证明有效、无毒且具有杀菌作用34,35。所有动物伤口愈合良好，未出现并发症，仅有一头青年母猪在术后不久敷料脱落。

猪由于在解剖学、生理学和遗传学方面与人类具有高度相似性，是生物医学研究中极为理想的实验模型1。这些动物常被用于异种移植相关研究，旨在培育出在移植到人体后具有较低排斥风险的器官、细胞或组织。异种移植研究的目标是增加可供人体移植的器官数量，从而缩短患者的等待名单2。
用于异种移植的猪的制备涉及多个步骤，包括利用基因编辑的猪细胞生产克隆个体。在 体外 转基因克隆胚胎的制备过程中，将胚胎移植至具有同步发情周期的母猪生殖系统中，以调节其子宫生理状态，为新胚胎的着床和妊娠做好准备3.
猪的胚胎移植可通过非侵入性或侵入性方法进行4在非侵入性方法中，经宫颈转移无需任何外科手术干预。然而，该方法仅限于较晚发育阶段的胚胎（即桑葚胚或囊胚阶段）的转移，且无法精确定位导管插入位置及胚胎放置部位。5腹腔镜和剖腹手术被认为是侵入性的胚胎移植方法。腹腔镜侵入性较小，但需要特定且昂贵的设备，其效率因多种因素（如生殖结构操作难度和所用导管类型）而有很大差异（从低于20%到超过80%）。4,6因此，转移 通过 与手术移植方法相比，腹腔镜技术的效率仍然较低 通过 剖腹手术4.
母猪胚胎移植手术 通过 剖腹手术是一种相对简单且快速的操作，通常耗时约30分钟。然而，该手术应在配备吸入式麻醉设备和专业团队的外科中心进行。对于商用猪品系（如长白猪、大白猪或其杂交品种），由于动物体重较大（约130–150 kg），必须配备用于抬升后备母猪的吊装设备以及宽大坚固的手术台。
为了确保手术成功，必须预先评估胚胎的发育阶段。建议将不超过4细胞阶段的胚胎移植至输卵管内。而对于4细胞以上的胚胎，如桑葚胚和囊胚，则应移植至子宫角7,8。
尽管全球各地的研究团队正在开展基因修饰克隆猪胚胎的制备及手术移植工作，但目前仍缺乏通过视频形式完整展示该操作流程的标准化方案。该技术对于妊娠成功至关重要，因其要求将胚胎精确地移植至输卵管的特定位置，操作中需定位输卵管腹腔口，并将含有胚胎的移液管插入其中。通过展示整个操作过程的解说视频，可更有效地理解该技术。因此，本文旨在演示将克隆胚胎移植至后备母猪输卵管的剖腹手术，这是未来生产用于异种移植或其他相关用途的基因修饰猪所必需的关键步骤。

