Name: 使用质谱法对人脑类器官进行分子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解质谱成像技术在人脑类器官代谢组学研究中的应用。该方法利用诱导多能干细胞衍生的脑类器官模型，实现高分辨率代谢物空间分布成像，为神经发育机制研究和神经发育障碍治疗靶点发现提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢马莱蒂奇-萨瓦蒂奇实验室的成员，特别是研究生 Danielle Mendonca，在本研究中提供的有益讨论和意见，以及贝勒医学院先进科技核心设施对核磁共振和药物代谢核心的支持。本工作部分得到了美国国家心理健康研究所（1R01MH130356，资助对象 M.M.S）、尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发育研究所（R61/R33HD099995，资助对象 F. L.）以及尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发育研究所的资助 &amp;#38; 美国国立卫生研究院人类发展研究所（P50HD103555）对显微镜核心设施、病理学核心设施以及人类疾病细胞模型核心设施的使用支持。此外，本工作还获得了部分资助&#160;通过美国国家航空航天局（NASA）合作协定，由太空健康转化研究所提供的联邦资金&#160;NNX16AO69A，资助号 RAD01013（M.M.S）&#160;美国国家航空航天局（NASA）根据编号为80ARC023CA004的合同“缺氧后多器官修复”（MORPH: Multi-Organ Repair Post Hypoxia）项目（M.M.S.），以及自闭症之声（Autism Speaks）（G.C）&#160;西蒙斯基金会试点奖（M.M.S.）&#160;以及辛西娅和安东尼·佩特雷洛 
资助（M.M.S）

