用于小鼠大脑中动脉闭塞模型的手工制作硅胶涂层细丝

摘要

本方案介绍了一种使用硅胶、尼龙缝合线和注射器针头在小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中制备包被栓线的简便方法。该方法可制备出直径一致且硅胶包裹长度可根据实验需求定制的栓线。

摘要

随着全球人口老龄化，缺血性卒中已成为全球致残和死亡的第二大原因，给社会和家庭带来了巨大负担。尽管静脉溶栓和血管内介入治疗等手段可显著改善急性缺血性卒中患者的预后，但仅有少数患者能够从中获益。为了深入理解该疾病并发现更有效的治疗方法，研究人员正在持续开发和优化动物模型。其中，大脑中动脉闭塞（MCAO）模型是脑血管疾病研究中最常用的模型。该模型所使用的栓线对其建立至关重要。本方案介绍了一种制备具有恒定直径和不同长度硅胶涂层栓线的方法。该方法在C57小鼠中建立的MCAO模型表现出高成功率和良好一致性，为缺血性脑血管疾病的相关研究提供了有力工具。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的最常见病因之一。缺血性和出血性脑卒中是脑血管事件的主要类型，其中缺血性脑卒中约占病例的87%^1,2,3。目前，缺血性脑卒中患者的治疗方式主要有两种：使用重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）进行药物溶栓治疗和机械取栓术。然而，由于治疗时间窗狭窄以及存在广泛的排除标准，这些治疗方法的应用受到限制，仅有少数患者能够获益。这凸显了进一步改进缺血性脑卒中治疗策略的迫切需求^4,5。体外模型难以模拟脑卒中后复杂的病理生理反应，因此动物模型成为缺血性脑卒中临床前研究不可或缺的重要组成部分。人类局灶性脑缺血最常见原因是大脑中动脉（MCA）的血栓形成或栓塞性阻塞，这使得旨在模拟MCA阻塞（MCAO）的啮齿类动物模型具有高度相关性⁶。

线栓诱导的MCAO模型是脑卒中研究中最广泛采用的模型，可在大脑中动脉（MCA）起始处实现阻塞，并随后进行再灌注，从而导致大脑皮层下和皮层区域出现广泛的梗死。该模型的优势在于，能够在诱导局灶性缺血后恢复血流，从而模拟人类脑卒中中观察到的病理生理过程⁷。此外，该模型还能模拟再灌注损伤，这是决定损伤程度的关键因素⁸。然而，MCAO模型也存在局限性，包括梗死体积的变异性较大，在某些研究中，标准差可能高达平均值的64%⁹。尽管该模型已使用超过三十年，研究者仍在持续努力提高其可靠性，但不同研究和实验室之间缺血性病灶体积的显著差异仍然存在^10,11,12。

本文介绍了一种自制的线栓，用于诱导评估神经功能缺损评分和脑梗死面积的模型。该研究探讨了硅胶包被线栓长度与大脑中动脉阻塞（MCAO）模型成功率及稳定性之间的相关性。该制备技术所获得的线栓具有一致性良好等特点，有助于建立相对稳定的MCAO模型。

方案

所有动物实验均遵循经山西省人民医院机构动物护理和使用委员会批准的实验程序和标准（批准编号：2024省级医学伦理委员会第64号）。本实验所用小鼠为雄性C57BL/6小鼠，8-10周龄，体重24-26 g。所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 丝状体的制备

1. 标记原始尼龙丝：将6-0尼龙缝线均匀缠绕在塑料直尺板上。在尼龙丝头部（包括涂层标记点和插入深度标记点）起始处的5 mm和10 mm位置做标记。
2. 用刀片垂直向下切割，确保两端截面完全呈圆形，制得初始长度为2 cm的尼龙丝（图1）。
3. 制备涂层装置：使用止血钳折断26 G注射器针头，再用砂纸将针孔打磨成完美的圆形。用10 mK注射器抽取2 mL K-704硅胶密封剂，最后将处理好的针头连接到注射器上。
4. 尼龙丝涂层：将初始尼龙丝插入已准备好的针孔中，直至达到标记的5 mm或10 mm位置。在体视显微镜下，缓慢而稳定地推动注射器，使尼龙丝表面完全覆盖涂层（图2）。
5. 固化涂层尼龙丝：用胶带将涂覆后的尼龙丝垂直固定，静置约20分钟，使硅胶充分固化。
6. 灭菌与包装：将制备好的尼龙丝浸入75%酒精中，用棉签擦干后，分装至5 mL离心管中。

