Name: 使用小肠和大肠单层界面的牛类器官技术的进步 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 了解牛小肠和大肠类器官来源的二维单层培养技术，用于研究宿主与病原体相互作用。该方法通过跨上皮电阻和渗透性检测评估屏障功能，为牛肠道生理学和疾病研究提供创新模型。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院院长办公室（资助号：K01OD030515 和 R21OD031903，授予 YMA）以及华盛顿州立大学VCS研究生与博士后研究基金（授予 GDD）的支持。作者感谢参与研究的屠宰场提供供体牛只。

肠隐窝取自当地屠宰场剩余的肠组织样本，供体信息详见补充表1。类器官所用组织来源于在屠宰场被实施人道安乐死的动物，未专门为此研究单独获取动物；因此，本研究免于接受IACUC审查，无需提供伦理声明。
1. 类器官来源的二维单层培养中细胞培养小室的细胞外基质包被
注意：所有操作均在生物安全柜中使用灭菌材料和无菌技术进行。除非另有说明，所有试剂在整个操作过程中均需保持在冰上。
<ol>
	<li>在微量离心管中，将基础培养基与2% (v/v) 细胞外基质（ECM）水凝胶充分混合，为每个0.33 cm2的细胞培养小室准备100 µL ECM包被液。</li>
	<li>使用无菌镊子将单个细胞培养小室从包装中取出，并分别放入24孔透明平底细胞培养板的孔中。</li>
	<li>将步骤1.1中制备的100 µL ECM包被液加入步骤1.2中已准备好的每个细胞培养小室的顶室侧。</li>
	<li>盖上盖子，将含有已包被ECM的细胞培养小室的培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育1小时。
	<ol>
		<li>对于回肠类器官细胞，小室在孵育1小时后即可使用。对于直肠类器官细胞，在孵育1小时后，需将ECM包被液替换为直肠单层培养基，并过夜孵育（表1）。若计划进行TEER测量，应额外准备用于空白对照的细胞培养小室。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>回肠</td>
			<td>直肠</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞外基质包被孵育时间</td>
			<td>1 h</td>
			<td>1 h，随后 
			 在单层培养基中过夜培养</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">补充剂 
			类器官培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2157299</td>
			<td>LY2157299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td>胎牛血清</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞接种密度（细胞/孔）</td>
			<td>5 × 105</td>
			<td>3 × 105</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：成年牛回肠和直肠类器官来源的二维单层细胞培养优化方案摘要。
2. 牛回肠和/或直肠类器官细胞接种与二维单层培养
注意：本节所述方案使用牛回肠和直肠类器官，这些类器官采用所描述的技术在48孔板中进行培养和维持5。为获得最佳结果，建议使用在初次建立后已连续传代超过3代、且最近一次传代后已培养超过3天的稳定类器官。
<ol>
	<li>在不扰动含有成熟类器官的基于细胞外基质的水凝胶穹顶的情况下，使用连接真空系统的 disposable glass Pasteur pipet 移除类器官培养基，并添加 300 µL 每孔加入冰冷的ECM去聚合溶液。在至少1 h内孵育 4 °C. 
