利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

我们的研究目标是建立可靠的技术，以生成源自成年牛小肠和大肠类器官的稳定肠道单层界面。我们采用多模式分析方法，验证了所建立的单层结构中功能性上皮屏障的形成。与三维模型不同，二维单层结构提供了一个暴露且易于接触的管腔表面，这对于研究宿主与病原体之间的相互作用至关重要。

这些包含多种细胞谱系、模拟体内肠道环境的单层细胞现在为研究特定肠道区域（如小肠和大肠微环境）中的病原体提供了定制化的实验方案。我们的研究确定了优化的培养条件，可从小牛小肠和大肠类器官细胞中建立并维持二维单层细胞。我们通过跨上皮电阻测量、细胞旁路通透性检测以及免疫细胞化学染色技术，证实了这些单层细胞能够形成具有功能的上皮屏障。

本方案针对研究空白，聚焦于缺乏源自牛肠道类器官的单层细胞模型这一问题。尽管此类模型在小鼠和人类中已有深入研究，但牛作为具有重大公共卫生意义的肠道病原体的重要储存宿主，其相关模型却尚未得到充分探索。本研究建立并表征了一种牛源二维单层细胞培养系统。

这一创新工具可用于研究牛肠道生理的正常与疾病状态，其潜在应用可延伸至具有重要公共卫生意义的生物医学和转化研究。首先，对用于类器官来源的二维单层培养的细胞培养小室中的细胞外基质进行包被。向每个准备好的细胞培养小室的顶端腔室中加入 100 µL 细胞外基质包被液，并盖上盖子。

然后将细胞培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育1小时。对于直肠类器官细胞，孵育后用直肠单层培养基替换细胞外基质包被，并过夜孵育。在类器官经酶消化并过滤为单细胞后，将细胞悬液在4摄氏度下以200 ×g离心5分钟，然后弃去上清液。

接下来，每孔细胞培养插件中加入200微升单层培养基中的细胞悬液。取出含有包被了细胞外基质的细胞培养插件的24孔细胞培养板。使用真空抽吸，小心吸去每个细胞培养插件的顶室液体，避免破坏基质包被。

将200微升单细胞悬液小心地加入每个细胞培养小室的顶端室中。向每孔的基底外侧室加入500微升适当添加补充物的单层培养基。随后将培养板置于湿润的培养箱中孵育，以促进细胞黏附和生长，在细胞培养小室上形成融合的二维单层细胞层。

从细胞接种后48小时开始，每隔一天更换一次顶腔和基底外侧腔中的培养基。对于类器官来源的二维单层细胞的免疫荧光染色，用手术刀片小心切下细胞培养插件的膜，并将该膜置于载玻片上。在盖玻片上加入封片剂，然后将其放置在载玻片上，再进行细胞观察。

将解离后的成熟类器官接种到细胞培养小室上一天后，可见形成了一层二维单层细胞。接种五天后，扫描电子显微镜显示，二维单层细胞的顶面具有发育良好的微绒毛和清晰的细胞边界。免疫荧光染色证实，在回肠和直肠类器官来源的二维单层细胞中均存在顶面刷状缘、基底外侧黏附连接以及产黏液的杯状细胞。

首先，从培养箱中取出含有类器官来源的二维单层细胞的细胞培养小室板。移除待检测细胞培养小室的顶腔和底腔中的单层细胞培养基。用预热的 PBS 分别轻轻洗涤顶腔和底腔各两次，每次分别加入 200 和 500 微升。

从顶端室中移除洗涤液，并向细胞培养插件的顶端室加入200微升含0.5毫克/毫升、4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的PBS溶液。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育20分钟。随后，从孵育后的24孔板的基底侧室中取50微升样品，转移至适用于酶标仪的96孔板中。

在取样孔的基底侧室中加入 50 微升新鲜 PBS。使用预先校准的微孔板读数仪，立即在激发波长 495 纳米和发射波长 535 纳米的条件下测定荧光强度。