<table><tbody><tr><td>0.25 mL 吸管</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Descarpack</td><td>341001</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Descarpack</td><td>324601</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>Descarpack</td><td>324801</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>Descarpack</td><td>324201</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Descarpack</td><td>324401</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>60 mL 注射器</td><td>Descarpack</td><td>323201</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>9 mm 气管插管</td><td>Rusch</td><td>112482-000090</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>Allis 止血钳</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>Amox LA</td><td>JA Sa&amp;uacute;de Animal</td><td>MAPA 注册号: 8.781/2004</td><td>药品</td></tr><tr><td>Bakhaus 止血钳</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>20G 导管</td><td>Descarpack</td><td>362401</td><td>静脉通路导管</td></tr><tr><td>Cetamin</td><td>Agener Uni&amp;atilde;o</td><td>MAPA 注册号: SP-000292-5.000011&amp;nbsp;</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>导电临床凝胶</td><td>RMC</td><td>ANVISA 注册号: 80122200013</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>安乃近 D-500</td><td>Zoetis</td><td>MAPA 注册号: SP0000728-46</td><td>药品</td></tr><tr><td>一次性手术刀片 22 号</td><td>Wiltex</td><td>ANVISA 注册号: 10150470565</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>一次性无菌海绵刷</td><td>Rioquimica</td><td>7.89778E+12</td><td>外科无菌</td></tr><tr><td>Easy-Scan:Go</td><td>IMV</td><td>ESCG01</td><td>超声设备</td></tr><tr><td>Endozime AW Plus</td><td>Ruhof</td><td>34514</td><td>外科器械清洗剂</td></tr><tr><td>芬太尼 (Fentanest)</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td>ANVISA 注册号: 1029800810159</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>Gosset 牵开器</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>Halstead-蚊式止血钳</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>愈合软膏 - Unguento Pearson</td><td>Pearson SA</td><td>MAPA 注册号: SP0000094-16</td><td>药品</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Rioquimica</td><td>ANVISA 注册号: 218690015</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Biochimico</td><td>ANVISA 注册号: 100630222</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>静脉输液延长管</td><td>generic</td><td>-</td><td>液体治疗</td></tr><tr><td>大滴速静脉输液器</td><td>Descarpack</td><td>410301</td><td>液体治疗</td></tr><tr><td>Lactofur (头孢噻呋)</td><td>Ourofino SA</td><td>MAPA 注册号: SP0000051-50</td><td>药品</td></tr><tr><td>喉镜</td><td>-</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>Maxicam 2%</td><td>Ourofino SA</td><td>MAPA 注册号: SP0000051-69</td><td>药品</td></tr><tr><td>微孔胶带 5 cm x 10 cm&amp;nbsp;</td><td>generic</td><td>1530</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Hipolabor</td><td>ANVISA 注册号: 1134301430035</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>多通路静脉输液器</td><td>Descarpack</td><td>413201</td><td>液体治疗</td></tr><tr><td>针头 40 mm x 1.2 mm</td><td>Descarpack</td><td>353601</td><td>用于注射药物和麻醉剂的无菌针头</td></tr><tr><td>针头 40 mm x 1.6 mm</td><td>Wiltex</td><td>ANVISA 注册号: 10150470664</td><td>用于注射药物和麻醉剂的无菌针头</td></tr><tr><td>持针器</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>尼龙 2 号缝合线</td><td>Shalon Medical</td><td>N502CTI40</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>普通笔</td><td>generic</td><td>-</td><td>用于记录的普通笔</td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水 500 mL 袋装</td><td>JP Farma</td><td>MS:1.0491.0070</td><td>液体治疗</td></tr><tr><td>聚乙醇酸 2 号缝合线</td><td>Atramat</td><td>G4099-75H</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Samtec</td><td>ANVISA 注册号: 1559200010139</td><td>肠外用药</td></tr><tr><td>检查手套</td><td>Descarpack</td><td>122401</td><td>个人防护装备 (PPE)</td></tr><tr><td>丙泊酚 (Provive)</td><td>Uni&amp;atilde;o Qu&amp;iacute;mica</td><td>ANVISA 注册号: 1049714490057</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>乳酸林格液 500 mL 袋装</td><td>JP Farma</td><td>MS:1.0491.0061</td><td>液体治疗</td></tr><tr><td>Riohex 0.5% 氯己定酒精溶液</td><td>Rioquimica</td><td>218690356</td><td>外科无菌</td></tr><tr><td>Riohex 2% 含表面活性剂氯己定溶液</td><td>Rioquimica</td><td>218690356</td><td>外科无菌</td></tr><tr><td>头皮穿刺针 21G</td><td>Descarpack</td><td>421201</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>鞋套</td><td>generic</td><td>-</td><td>个人防护装备 (PPE)</td></tr><tr><td>无菌敷料</td><td>Cremer</td><td>ANVISA 注册号: 10071150065</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>无菌纱布垫</td><td>Procitex</td><td>ANVISA 注册号: 80245210083</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>无菌手术单 140 cm x 90 cm&amp;nbsp;</td><td>Venkuri</td><td>7010003</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>无菌手术单 150 cm x 190 cm&amp;nbsp;</td><td>PolarFix</td><td>F00208</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td>Mucambo</td><td>CA: 39.317</td><td>个人防护装备 (PPE)</td></tr><tr><td>听诊器</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科设备</td></tr><tr><td>手术帽</td><td>Descarpack</td><td>93201</td><td>个人防护装备 (PPE)</td></tr><tr><td>手术衣</td><td>Descarpack</td><td>231101</td><td>个人防护装备 (PPE)</td></tr><tr><td>外科口罩</td><td>Descarpack</td><td>110701</td><td>个人防护装备 (PPE)</td></tr><tr><td>钝头-钝头手术剪</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>锐头-锐头手术剪</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>外科缝合器</td><td>Tradevet</td><td>-</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>Tekbond 超强胶</td><td>Tek Bond</td><td>78072720030</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>体温计</td><td>generic</td><td>-</td><td>外科设备</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Solidor</td><td>374</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>盐酸曲马多</td><td>Agener Uni&amp;atilde;o</td><td>MAPA 注册号: SP-000292-5.000002</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>透明薄膜敷料</td><td>Skinupper</td><td>ANVISA 注册号: 82307460014</td><td>外科材料</td></tr><tr><td>防水胶带 10 cm x 4.5 cm&amp;nbsp;</td><td>generic</td><td>364828</td><td>外科材料</td></tr></tbody></table>