该方案的整体流程如图1所示。材料表中列出了本研究中所用试剂和设备的详细信息。
1. 脑类器官切片制备
<ol>
	<li>按照先前发表的文献方法23,24，利用诱导性多能干细胞（iPSC）制备脑类器官（培养30-60天时大小为2-3 mm），并使用宽口吸头在所需时间点收集类器官。
	<ol>
		<li>在室温下用不含CaCl2和MgCl2的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗制备好的类器官三次，以去除培养基残留，随后在室温下迅速用蒸馏水冲洗，以去除DPBS中的盐分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过搅拌并加热明胶（10 mg溶于100 mL DPBS中）于70-80 °C条件下持续2小时，制备来自冷鱼皮的10%明胶溶液，然后将溶液转移至37 °C培养箱中孵育30分钟，以去除气泡并使其温度与类器官培养环境一致。 
	注：建议每次实验均新鲜配制明胶溶液，但如有需要，也可在4 °C保存最多1周。明胶在室温下会凝固，使用前需加热使其融化，以便作为包埋液使用。</li>
	<li>用小吸头将类器官固定于塑料模具（25 mm × 20 mm × 5 mm）中央，缓慢倒入10%明胶包埋液，直至类器官完全浸没（模具约填充一半）。
	<ol>
		<li>将模具置于含有冰冷100%乙醇的培养皿中，并放置于干冰上，快速冷冻1-2分钟。当完全冻结（颜色变为均匀白色）后，取出类器官-明胶块，用铝箔包裹或放入密封的锡杯中，防止水分浓缩，并于−80°C保存，直至进行冷冻切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行冷冻切片时，将含有类器官的塑料包埋块置于-20 °C至-25 °C的冷冻腔内，平衡10-15分钟，使其温度与腔内一致。使用冷冻切片机将类器官切成14 µm厚的切片，并贴附于氧化铟锡涂层载玻片（ITO载玻片）上，用于质谱成像（MSI）。</li>
	<li>可立即在质谱仪中扫描结构均匀的切片，或将其密封于容器中，于-80°C保存以备后续研究使用。</li>
</ol>
2. 基质制备及在基质辅助激光解吸电离质谱成像中的应用
<ol>
	<li>对于基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI），需将载玻片喷洒并用基质覆盖组织切片，基质是一种有助于不同代谢物离子化的有机化合物25。不同分子种类的成像需使用不同的基质；因此，首先必须选择最适合本研究的基质。 
	注意：本研究重点关注与线粒体代谢通路相关的小分子代谢物和氨基酸的定位与分布，因此相应地选择了基质（如需进行脂质成像，请参见 Cappuccio 等人15）。</li>
	<li>首先，将 ITO 载玻片从 -80 °C 取出后，立即放入干燥器中静置 20 分钟，以最大限度减少大气水分在表面凝结。</li>
	<li>配制盐酸萘乙二胺（NEDC），该基质适用于小分子代谢物，因其可在 m/z 500 Da 以下产生目标分析物的强信号，同时不干扰背景信号26。在载玻片干燥后，使用加热气动喷雾器将 10 mg/mL 的 NEDC 甲醇溶液（70% 甲醇）喷洒至类器官切片上。</li>
	<li>设定基质喷雾仪参数如下：喷嘴温度 = 75 °C，喷嘴移动速度 = 1,250 mm/min，泵流速 = 100 µL/min，喷雾次数 = 8 次，轨道间距 = 2.5 mm，气体流速 = 3 L/min，干燥时间 = 10 秒，氮气压力 = 10 psi。</li>
</ol>
3. 基质辅助激光解吸电离质谱成像仪器
<ol>
	<li>为实现高分辨率 MALDI-MSI 平台以可视化脑类器官代谢物，将带有双离子漏斗接口的 MALDI 离子源安装至质谱仪上。</li>
	<li>使用波长为 349 nm、重复频率为 1 kHz、脉冲能量约为 1.3–1.4 µJ 的 Q 开关、三倍频 Nd 激光器。</li>
	<li>为避免过度采样，将激光聚焦至直径约 15 µm 的光斑尺寸。</li>
	<li>将样品固定于 MALDI 注入器载物台上。使高压离子漏斗工作并维持在 7.4–7.5 Torr，低压离子漏斗维持在 1.6–1.8 Torr。</li>
	<li>分别对高压和低压离子漏斗施加 604 kHz、80 V₀-峰值和 780 kHz、191 V₀-峰值的射频电压。</li>
	<li>为提高低质量范围内小分子代谢物的检测灵敏度，将 MALDI-MSI 源中低压和高压漏斗的射频振幅分别降低至约 20% 和 15%。</li>
	<li>将质量分辨率设为 70,000。在 MALDI 注入器软件中选择待测区域及像素尺寸（25 µm/像素）。</li>
</ol>
4. MALDI-MSI 数据采集与数据分析
<ol>
	<li>在负离子和正离子模式下采集 m/z 范围为 80-900 的数据。对 14 µm 器官样体切片以每像素 25 µm 的横向分辨率进行样品扫描。</li>
	<li>将质谱仪的离子注入时间设置为 250 ms，并在自动增益控制（AGC）关闭的情况下以轮廓模式采集傅里叶变换质谱（FTMS）数据26。</li>
	<li>使用 NEDC 基质峰作为内部在线质量校准，使质量精度优于 ±5 ppm。</li>
	<li>使用兼容软件处理数据。将质谱成像（MSI）谱图数据直接导入软件，然后使用卷积算法进行基线校正，并采用总离子流计数（TIC）对数据进行归一化。</li>
	<li>利用 Δm/z = 0.01 或 ±5 ppm 的质荷比区间宽度，从原始数据文件生成离子图像特征列表，以基于质量缺陷和像素覆盖率区分不同的 m/z 图像。</li>
	<li>从单个代谢物离子种类生成伪彩色（Jet）或 RGB（红-绿-蓝）图像。将从 MALDI-MSI 获得的原始数据文件的 m/z 列表上传至人类代谢组数据库（HMDB）（质量容差 &#60;5 ppm，相对于理论 m/z 值），以鉴定代谢物。 
	注：同时利用 LC-MS/MS 数据获得的代谢物精确质量、预测分子式及结构，查询代谢组学数据库（如 HMDB、Metlin），用于代谢物的比对与鉴定。</li>
</ol>