	注意：或者，在添加 ECM 去聚合溶液后，机械破坏含有类器官的基于 ECM 的水凝胶 dome，将悬浮液收集至 15 mL 圆锥形试管中，再进行孵育 4 °C当在同一块培养板上同时培养不用于二维单层培养的类器官时，建议采用此方法。类器官培养的密度会显著影响接种到细胞培养插件时所需类器官培养孔的数量。
	<ol>
		<li>对于高密度类器官培养（补充图1A），直肠细胞培养插入物使用的接种比例范围为1:1至1:2，即一个培养孔可接种一到两个孔。对于回肠，应保持1:1的比例。相比之下，低密度培养（补充图1B需要更多的培养孔；每个直肠细胞培养小室使用3-4个直肠类器官培养孔（3-4:1比例），每个回肠细胞培养小室使用4-5个回肠类器官培养孔（4-5:1比例）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>目视检查基于ECM的水凝胶是否完全溶解，并将类器官悬液收集至15 mL锥形管中。</li>
	<li>通过200 × g离心沉淀类器官 g 和 4 °C 5 分钟。弃去上清液。将沉淀物重悬于 1 mL 添加有重组细胞解离酶溶液的 10 µM Y-27632</li>
	<li>孵育类器官悬液 37 °C 水浴10分钟，每2-3分钟用涡旋振荡器短暂振荡3-5秒，以促进类器官有效解离。</li>
	<li>经酶消化后，加入5 mL基础培养基，使用P1000移液器剧烈吹打，以进一步将类器官解离为单细胞。观察细胞悬液中是否存在类器官团块，若仍可见明显团块，则重复吹打操作以促进单细胞解离。</li>
	<li>准备一个50 mL的锥形管 70 µm 细胞滤筛。通过加入1-2 mL基础培养基预润湿滤筛。</li>
	<li>通过滤器过滤细胞悬液，以去除残留的基于ECM的水凝胶碎片和较大的细胞团块。冲洗原始的15 mL离心管并 70 µm 细胞滤筛中加入额外的10 mL基础培养基。 
	注意：如果细胞悬液难以顺利通过滤网，可能表明类器官解离不完全。可将收集的细胞悬液再次通过同一滤网重复过滤 70 µm 可尝试使用细胞滤筛。可能需要额外的酶解或机械破碎处理。</li>
	<li>通过200 x g离心沉淀单细胞悬液 g 和 4 °C 孵育5分钟。移除上清液，并用适量基础培养基重悬细胞，进行细胞计数。</li>
	<li>使用台盼蓝染色后，用血细胞计数板对活细胞进行计数，以计算所收集的细胞总数。</li>
	<li>通过200 x g离心沉淀单细胞悬液 g 和 4 °C 5 分钟。弃去上清液，用相应的单层培养基将细胞重悬至适当的接种密度（表1).
	<ol>
		<li>对于回肠类器官细胞，将细胞重悬至浓度为 2.5 x 106 细胞/mL，以达到 5 × 10 的接种密度5 每细胞培养小室中的细胞数 200 µL 添加500 nM LY2157299的回肠类器官单层培养基，即在类器官培养基中补充500 nM LY2157299 10 µM Y-27632 和 20% 胎牛血清（FBS）</li>
		<li>对于直肠类器官细胞，将细胞重悬至浓度为 1.5 x 106 细胞/mL，以达到 3 x 10 的接种密度5 每个细胞培养插件中的细胞数 200 µL 直肠单层培养基，即在类器官培养基中添加100 nM CHIR99021和500 nM LY2157299 10 µM Y-27632 和 20% FBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取出24孔细胞培养板，内含ECM包被的细胞培养小室，用真空吸管小心抽吸细胞培养小室的顶腔液体，注意不要破坏包被层。</li>
	<li>轻柔施加 200 µL 将步骤2.10制备的单细胞悬液加入细胞培养小室的顶端室。作为空白对照，加入 200 µL 在顶端室中加入不含细胞的培养基。对于空白对照，添加 200 µL 无细胞的顶室培养基</li>
	<li>应用 500 µL 向每个孔的基底外侧室加入适量添加补充物的单层培养基（根据回肠或直肠细胞的不同而定）。</li>
	<li>在湿润的培养箱中孵育 37 °C 和 5% CO2 促进细胞黏附和生长，以在细胞培养插件上形成融合的二维单层。</li>
	<li>从细胞接种后48小时开始，每隔一天更换一次顶端和基底外侧腔室中的培养基。确保空白对照组与含细胞的插入式培养小室具有相同的孵育时间。</li>
</ol>
3. TEER 测量
注意：此处描述的方法使用一种市售的手动TEER测量系统，称为带有Ag/AgCl电极对的上皮伏特-欧姆计（图1A）。测定二维单层细胞跨上皮电阻（TEER）时需测量空白孔，确保空白读数的操作方式与样品测量一致。