2. MCAO 模型

注意：手术器械通过高压灭菌（121 °C、15 psi，持续60分钟）进行灭菌。手术台及其他设备使用75%乙醇进行消毒。小鼠术前禁食8小时，但可自由饮水。

1. 手术前60分钟，皮下注射美洛昔康（meloxicam）5 mg/kg以进行镇痛。连接加热毯，在麻醉期间维持小鼠体温在37 °C。
2. 使用4%异氟烷（isoflurane）诱导麻醉，直至自发运动和胡须抽动消失，随后将麻醉维持在1.5%（遵循机构批准的方案）。在双眼涂抹眼膏。
3. 将小鼠置于仰卧位，固定其头部和四肢，剃除颈部和上胸部的毛发，并用75%乙醇由内向外消毒皮肤。
4. 沿颈部正中线从下颌至胸骨做一条长约2.5 cm的皮肤切口。
5. 钝性分离右侧颈部肌肉以暴露颈动脉鞘。使用眼科镊打开鞘膜，分离出颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），注意避免扰动迷走神经。
6. 在分叉前用滑结暂时结扎CCA，并用显微外科动脉夹夹闭ICA。
7. 使用双极电凝笔烧灼ECA发出的甲状腺上动脉。
8. 在ECA上保留两根缝线用于结扎：远端一根用于永久结扎，近端一根打松结以备后续使用。使用眼科剪在ECA上两根结扎线之间做一个约0.5 mm的切口，以便插入线栓。
9. 将5 mm或10 mm硅胶包被的线栓经切口插入CCA，然后拉紧松结将其固定。
10. 剪断ECA远端并移除ICA上的动脉夹后，将线栓回撤至CCA分叉处。然后翻转并推进线栓进入深部ICA，直至感到阻力。轻微回撤线栓，然后拉紧结扎线将其固定。
11. 用3-0缝线缝合动物皮肤，并用碘伏消毒伤口。将小鼠放入恢复舱中1小时。
12. 再次麻醉小鼠，轻柔地拔出线栓，结扎固定线栓的ECA结扎线，并松开CCA的滑结以恢复血流，实现大脑中动脉的再灌注。
13. 剪除多余的缝线，缝合颈部皮肤，并再次消毒该区域。

3. 假手术操作

1. 对于假手术操作，插入一根7 mm硅胶包被的丝线以阻塞右侧大脑中动脉，随后立即撤出，以实现即时再灌注。
   注意：后续操作步骤与经历脑缺血的动物实验完全相同。

4. 神经功能评分

1. 将每组实验动物置于开放场地中，在脑缺血再灌注后 4 h 进行行为学术后评分。
2. 若模型构建成功，评分应在 1 至 3 分之间。评估标准依据 Longa 评分方法¹⁰，详见表 1。
3. 根据改良神经功能缺损评分（mNSS）¹³评估神经功能缺损情况，并在再灌注后 24 h 和 72 h 进行评估（见表 2）。

5. 经心脏灌注

1. 按照机构批准的方案，使用1.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠。将小鼠放回笼中，静置10分钟。随后轻捏小鼠脚趾，检测反射是否消失，以确认处于深度麻醉状态。
2. 将小鼠仰卧位固定于泡沫支架上，并固定四肢。
3. 剪去25 G针头的尖端使其变钝，以防止刺破主动脉壁。将针头连接至装有20 mL生理盐水的注射器。
4. 提起胸部毛发，用剪刀剪开皮肤以暴露剑突。夹住剑突并在其下方水平剪开，切开肌层以暴露膈肌。用剪刀小心剪开膈肌，避免损伤心脏。
5. 沿胸骨外侧缘剪开，打开双侧肋骨，翻起胸腔前壁，并用止血钳固定。
6. 用棉签清除心脏基底部的脂肪组织，暴露主动脉根部。
7. 用镊子固定心脏，从心尖处插入针头，并斜向上推进，直至针头透过主动脉壁可见。用止血钳固定针头位置。
8. 在右心房处做一小切口以观察血液流出情况。用注射器平稳灌注生理盐水，观察血液从右心房流出。当流出液变澄清时，停止灌注¹⁴。
9. 灌注完成后，将小鼠断头取脑¹⁵，并将脑组织置于-20 °C冰箱中以备后续处理。