 Advanced MALDI-MSI Mapping of Metabolites in Brain Organoids

<ol><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+Organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: Organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Sandoval, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+human+brain+organoid+research%3A+Where+we+are+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in human brain organoid research: Where we are and where we need to go.</a> Stem Cell Rep. 19 (6), 796-816 (2024).</li>
<li>Dei-Ampeh, A. K., Shah, M., Cappuccio, G., Young, D. W., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+models+as+new+tools+for+drug+development+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Phenotyping+of+Human+iPSC-derived+Neurons%22%5BJournal%5D)">Human models as new tools for drug development and precision medicine.</a> Phenotyping of Human iPSC-derived Neurons. , 155-171 (2023).</li>
<li>Choi, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+mammalian+brain+reveals+regional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Sys+Bio%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of mammalian brain reveals regional differences.</a> BMC Sys Bio. 12 (S8), 127(2018).</li>
<li>Kandel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleic+acid+is+an+endogenous+ligand+of+TLX%2FNR2E1+that+triggers+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Oleic acid is an endogenous ligand of TLX/NR2E1 that triggers hippocampal neurogenesis.</a> PNAS. 119 (13), e2023784119(2022).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+platforms+and+techniques+to+study+stem+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical platforms and techniques to study stem cell metabolism.</a> Methods Mol Biol. 1842, 265-281 (2018).</li>
<li>Chen, K., Baluya, D., Tosun, M., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+A+new+tool+to+assess+molecular+underpinnings+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: A new tool to assess molecular underpinnings of neurodegeneration.</a> Metabolites. 9 (7), 135(2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+spatially+resolved+multi-omics+molecular+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for spatially resolved multi-omics molecular mapping.</a> NPJ Imaging. 2 (1), (2024).</li>
<li>Spruill, M. L., Maletic-Savatic, M., Martin, H., Li, F., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+analysis+of+drug+absorption%2C+distribution%2C+metabolism%2C+and+toxicology+using+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial analysis of drug absorption, distribution, metabolism, and toxicology using mass spectrometry imaging.</a> Biochem Pharmacol. 201, 115080(2022).</li>
<li>Sekera, E. R., Akkaya-Colak, K. B., Lopez, A., Mihaylova, M. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+histology+for+the+analysis+of+budding+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and histology for the analysis of budding intestinal organoids.</a> Anal Chem. 96 (10), 4251-4258 (2024).</li>
<li>Wang, Y., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS+imaging+of+multicellular+tumor+spheroids+and+organoids+as+an+emerging+tool+for+personalized+medicine+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">MS imaging of multicellular tumor spheroids and organoids as an emerging tool for personalized medicine and drug discovery.</a> J Biol Chem. 297 (4), 101139(2021).</li>
<li>Bakker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+ductal+epithelial+organoids+for+high-spatial-resolution+molecular+profiling+using+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparing ductal epithelial organoids for high-spatial-resolution molecular profiling using mass spectrometry imaging.</a> Nat Protoc. 17 (4), 962-979 (2022).</li>
<li>Cappuccio, G., Khalil, S. M., Osenberg, S., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+as+an+emerging+tool+for+studying+metabolism+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Molecular+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging as an emerging tool for studying metabolism in human brain organoids.</a> Front Molecular Biosci. 10, 1181965(2023).</li>
<li>Khalil, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+mass+spectrometry+visualizes+the+distribution+of+antidepressant+duloxetine+and+its+major+metabolites+in+mouse+brain%2C+liver%2C+kidney%2C+and+spleen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging mass spectrometry visualizes the distribution of antidepressant duloxetine and its major metabolites in mouse brain, liver, kidney, and spleen tissues.</a> Drug Metab Dispos. 52 (7), 673(2024).</li>
<li>Swales, J. G., Hamm, G., Clench, M. R., Goodwin, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+its+application+in+pharmaceutical+research+and+development%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and its application in pharmaceutical research and development: A concise review.</a> Int J Mass Spectrom. 437, 99-112 (2019).</li>
<li>Müller, W. H., Verdin, A., De Pauw, E., Malherbe, C., Eppe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 41 (3), 373-420 (2022).</li>
<li>Langridge, J. I., Claude, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+coupled+to+ion+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption and desorption electrospray ionization mass spectrometry coupled to ion mobility.</a> Methods Mol Biol. 2084, 245-265 (2020).</li>
<li>Khalil, S. M., Römpp, A., Pretzel, J., Becker, K., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+topography+of+whole-body+sections+of+the+Anopheles+stephensi+mosquito%2C+characterized+by+high-resolution+atmospheric-pressure+scanning+microprobe+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid topography of whole-body sections of the Anopheles stephensi mosquito, characterized by high-resolution atmospheric-pressure scanning microprobe matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 87 (22), 11309-11316 (2015).</li>
<li>Khalil, S. M., Sprenger, R. R., Hermansson, M., Ejsing, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDA-imaging+with+structural+identification+of+lipid+molecules+on+an+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">DDA-imaging with structural identification of lipid molecules on an Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> J Mass Spectrom. 57 (9), e4882(2022).</li>
<li>Bender, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+method+for+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+fresh-frozen+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sample preparation method for MALDI mass spectrometry imaging of fresh-frozen spines.</a> Anal Chem. 95 (47), 17337-17346 (2023).</li>
<li>Paşca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids%3A+Advances%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), dev166074(2019).</li>
<li>Ferguson, C. N., Fowler, J. W. M., Waxer, J. F., Gatti, R. A., Loo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+tissue+imaging+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mass+Spectrom+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based tissue imaging of small molecules.</a> Adv Mass Spectrom Biomed Res. 806, 283-299 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+imaging+of+metabolites+with+a+N+-%281-Naphthyl%29+Ethylenediamine+Dihydrochloride+matrix+and+its+application+to+colorectal+cancer+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis.</a> Anal Chem. 87 (1), 422-430 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