<ol>
	<li>从培养箱中取出含有类器官来源的二维单层细胞及空白对照的细胞培养小室板，静置约10分钟，使其升至室温。</li>
	<li>用70%乙醇对电极进行消毒，并使其完全干燥。</li>
	<li>小心地将电极插入，短端置于顶侧腔室，长端置于基底外侧腔室（图1A）。 
	注意：需格外小心，避免破坏细胞单层结构。</li>
	<li>等待读数稳定后，记录欧姆（ohm）数值。 
	注意：由于伏欧姆表的灵敏度较高，在测量电阻时欧姆值可能会出现波动。当读数趋于稳定并在某一平台值附近持续波动时，即可获得可靠的测量结果。</li>
	<li>使用以下公式计算二维单层细胞的经上皮/内皮电阻（TEER）： 
	TEER (Ω × cm2) = 细胞培养小室的表面积 (cm2) × 净电阻值 
	其中，净电阻值等于细胞单层小室测得的电阻减去空白小室测得的电阻。24孔板所用细胞培养小室的表面积为0.33 cm2。</li>
</ol>
<img alt="跨上皮电阻（TEER）检测示意图；显示七天内TEER数据的变化曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：牛肠道类器官来源的二维单层细胞上皮屏障完整性的评估。（A）用于TEER测量时，电极在细胞培养小室的顶侧和基底外侧腔室中正确放置的示意图。短电极插入顶侧腔室，长电极置于基底外侧腔室，注意避免与膜接触。（B）通透性检测流程示意图。细胞培养小室用预温的PBS洗涤两次，然后将含有0.5 mg/mL 4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的PBS加入顶侧腔室。在孵育期间，定期从基底外侧腔室取50 µL等份样本，并补充等体积的PBS，以维持基底外侧腔室的总体积不变。使用酶标仪测定所取样本的荧光强度，以量化4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂穿过细胞单层的扩散情况。（C）通过TEER测量（空心圆代表回肠，空心方块代表直肠）和通透性检测（实心圆代表回肠，实心方块代表直肠），结合4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂，评估回肠和直肠单层细胞随时间推移的屏障完整性动态发育过程。培养至第3天时，两种类型的单层细胞均形成了稳定且具有功能的上皮屏障，其TEER值和通透性特征可作为证据。结果来自至少两次独立实验，每次实验设两个技术重复。误差条表示测量值的标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 细胞旁通透性检测
注意：本实验通过测定在120分钟内荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）从顶端腔室扩散至基底外侧腔室的荧光强度，来评估二维单层细胞的通透性（图1B）。为获得最佳结果，建议在实验过程中尽量减少样品暴露于光线下，并在每次取样后立即使用微孔板读数仪进行检测，以避免荧光信号减弱或淬灭。每个孔仅能使用一次，不可在后续实验中重复使用。每次实验应至少设置2个孔作为技术重复。例如，为获得 图1C 所示的结果，需在培养的第1、3、5天这三个不同时间点分别进行重复实验，共需6个孔。
<ol>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）配制4 kDa FITC-葡聚糖的标准曲线稀释系列。每次稀释后，取50 µL加入96孔板中，每组设三个复孔。 
	注意：建议配制5–7个浓度梯度，浓度范围为0至0.5 mg/mL。</li>
	<li>使用预先校准的酶标仪，在激发波长495 nm、发射波长535 nm条件下测定各标准品的荧光强度。</li>
	<li>根据荧光强度结果计算线性回归，绘制标准曲线。</li>
	<li>从培养箱中取出含有类器官来源的2D单层细胞的细胞培养小室板。移除待检测的细胞培养小室中2D单层细胞的顶腔和基底外侧腔中的培养基。</li>
	<li>分别用200 µL（顶腔）和500 µL（基底外侧腔）预热的PBS轻柔清洗每个腔室2次。</li>
	<li>吸除顶腔中的清洗液，向细胞培养小室的顶腔加入200 µL含0.5 mg/mL 4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的PBS溶液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育20分钟。</li>