通过剖腹手术在后备母猪中进行胚胎移植

Embryo Transfer Surgery via Laparotomy in Gilts

本方案旨在演示将克隆猪胚胎移植至输卵管的手术技术，该方法广泛应用于生物医学研究中转基因猪的制备。九头母猪接受激素同步化处理，并通过剖腹手术将体细胞核移植（SCNT）技术获得的、发育至第2天最多4细胞阶段的克隆胚胎移植至输卵管。随后进行妊娠诊断 通过 移植手术后30天进行超声检查。九头手术母猪中有六头在超声检查中显示妊娠迹象。然而，经超声评估，胎儿发育未见进展，因此在术后60天对母猪实施安乐死，以采集生物样本并评估生殖系统。剖检发现子宫角、卵巢和输卵管存在粘连。从两头安乐死母猪的子宫腔内分别获得1个和4个胚胎结构，其妊娠年龄介于12至20天之间。尽管未获得活仔猪，这可能归因于克隆猪胚胎移植效率较低，而移植效率受多种因素影响，包括移植胚胎的数量和质量，但本研究所采用的手术技术证明是快速且安全的。

本文旨在演示将克隆胚胎移植至后备母猪输卵管的剖腹手术。所有动物在整个手术过程中均保持适当的麻醉状态，麻醉恢复期间未发生任何术中意外或并发症。后备母猪在手术结束后平均需要 2–3 小时才能站立。
所有外科手术平均持续44分钟。共对9头青年母猪进行了手术，每头母猪平均移植185个克隆胚胎， bilateral共移植1,664个胚胎（表1）。卵巢的定位、暴露以及将含有胚胎的Tomcat导管插入输卵管漏斗部，是手术过程中最关键的步骤。术中对所有青年母猪的卵巢进行了检查，均可见近期排卵后的出血性卵泡，这与所实施的发情同步化方案预期结果一致，该方案旨在排卵后不久即进行胚胎移植。所有手术均无术中并发症发生。
术后未见任何动物出现剧烈疼痛迹象，每头手术母猪在术后3天内每日疼痛评分（评分范围为0～18）分别为0.33、0.33、3.67、1.33、0.33、1.33、4.67、2.00和0.33表 2）。仅1头手术母猪在术后12天出现皮下液体积聚（血清肿）th 术后第天，手术切口周围出现感染和炎症迹象。在超声引导下使用40 mm × 1.6 mm针头引流液体，每日对炎症部位进行30分钟冷敷，持续7天；同时给予头孢噻呋（肌内注射，共3次，每次间隔72小时）和2%美洛昔康（0.4 mg/kg，每日一次，肌内注射，连续3天）。随后伤口形成瘘管，排出残余的黏液脓性内容物，动物状况完全恢复。其余手术母猪术后保持敷料5天，期间无需更换或拆除敷料进行伤口清洁，伤口清洁仅从第6天开始th 到 10th 术后第几天
在2、8和9号后备母猪中，未观察到子宫腔内有液体积聚和胚胎囊的形成（图1A）。因此，这些动物的妊娠诊断被视为阴性。其余母猪则显示子宫内液体积聚，并可见胚胎囊泡形成，表现为边界清晰的无回声圆形结构（图1B-D）。在两头受体后备母猪中，可在胚胎囊内早期发育阶段识别出相对于胚胎结构的强回声区域，该现象出现在第32天nd 妊娠天数（图1E，F).
在妊娠诊断结果为阴性或妊娠未进展后，对后备母猪实施了安乐死，并对其生殖系统进行了分析。在后备母猪1、2、3和4中，观察到不同程度的卵巢、输卵管及子宫角区域的粘连，后备母猪8则观察到卵巢囊肿（图2）。从后备母猪3的子宫中获取了四个胚胎结构，其妊娠年龄与妊娠约12至20天相符，另从后备母猪7中获取了一个胚胎结构（图3）。对胚胎组织碎片的检测结果显示，细小病毒、钩端螺旋体（Leptospira sp.）、丹毒杆菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）以及猪圆环病毒2型和3型（PCV2/PCV3）均为阴性，这些病原体均可导致胚胎死亡或流产。
<img alt="超声图像序列，腹部结构，诊断成像，临床研究分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66984/66984fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：手术后30天胚胎受体母猪子宫的超声图像。（A）母猪2的子宫，内部无液体存在，表现为妊娠诊断阴性。母猪1（B）、母猪3（C）和母猪4（D）的妊娠子宫，内含含液体的胚胎囊（星号所示）。母猪3（E）和母猪7（F）的妊娠子宫显示胚胎囊内存在强回声结构（箭头所示），提示在妊娠32天时已进入早期胎儿形成阶段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66984/66984fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="九个解剖后的消化道标本，标记为A至I，展示解剖学变异及测量标尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66984/66984fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：生殖系统分析。 母猪1（A）、母猪2（B）、母猪3（C）、母猪4（D）、母猪5（E）、母猪6（F）、母猪7（G）、母猪8（H）和母猪9（I）尸检后的子宫、卵巢和输卵管图像。箭头指示子宫角、卵巢和输卵管中的粘连，箭头末端指示卵巢囊肿。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66984/66984fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织解剖实验；培养皿中的生物样本；聚焦器官分离过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66984/66984fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：妊娠诊断。从母猪3号（A-D）和母猪7号（E）中取出的早期胚胎在超声检查中显示妊娠诊断呈阳性，并在胚胎囊内可见强回声结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66984/66984fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：每头后备母猪移植的胚胎数量与类型、确诊的妊娠数，以及手术后备母猪剖检后获得的胚胎数量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66984/66984_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：关于手术母猪疼痛症状表现所分配的评分值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66984/66984_Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案描述了用于移植克隆猪胚胎的外科手术技术的应用 通过 未产母猪剖腹术