针对人脑类器官的高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）优化方案，系统性地完善了关键实验步骤，以确保结果的可靠性。样本保存至关重要，为避免组织开裂和损伤，本方案提出一种替代性冷冻方法，即采用预热的包埋液与干冰冷却的乙醇进行冷冻。该方法特别适用于微小尺寸的组织，例如人脑类器官15。应避免使用最佳切削温度（OCT）包埋剂和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）等包埋材料，因其会干扰基质沉积与离子化过程。相反，推荐使用来自冷鱼皮的10%明胶作为最优包埋溶液，其在冷冻切片过程中可有效维持组织完整性15。此外，基质的选择及其沉积技术（如干法喷涂）对于减少低质荷比（m/z）小分子代谢物的位移并提高成像分辨率具有关键作用。
该方案的稳健性和可靠性已通过成功检测和可视化人脑类器官中多种分子得到证实15，从而提供了关于这些分子空间分布及其潜在生物学意义的宝贵见解。这些发现显著加深了对脑类器官内复杂分子图谱的理解，阐明了支撑大脑发育与功能的关键信号通路和代谢过程。
尽管当前数据为多种物种的定位提供了新的见解，但本研究中使用的Spectroglyph MALDI成像源尚未达到单细胞水平的分辨率（目前约为~10-20 µm）。其他平台，如布鲁克的timsTOF和沃特世的MRT，可在5 µm实现单细胞分辨率，因此在实验中需充分考虑所选用的仪器。
尽管存在这些限制，脑类器官的高分辨率HR-MALDI-MSI仍具有巨大潜力。该技术能够绘制类器官内代谢物和脂质分布图谱，为代谢相关的细胞命运轨迹、通路以及对类器官发育和成熟至关重要的特异性分子特征提供独特的研究视角。该方法架起了传统组织学与分子分析之间的桥梁，有助于深入理解基因组、表型组与环境响应之间的相互关联。
综上所述，人脑类器官高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像（HR-MALDI-MSI）的优化方案为研究类器官模型的科研人员提供了一项重要工具。该方法通过细致优化关键步骤、提供故障排除策略并明确其局限性，为深入阐明脑发育与功能背后的分子复杂性奠定了基础。随着质谱成像技术的不断发展和日益普及，该技术有望推动我们对人类早期发育、疾病建模及药物发现的理解。