	<li>从孵育后的24孔板的基底外侧腔中取50 µL样品，转移至适用于酶标仪检测的96孔板中。</li>
	<li>在取样的孔的基底外侧腔中补充50 µL新鲜PBS。</li>
	<li>立即使用预先校准的酶标仪在激发波长495 nm、发射波长535 nm条件下测定荧光强度。</li>
	<li>每20分钟重复步骤4.6–4.10，持续至120分钟。实验结束时，若需保存2D单层细胞，可用新鲜PBS清洗顶腔和基底外侧腔各2次，更换为新鲜的单层细胞培养基，并继续培养。 
	注意：可对2D单层细胞进行进一步分析，如TEER测量、免疫荧光染色等；但不推荐，因残留荧光示踪剂可能干扰后续分析。</li>
	<li>使用以下公式计算表观通透系数（Papp）： 
	<img alt="通透性公式 P_app=ΔQ/ΔtA×C_o；静态平衡分析示意图。" src="/files/ftp_upload/67010/67010eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	ΔQ / Δt = 在特定时间内透过单层细胞进入细胞培养小室基底外侧腔的荧光示踪剂浓度，通过荧光强度测定并根据标准曲线换算为µg/mL 
	A = 细胞培养小室的表面积 
	Co = 加入细胞培养小室顶腔的荧光示踪剂浓度，单位为µg/mL</li>
</ol>
5. 类器官来源的二维单层细胞的免疫荧光染色
<ol>
	<li>用真空抽吸法移除细胞培养插件中的单层培养基，加入 200 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA），室温孵育 15–30 分钟以固定细胞。</li>
	<li>用真空抽吸法移除 PFA，加入 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 2 次。</li>
	<li>加入含 0.3% Triton X-100 的 2% 牛血清白蛋白（BSA）PBS 溶液 100 µL，室温孵育 10 分钟，以通透细胞。</li>
	<li>用真空抽吸法移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 2 次。</li>
	<li>移除上清液，替换为含 2% BSA 的 PBS 溶液，室温孵育 1 小时以进行封闭。</li>
	<li>移除上清液，加入 100 µL 用含 2% BSA 的 PBS 稀释的一抗溶液，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。 
	注意：所用一抗的浓度见材料表。除非另有说明，均按照生产商推荐条件操作。</li>
	<li>移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>加入 100 µL 用含 2% BSA 的 PBS 稀释的二抗溶液，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。 
	注意：若使用的一抗已偶联荧光探针，则此步骤可省略。所用二抗的浓度见材料表。除非另有说明，均按照生产商推荐条件操作。</li>
	<li>移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>可选步骤：如需对 F-肌动蛋白和细胞核（DAPI）进行复染，可将两种探针按生产商推荐的适当稀释比例溶于 PBS 中，混合后加入 100 µL，室温孵育 30 分钟。随后移除上清液，加入 100 µL PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>用手术刀片小心切下细胞培养插件的膜，将其置于载玻片上，加入封片液，加盖盖玻片后观察。</li>
</ol>

Developing 2D Monolayer Cultures from Bovine Intestinal Organoids

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<li>Fitzgerald, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+sub-type+2a+increases+the+efficiency+of+Escherichia+coli+O157+transmission+between+animals+and+restricts+epithelial+regeneration+in+bovine+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids.</a> PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003(2019).</li>