本方案旨在演示将克隆猪胚胎移植至输卵管的手术技术，该方法广泛应用于……的生产中

我们旨在帮助其他研究团队在后备母猪中开展胚胎移植手术，因为胚胎移植是生产用作实验模型的基因修饰猪的关键步骤。目前还存在其他现代猪胚胎移植手术方法，例如腹腔镜技术。然而，正如本研究所述，剖腹手术仍然是移植朗格汉斯病物种最可靠的方法。目前面临的挑战包括猪胚胎的体外生产，以及受体母猪在胚胎阶段的精确同步化。此外，手术操作要求外科医生具备娴熟的手法，以避免损伤卵巢韧带并准确找到胚胎移植的合适位置。本方案通过详细描述和演示所有执行胚胎移植手术的人员类型、术前准备要点、手术关键步骤以及术后护理措施，填补了相关研究空白，确保手术的安全性和有效性。仅需暴露卵巢，这样可以减少对器官的操作，降低粘连和妊娠失败的风险。使用无需缝合线的方式来闭合皮肤，也可使手术过程更快，并在拆除缝线时减少对动物造成的应激。首先，准备好手术台及相应的无菌器械。在麻醉动物身上完成手术区域消毒后，将手术巾覆盖于倒数第二对腹股沟乳腺上。使用剪刀在手术巾上剪出一个矩形开口，并用四个背侧钳固定手术巾于动物皮肤上。用手术刀做一条长约10厘米的切口。使用止血钳和2号可吸收缝线对皮下血管进行止血。使用尖头剪刀或手指分离皮下组织，加深切口以到达腹肌的白线。用艾利斯钳夹住并提起肌层，用手术刀在白线上做一穿刺切口。将食指插入切口，评估是否存在粘连。沿腹白线向头侧和尾侧延伸切口，注意避免损伤其他器官及深部结构。将一只手伸入腹腔，以定位并牵出卵巢。若找到一侧子宫角，应轻柔地沿其走向追踪，直至到达该侧子宫角尖端及同侧卵巢。找到卵巢后，轻轻牵拉并小心暴露。评估是否存在排前卵泡、出血性黄体、周期性黄体以及白体，以判断后备母猪的同步化是否符合预期。轻轻去除覆盖卵巢的输卵管伞部纤维组织，拨开其黏膜以定位输卵管的输卵管腹腔口。然后小心地将含有胚胎的导管插入输卵管伞部的开口，直至到达输卵管的间质部。将一个1毫升的注射器连接到导管上，推动含有胚胎的液体进入输卵管。将卵巢用伞部覆盖后，放回腹腔内。如果难以辨认输卵管壶腹部，可使用圆体缝合针在输卵管的壶腹部创建一个囊袋，随后插入含有胚胎的公猫导管。接着，将腹腔内的结构复位。为防止粘连，向腹腔内加入一升温度为39摄氏度的生理盐水或乳酸林格液。接着，使用2号可吸收缝线以X形间断缝合腹壁肌肉。用乙基氰丙烯酸酯粘合剂闭合皮肤。清洁手术伤口后，涂抹雷帕霉素或皮尔逊软膏，并用纱布覆盖该区域。最后，使用外科粘合剂。共有9头青年母猪接受手术，平均每头移植185个克隆胚胎，两侧总共移植了1,664个胚胎。每头母猪在术后三天内，按0到18的疼痛评分标准评估，平均疼痛评分介于0.33至4.67之间，均未表现出剧烈疼痛的迹象。

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