类器官模型源自原代组织干细胞、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPSCs）1,2,3，通过提供高度模拟器官特异性功能的三维模型，推动了人类生物学研究的发展，有助于人类发育、疾病机制及药物发现的研究4,5。在此背景下，解析脑类器官的复杂性对于理解生理和病理状态下的脑发育至关重要6,7，这需要质谱成像（MSI）等技术的支持8,9。与传统质谱技术不同，MSI能够在单个组织切片中直接、无需标记地绘制数百至数千种生物分子的分布图，无需特异性分子探针即可提供脂质、肽段、氨基酸、药物及其代谢物等分子空间分布的详细信息10,11。此外，MSI获得的分子图像可与组织学染色和免疫组化切片共定位，从而全面呈现组织形态、细胞特异性和分子组成。
质谱成像（MSI）在类器官研究中具有重要意义，可提供关于疾病分子基础、基因型-表型关系以及对环境刺激响应的深入见解12,13,14,15。在制药行业中，MSI有助于在临床前模型中分析药物的吸收、分布、代谢和排泄过程11,16。此外，它还可用于鉴定具有药理活性的生物转化代谢产物17。
在质谱成像（MSI）方法中，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）、解吸电喷雾电离（DESI）和二次离子质谱（SIMS）占据主导地位9,18,19,20,21。其中，MALDI-MSI 因其多功能性、宽质量范围、直接分析能力以及与多种组织特异性化学物质的兼容性而尤为突出22。然而，尽管具有潜力，MALDI-MSI 在脑类器官研究中的应用仍鲜有探索。为弥补这一空白，已提出一种针对脑类器官的高分辨率 MALDI-MSI（HR-MALDI-MSI）分析的定制化实验方案，以优化组织保存、基质选择和成像条件，确保可靠地获取高质量数据15。该详细方案展示了 HR-MALDI-MSI 的能力，为研究人员提供了有力工具，可更深入、前所未有地探索类器官的代谢图谱。

<table><tbody><tr><td>(1S,2S)-1,2-二-1-萘基-乙二胺二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>1052707-27-3</td><td>基质辅助激光解吸电离质谱用基质物质， &amp;ge;99.0%（HPLC）</td></tr><tr><td>1&amp;times; 杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>美国 Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>不含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>ART宽孔带滤芯吸头</td><td>美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司</td><td>2069G</td><td>降低潜在污染风险</td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-916</td><td>标准模具，平面表面&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1079610500</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>伊红Y</td><td>Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>E511-25</td><td>认证生物染色剂</td></tr><tr><td>鱼明胶</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>G7041</td><td>来自冷水鱼皮的粉末形式</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>517-28-2</td><td>经认证的生物染色剂 高压成像光源</td></tr><tr><td>HTX M5+ 喷雾器</td><td>HTX Technologies LLC，美国卡里</td><td></td><td>基质喷涂仪</td></tr><tr><td>铟锡</td><td>哈德逊表面技术公司</td><td>PL-IF-000010-P25</td><td>为基质辅助激光解吸电离成像提供导电表面</td></tr><tr><td>MALDI 离子源</td><td>Spectroglyph LLC，美国</td><td></td><td>双离子漏斗接口</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>67-56-1</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>氧化铟锡（ITO）导电&amp;ndash;包被载玻片&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>美国纽约</td><td></td><td></td></tr><tr><td>猪明胶</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>G1890</td><td>来自猪皮的粉末形式</td></tr><tr><td>Q-Exactive 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州</td><td></td><td>高分辨率质谱法</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 软件</td><td>&amp;nbsp;2024a 版本 Pro&amp;nbsp;</td><td></td><td>用于数据处理&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>水</td><td>Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>W6500</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td></td><td>（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用质谱技术对人类脑类器官进行分子成像

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry

脑类器官模型是研究人类大脑发育和功能的有力工具。质谱成像（MSI）是一项前沿技术，能够在无需特异性分子探针的情况下，对这些类器官内多种分子（如脂质、糖类、氨基酸、药物及其代谢物）的空间分布进行图谱绘制。高质量的MSI数据依赖于精细的样品制备。固定剂在此过程中起着关键作用，但传统的固定剂（如戊二醛、多聚甲醛）以及用于冷冻保护的蔗糖等可能无意中影响组织中的代谢物。理想的固定方法是液氮速冻。然而，对于小型类器官而言，更合适的方法是将类器官直接从培养箱转移至预热的包埋液中，随后在干冰冷却的乙醇中冷冻。另一个关键步骤是在冷冻切片前进行包埋，该步骤同样需要与MSI兼容的材料，因为传统试剂可能干扰基质沉积和离子化过程。本文介绍了一种针对人类脑类器官的高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）优化方案，涵盖样品制备、切片及质谱成像全过程。该方法能够以高质荷比准确性和灵敏度展示小分子代谢物（如氨基酸）的分子分布。因此，结合脑类器官的其他互补研究，该技术有助于揭示调控早期大脑发育、代谢细胞命运轨迹以及特异性代谢物特征的复杂过程。此外，它还能提供分子在类器官内精确定位的信息，从而加深我们对三维脑类器官模型空间组织结构的理解。随着该领域的持续发展，预计未来将有越来越多的研究利用MSI深入探索脑类器官及其他复杂生物系统，进一步推动对人类大脑功能与发育中代谢层面的理解。