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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

肠道健康对牛的生产性能和整体健康至关重要16利用类器官衍生的二维单层技术，科学家现在能够更准确地在体外模拟牛肠道上皮的复杂结构 体外 设置5这种创新方法不仅重现了肠道内衬的多样化细胞组成，包括其多细胞谱系，还捕捉到了关键的功能特征，例如黏液分泌和微绒毛的存在，这对于理解肠道生理学和病理学至关重要。3回肠和直肠组织的定制化培养方案的建立，为研究牛肠道健康提供了一个先进的平台，显著提升了研究能力。这一复杂的方法能够深入探究人畜共患病原体与牛肠道环境之间的相互作用。该技术可精确模拟并研究牛肠道生态系统所具有的独特特征 体外 是开发针对性策略以改善家畜健康并减缓人畜共患病传播的重要一步。
然而，为了利用牛肠道类器官成功实现二维单层培养，关键在于维持类器官及其解离后的单个细胞的健康与活力。谨慎操作并尽量减少细胞应激对于保持细胞完整性和功能至关重要，而这些因素正是类器官有效生长以及后续形成功能性单层结构所必需的。此外，获得均匀的单层结构依赖于将类器官成功解离为单细胞，且避免形成大的细胞团块。此类团块会干扰细胞分布，破坏单层结构的完整性。因此，采用精确的解离技术至关重要，以获得均一的单细胞悬液。同时，在细胞贴壁过程中以及洗去未贴壁的多余细胞时，尽量减少干扰也十分有益。这一策略对于解决潜在的三维形态发生问题尤为重要，有助于全面提升单层培养的质量。
使用生物来源的细胞外基质（ECM）水凝胶时，一个显著的挑战是其成分存在批次间差异17。尽管在使用所述方案和材料时未观察到此类情况，但ECM成分的批次间差异可能会影响单层细胞的成功形成。当更换ECM产品、品牌或批号导致单层形成受损时，可能需要进行优化步骤，以确定用于包被细胞培养小室的合适ECM浓度。
此外，在进行任何操作前将培养基调节至室温，是减轻热休克、保护细胞健康以及维持类器官和单层培养物质量的关键步骤。在单层结构形成及其后续检测过程中，轻柔的洗涤操作对于维持单层完整性也至关重要，避免扰动可防止实验结果出现偏差。当反复洗涤或长时间暴露于PBS（如在细胞旁通透性检测中）导致单层脱落时，用Hank's平衡盐溶液（HBSS）替代PBS似乎有助于减少脱落现象。最后，根据来自肠道不同节段（如回肠和直肠）细胞的特定需求定制培养基，对于准确模拟这些区域的生理环境至关重要 体内 条件。这种特异性可确保细胞处于最佳健康状态和功能活性，有助于精确模拟牛肠道生理及其与病原体的相互作用，从而凸显了类器官研究中这些关键步骤的重要性。
除了采用轻柔的细胞操作技术外，掌握与细胞计数和跨上皮电阻（TEER）测量相关的熟练技术能力，对于成功构建功能性的二维单层细胞层至关重要。由于细胞计数过高或过低分别会导致接种密度过高或过低，进而影响单层细胞的正常生长。因此，当怀疑接种密度不准确时，建议仔细复查细胞计数结果，并确保接种密度适当。此外，不恰当的TEER测量技术可能导致电极意外划伤细胞层，从而破坏单层结构。将电极小心地插入顶端腔室，并特别注意保持其相对于膜表面的垂直方向，有助于降低意外损伤单层细胞的风险。
此处所述的细胞旁通透性检测方法已根据先前的实验方案进行了调整18对已报道方案的修改，包括在120分钟内进行多次取样，并以等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）替换所取样品，旨在提高结果的准确性和可靠性。维持腔室内总体积恒定至关重要，原因如下：保持渗透压平衡、确保细胞完整性、维持准确评估通透性所必需的浓度梯度，并防止静水压改变而影响物质转运速率。通过补充与所取含荧光示踪剂PBS体积相等的新鲜PBS至基底外侧腔室，是维持上述条件的关键步骤，从而实现对单层细胞通透性的准确且有意义的评估。旁细胞通透性检测通过直接测定示踪分子穿过细胞单层的迁移情况，可作为跨上皮电阻（TEER）测量的补充手段。此外，由于多种因素（如温度、细胞类型、传代次数以及培养基成分等细胞培养条件）可能影响TEER数值，不同实验室之间的TEER值比较可能无法提供具有可比性的结果。19细胞旁通透性检测提供了一种功能性评估方法 体外 上皮屏障中黏附连接和紧密连接有效表达的评估20.