6. 通过 TTC 染色评估梗死体积

1. 将获取的脑组织在 -20 °C 冰箱中快速冷冻 20 分钟，然后置于预冷的脑切片模具上，切成 1 mm 厚的切片。
2. 将获得的脑切片浸入 2% TTC 溶液中，在 37 °C 下孵育 20 分钟。
3. 将脑切片浸入 4% 多聚甲醛中过夜，次日拍照记录。
4. 使用 ImageJ 测量每张切片的梗死面积和总脑面积。按以下公式计算梗死体积比：梗死体积百分比 % =（梗死面积总和 / 总脑面积总和）× 100%。

结果

在制备MCAO模型时，用于制作线栓的工具及制备完成的线栓如图3所示。线栓制备完成后，通过颈外动脉插入线栓以建立MCAO模型，并记录手术持续时间。线栓撤出4小时后，若Longa评分达到1-3分，则定义为建模成功。术后每日监测体重变化。术后24小时和72小时采用改良神经功能缺损评分（mNSS）评估神经功能缺损情况。缺血性损伤通过TTC染色进行评估。

在10 mm线栓组中，10只小鼠中有5只发生了蛛网膜下腔出血（SAH），其中2例为致命性出血。因此，这5只受影响的小鼠均被排除在研究之外。相比之下，5 mm线栓组的小鼠均未发生SAH。5 mm线栓组的造模成功率为100%，显著高于10 mm线栓组的50%成功率。

手术时间定义为从皮肤切开至线栓插入的持续时间，5 mm 线栓组显著短于 10 mm 线栓组（614 秒 ± 49.15 秒 vs. 758 秒 ± 65.63 秒，P < 0.01）（...

讨论

本研究展示了一种简单且成本效益高的制备栓线的方法，并证实了其在构建大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中的可行性。栓线硅胶涂层的长度可根据实验需求进行调整，提供了额外的灵活性。制备5 mm栓线栓子在小鼠实验中实现了100%的成功率，且未发生任何蛛网膜下腔出血（SAH）。在使用10 mm栓线栓子的组别中，出现了SAH病例，而其余小鼠均显示出大脑中动脉区域明确的梗死。降低SAH发生率的关键步骤是在操作过程中遇到阻力时轻微回撤栓线。在初步实验中，当使用5 mm硅胶涂层栓线时，未进行此调整的小鼠中近一半发生了SAH。栓线在到达小鼠前 cerebral 动脉时会遇到阻力¹²。因此，在回撤栓线前小鼠体位的任何轻微变动均可能导致血管破裂。轻微回撤栓线可有效阻塞大脑中动脉起始部，同时防止栓线尖端进入前 cerebral 动脉（ACA）而引发SAH。

使用10 mm尼龙线时，蛛网膜下腔出血（SAH）的发生率较高，这可能归因于硅胶涂层长度增加导致尼龙线柔韧性降低。这种刚性增加可能使尼龙线在插入过程中遇到阻力时刺破血管。此外，10 mm组的手术时间更长，这与操作...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 注射器	Haidike Medical Products Co., Ltd.		制备纤维的器械
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）	Sigma-Aldrich	G3005	TTC 染色用染料
24 孔细胞培养板	Corning	CLS3527	TTC 染色用容器
26 G 注射器针头	Haidike Medical Products Co., Ltd.		制备纤维的器械
4% 多聚甲醛	Servicebio	G1101	组织固定
6-0 尼龙缝线	Haidike Medical Products Co., Ltd.		制备纤维的材料
异氟烷麻醉系统	Rwd Life Science Co., Ltd.	R610	动物麻醉
双极电凝发生器	Yirun Medical Instrument Co., Ltd.	ZG300	手术设备
恒温水浴锅	Spring  Instrument Co., Ltd.	HH-M6	TTC 染色
眼膏	广州药业	H44023098	手术用材料
加热垫	ZH Biomedical Instrument Co., Ltd.		维持体温
异氟烷	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	动物麻醉
美洛昔康	Boehringer-Ingelheim	J20160020	动物镇痛
显微外科动脉夹	上海金钟外科器械有限公司	W40130	手术器械
显微外科止血钳	上海金钟外科器械有限公司	M-W-0022	手术器械
显微外科器械套装	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	手术设备
小鼠体温计	湖北大佳尔生物科技	FT3400	术中体温监测
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761	动物安乐死
剃毛器	Joyu 电器	PHC-920	手术设备
硅胶密封剂	Kafuter	K-704	制备纤维的材料
体视显微镜	Rwd Life Science Co., Ltd.	77001S	手术设备
带针缝线（3-0）	上海浦东金环医用材料有限公司	F404SUS302	手术设备