以下方案通过质谱成像技术（MSI）优化了分子（代谢）成像（图1，另请参见 Cappuccio 等人15）。经连续切片的组织学染色验证，使用来自冷水鱼皮的10%明胶包埋可实现最可靠的数据结果和最佳的组织形态保存。利用鱼源明胶包埋60天的人脑类器官，通过MSI对三羧酸循环相关代谢物进行成像，展示了其空间分布特征（图2）。
总体而言，优化后的方案始终能够获得可靠的结果，其中以冷鱼皮来源的10%明胶作为首选包埋材料，并对NEDC基质喷涂参数进行了精细优化以提高图像分辨率。在脑类器官中检测到的小分子代谢物为理解该组织的分子复杂性提供了重要见解。
<img alt="iPSC来源脑类器官中的静态平衡；液相色谱-质谱成像质谱技术示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66997/66997fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1人类脑类器官代谢组学研究的一般流程 由个体成纤维细胞衍生的类器官 通过 诱导性多能干细胞用于液相色谱-质谱联用和质谱成像，以揭示代谢物的空间分布。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66997/66997fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示NADH、NAD⁺通路及细胞结构显微图像的 Krebs 循环示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66997/66997fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：Krebs 循环相关代谢物的定位图谱。 使用来自健康对照组的 60 天类器官，通过质谱成像（MSI）技术鉴定并分析 Krebs 循环相关代谢物的分布。图中显示了苏木精和伊红染色结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66997/66997fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

开发了一种用于脑类器官质谱成像（MSI）的先进方法，可实现对这些模型内代谢物分布的图谱绘制。该技术有助于揭示早期发育及疾病过程中脑部的代谢通路和代谢物特征，有望加深对人类脑功能的理解。