尽管从三维类器官开发出二维单层细胞培养技术代表了培养技术的重要进步，但有必要认识到二维单层培养系统所存在的局限性。其中一个主要缺点是，该系统仍为静态培养体系，缺乏体内所存在的动态刺激， 体内 环境。此外，由于该培养系统采用带盖培养板的开放式设置，调节系统内氧气含量存在困难，因此不太适合与厌氧菌进行长期共培养。这些局限性或许可通过采用更动态的培养平台（如微流控系统）加以解决。21，可提供更可控且更接近生理条件的环境。此外，必须认识到，尽管目前的培养条件富含有利于维持干细胞生长的营养成分，但这些条件可能并非诱导上皮细胞生理性分化的最佳选择。这一差异凸显了未来研究中亟需优化培养体系，以更精确地模拟生理环境 体内 条件并支持分化过程。通过解决这些局限性并优化这些方法，类器官培养技术的实用性和适用性得到提升，更接近于模拟胃肠道复杂的动态变化和相互作用 体外.
从牛回肠和直肠组织生成二维单层细胞的实验方案为研究人员提供了一种有价值的 体外 小肠和大肠上皮腔面界面模型。该模型为动物营养学基础研究的应用开辟了广阔前景，尤其适用于探究不同条件下营养物质的吸收机制。一个备受关注的研究领域是“肠漏综合征”（leaky-gut syndrome），其特征为胃肠道通透性异常升高，常由饮食改变和极端环境温度所诱发。22,23此外，该模型是研究肠道微生物组与其宿主之间复杂相互作用的重要工具，可用于探讨共生微生物如何影响宿主生物的健康状况，从而解决兽医学和医学科学中的一个关键问题。1,24此外，人类食源性病原体常作为共生菌存在于牛肠道的不同区段8,9,25该方案能够实现对这些人畜共患病原体在其特定生态位中繁殖所需具体条件的深入研究。
在整个研究过程中，观察到直肠和回肠类器官来源的单层细胞需要不同的条件才能成功发育。具体而言，当最初将直肠类器官来源的单层细胞接种至基础培养基中含2%细胞外基质（ECM）水凝胶、预处理1小时的细胞培养小室时，出现了较大的孔洞和细胞脱落现象。通过改用特制的直肠单层细胞培养基，并将孵育时间延长至接种前过夜，该问题得以解决；而回肠类器官来源的单层细胞则可通过较短的制备流程成功建立。此外，在培养基中添加CHIR99021 consistently 有助于直肠单层细胞的建立26，但对回肠单层细胞则非必需27。另外，回肠单层细胞的成功发育相比直肠类器官需要更高的细胞密度27。这些优化后的条件（表1）已多次成功建立具有稳定屏障完整性的单层细胞模型，凸显了根据不同肠道节段特性定制培养条件的重要性。
获得能够准确反映多细胞谱系复杂性的模型 体内 肠道对于这些研究至关重要。它使研究人员能够紧密模拟肠道环境的自然条件，为实验提供更可靠的依据。通过本方案，研究者将获得一个强大的模型，从而增强其研究能力，有望在各自研究领域取得突破性发现。该方法不仅有助于深入理解肠道健康与疾病，还为改善畜牧业管理和食品安全策略的制定提供支持。

三维（3D）培养肠道上皮干细胞，即肠道类器官，标志着一项重大进展 体外 用于研究肠道功能、营养及与病原体相互作用的技术1,2这些类器官模拟了复杂的结构 体内 通过自我复制并组织形成包含多种肠细胞谱系的三维结构来构建肠上皮3这一特性凸显了它们在推动肠道生物学研究进展方面的重要潜力。
将肠道类器官技术应用于农场动物的兴趣日益增长，这要求对培养和维持技术进行优化4,5。该技术的重要性在于其在研究农场动物肠道健康方面的潜在影响，而肠道健康在动物生产性能中起着关键作用，进而通过影响动物福利和运营成本，关系到食品动物产业的经济效益6,7。特别是，利用肠道类器官培养来探究牛的肠道功能尤为重要，因为牛是沙门氏菌（Salmonella spp.）和大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）O157:H7等动物源性肠道病原体的储存宿主8。这些病原体定位于肠道的特定节段，因此有必要根据不同肠道节段建立差异化的肠道类器官培养方法，以提高研究的精确性9。
肠道类器官研究中的一个重大障碍是难以接近上皮细胞的顶面10当细胞在细胞外基质（ECM）中培养时，会自然定向，使其基底面朝外，顶面朝内。10为解决这一挑战，本文介绍了一种将三维类器官解离为单细胞，并将其接种至半透性细胞培养小室中的方法。该体系可在细胞顶面与基底外侧区室之间建立界面。本方案证明，源自牛肠类器官的细胞能够形成结构完整的二维单层细胞层，跨上皮电阻（TEER）测量和细胞旁通透性检测结果为此提供了证据。此外，通过免疫荧光和电子显微镜观察，证实了类器官来源的二维单层细胞形成了具有刷状缘和紧密连接的细胞极性结构，反映了 体内 肠道上皮的特性
在本研究中，回肠代表小肠肠道，直肠代表大肠肠道。这些选择基于相关的肠道病原体，例如 沙门氏菌 spp.，可易位至回肠11，以及 E. coli O157:H7 被认为主要定植于直肠9 在牛中。选择这些特定的肠段突显了为实现研究精确性而针对不同肠道区域定制肠类器官培养方法的必要性。这些方法详细阐述了从这些肠段有效培养类器官来源的二维单层界面的操作流程，为研究牛肠道健康、病原体感染以及肠道微生物组与宿主之间的相互作用提供了可靠的模型。