脑类器官模型是研究人类大脑发育与功能的有力工具。质谱成像（MSI）作为一种前沿技术……

我们研究了发育中人类大脑的代谢组学。由于在体内进行研究存在挑战，因此我们采用体外脑类器官模型以及先进的空间代谢组学技术来解决这一问题。近年来，基于先进主控技术的方法已迅速应用于类器官表征，并且这一趋势预计将持续发展。最近利用质谱成像（MSI）开展的代谢组学研究，展示了类器官模型在理解人类发育与疾病（包括罕见病）的分子机制以及个体化医学应用中的优势。在分子成像过程中维持类器官的分子完整性和形态结构具有挑战性，需要精确的样品处理和制备技术。为解决这一问题，已开发出一种针对脑类器官的高分辨率多模式基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）分析的专门技术。该技术在成像条件、基质涂布和组织保存之间优化了质谱信号，以确保获得可靠且高质量的数据。本综合实验方案展示了高分辨率质谱成像的潜力，并为研究人员提供了充分利用该技术深入探究类器官代谢组空间分布所需的资源。我们的研究将揭示脑类器官中与特定细胞类型相关的神经发生过程及代谢物。这种详细的代谢谱分析不仅有助于阐明这些代谢物在脑发育中的作用规律，还将识别出模拟神经发育障碍的潜在治疗干预靶点。[旁白] 首先，从培养箱中取出含有由诱导性多能干细胞衍生的脑类器官的培养瓶。使用宽口吸头将类器官从培养瓶转移至培养皿中。用不含氯化钙和氯化镁的DPBS清洗类器官三次，以去除培养基。随后用蒸馏水快速冲洗，以除去DPBS中的任何盐分。在含有100毫升DPBS的培养瓶中加入10毫克来自冷鱼皮的明胶。在70至80摄氏度下加热并搅拌该混合物两小时。然后将溶液转移至37摄氏度的培养箱中30分钟，以去除气泡。使用小移液器吸头将类器官固定在塑料模具的中央。轻轻将10%明胶包埋液倒入模具中，直至类器官完全浸没。将模具放入含有干冰上冷的100%乙醇的培养皿中。当完全冻结（表现为颜色变为均匀白色）后，从培养皿中取出类器官-明胶块。用铝箔包裹该块状物或将其放入锡杯中。密封后于零下80摄氏度保存，直至进行冷冻切片。进行冷冻切片时，将含有类器官的塑料块置于设定为零下20摄氏度的冷冻室中10至15分钟。然后在冷冻切片机上将类器官切成14微米厚的切片，并贴附于镀有氧化铟锡的玻璃载玻片上，用于质谱成像（MSI）。将载玻片在零下80摄氏度下保存，直至成像。首先，从零下80摄氏度取出贴附有脑类器官切片的氧化铟锡镀膜载玻片。将载玻片放入干燥器中20分钟，以最大限度减少大气水分在其表面的冷凝。干燥后，使用加热的气动喷雾器，将10毫克/毫升NEDC溶于70%甲醇的溶液喷洒到类器官切片上。为构建高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）平台以可视化脑类器官代谢物，将带有双离子漏斗接口的离子源安装至质谱仪上。使用连接的Q开关倍频三次的ND激光器，波长为349纳米，重复频率为1千赫兹，脉冲能量约为1.3至1.4微焦耳。为避免过度采样，将激光聚焦至直径约15微米的光斑。将样品连接至MALDI进样器载台。操作并维持高压离子漏斗压力在7.4至7.5托，低压离子漏斗压力在1.6至1.8托。对低压离子漏斗施加780千赫兹、峰峰值191伏的射频电压，对高压离子漏斗施加604千赫兹、峰峰值80伏的射频电压。为提高低质量范围内小分子代谢物的检测灵敏度，将MALDI-DMSI源中低压和高压漏斗的射频振幅分别降低至约20%和15%。设定质谱分辨率为70,000。然后选择成像区域及像素尺寸为25微米/像素。在负离子和正离子模式下，均设定母离子荷质比（m/z）范围为80至900。保持自动增益控制关闭状态，设定进样时间为250毫秒，并以轮廓模式采集傅里叶变换质谱数据。将质谱数据直接导入兼容软件中。使用卷积算法进行基线校正，并采用总离子流计数对数据进行归一化处理。利用Δm/z = 0.01或5.00 ppm的质荷比窗口宽度，从原始数据文件生成基于质量缺陷和像素覆盖率的离子图像特征列表。由单个代谢物离子种类生成伪彩色或RGB图像。将MALDI MSI获得的原始数据文件中的质荷比列表上传至人类代谢组数据库（Human Metabolome Database），以鉴定代谢物。利用鱼源明胶包埋结合质谱成像技术，对60天人脑类器官中与三羧酸循环相关的代谢物进行了空间定位分析。

molecular-imaging-of-human-brain-organoids-using-mass-spectrometry

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用质谱法对人脑类器官进行分子成像 

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

本实验方案的目的是在计划使用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI...

用于MALDI质谱成像的代谢谱分析样品制备

我们描述了一种详细的人诱导性多能干细胞来源的脑类器官的生成方案，及其在模拟线粒体疾病中的应用。...

用于线粒体疾病建模的人脑类器官生成

本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。...

利用宽场活细胞成像进行大规模及单肿瘤类器官分析的多参数类器官药物筛选

本文介绍了一种利用单细胞和单细胞核RNA测序技术生成人脑类器官并进行下游分析的综合性实验方案。...

脑类器官中单细胞与单细胞核转录组的生成及下游分析

我们提出了一种通过将诱导性多能干细胞（iPSC）来源的造血祖细胞（HPCs）整合到类器官发育过程中，以生成含常驻小胶质细胞的人脑类器官的实验方案。...

衍生含小胶质细胞发育的人脑类器官

我们介绍了一种利用低相干全息层析技术对类器官进行高分辨率、无标记、三维成像的逐步操作方案。本方案详细说明了类器官培养制备、成像采集以及计算图像分析的全过程，可实现对活体类器官结构动态变化及药物反应的实时可视化观察。...

无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

本方案详细阐述了利用质谱成像技术对糖原和N-连接聚糖进行严格且可重复测量的关键步骤。...

利用质谱技术对糖组进行空间分子成像

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。...

一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

了解质谱成像技术在人脑类器官代谢组学研究中的应用。该方法利用诱导多能干细胞衍生的脑类器官模型，实现高分辨率代谢物空间分布成像，为神经发育机制研究和神经发育障碍治疗靶点发现提供重要工具。

利用质谱技术对人类脑类器官进行分子成像

探索更多视频