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;基础培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>n/a</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>1X</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;类器官培养基（基础培养基添加物）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788-5MG</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50X)</td><td>Gibco</td><td>17504-001</td><td>1X</td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.5MG</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Murine Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteine</td><td>MP Biomedicals</td><td>194603</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>N-2 MAX Media Supplement (100X)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AR009</td><td>1X</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin Conditioned Medium</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10 vol/vol %</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 vol/vol %</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;单层培养基（类器官培养基添加物）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046-5MG</td><td>2.5 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>20 vol/vol %</td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2851-5MG</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>StemCellTechnologies</td><td>72308</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>560061</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Cytiva</td><td>SH30574.02</td><td>2 w/vol %</td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>n/a</td></tr><tr><td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution (4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J19943K2</td><td>n/a</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>n/a</td></tr><tr><td>SNA, EBL, Fluorescein</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1301</td><td>1:100 稀释</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16046.AE</td><td>0.3 vol/vol %</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>VWR Life Science</td><td>K940-100ML</td><td>n/a</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;micro;m 细胞培养插件</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>48孔细胞培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 无菌细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5910Ri</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特-欧姆计</td><td>Millipore</td><td>Millicell ERS-2</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>倒置共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8-X</td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpecrtraMax i3x</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>iMed Scientific</td><td>-</td><td>#11 碳钢</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS X 成像软件</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS X 3.7.6.25997</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪软件</td><td>Molecular Devces</td><td>SoftMax Pro 7.1.2</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

Advancements in Bovine Organoid Technology Using Small and Large Intestinal Monolayer Interfaces

推进对胃肠道生理学及其疾病的认识，在很大程度上依赖于精确的、物种特异性的研究方法的发展 体外 能够真实模拟的模型 体内 肠道组织。这对于研究牛体内宿主与病原体的相互作用尤为重要，因为牛是多种对公共卫生构成严重威胁的病原体的重要储存宿主。传统的三维类器官模型对肠上皮顶面的可及性有限，而二维单层培养技术的出现克服了这一障碍。这种二维培养模型由类器官细胞衍生而来，其腔面暴露，便于开展更便捷的研究。本研究介绍了一种详细的实验方案，用于建立和维持源自牛小肠与大肠类器官细胞的二维单层培养体系。该方法包括通过跨上皮电阻和旁细胞通透性检测评估膜完整性的操作流程，以及免疫细胞化学染色技术。这些方案为建立和表征二维牛源单层培养系统奠定了基础，拓展了该方法在具有重要公共卫生意义的生物医学与转化研究中的应用边界。采用这一创新性方法，可构建出具有生理相关性的 体外 用于研究牛肠道生理的正常与疾病状态的模型。这些研究对生物医学和农业进步具有深远意义，有助于开发更有效的牛肠道疾病治疗方法，从而提升动物福利和食品安全水平。

本方案可从牛小肠和大肠组织可靠地生成稳定的肠道类器官来源的二维单层细胞，模拟肠道的复杂性 体内 肠上皮。该方法利用在优化条件下培养自健康牛肠道隐窝组织的成熟类器官。有趣的是，由类器官衍生的二维单层细胞的成功且可重复的培养条件，具有肠道节段特异性表1这进一步强调了为感兴趣的肠道区段建立优化培养技术的重要性。
在将解离的成熟类器官接种到细胞培养小室上1天后，可见形成2D单层细胞（图 2A）。然而，尽管外观如此，此阶段回肠和直肠单层细胞的TEER测量值仍然较低（图1C此外，细胞旁通透性检测结果显示，培养仅1天后，该单层细胞即允许4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂穿过细胞层图1C）。到第3rd 培养第1天，两类类器官来源的二维单层细胞均表现出显著的成熟特征，表现为跨上皮电阻（TEER）值升高以及对4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的通透性降低，这一趋势持续至培养第5天。
尤其值得注意的是物种间的变异性：在相似条件下，尽管牛源类器官衍生的二维单层培养物的跨上皮电阻（TEER）值低于人和犬的对应样本12,13,14,15，其膜完整性仍保持完好。这一结论基于单层细胞在通透性实验中表现出的适当反应，表明牛样本中较低的TEER值并不一定反映屏障功能的缺失。这种完整性对于功能性上皮屏障至关重要，并可通过结合TEER测量结果对通透性实验结果进行细致解读而有效证实。
通过扫描电子显微镜观察到二维单层细胞的顶面具有清晰的细胞边界和发育良好的微绒毛，显示出特化的微解剖结构，进一步证实了回肠和直肠类器官来源的二维单层细胞均实现了充分成熟（图2B）。此外，对二维单层细胞进行免疫荧光染色，证实了回肠（图3A）和直肠（图3B）类器官来源的二维单层细胞均存在顶面刷状缘、基底外侧黏附连接以及分泌黏液的杯状细胞。这些结果表明，所建立的二维单层细胞在组成和结构上具有复杂性，不仅表达了完整肠上皮的关键特征，而且由多谱系细胞群体构成。
成功的二维单层培养依赖于细胞对细胞外基质（ECM）的黏附以及生长至融合，从而形成完整的上皮层。值得注意的是，在细胞培养小室中孵育期间，若ECM分布不均或培养条件次优，可能导致细胞层部分脱落，尤其在边缘区域更为明显（图4Ai）。如果接种细胞密度过高，或接种细胞在培养表面分布不均，则该问题会进一步加剧；这种情况通常源于类器官未能完全解离为单细胞悬液。此类不均匀分布可导致单层中出现空隙和/或在细胞培养小室上发生三维形态发生（图4Aii）。相反，细胞接种密度过低也可能导致在预期培养周期内单层未能成功或延迟形成，从而间接影响后续利用二维单层系统开展研究的效率（图4Aiii）。此外，培养系统的污染也可能在单层中形成空隙，破坏原本已形成的融合单层，尤其是在培养后期（图4Aiv）。即使此前未出现上述潜在失败原因，剧烈的清洗或操作技术仍可能干扰细胞层，从而影响跨上皮电阻（TEER）的稳定值及细胞旁通透性反应（图4B）。因此，在类器官来源的二维单层培养过程中，谨慎操作细胞并仔细评估单层的形成情况或可能的破坏，对于有效实施故障排除策略、实现成功培养至关重要。
<img alt="回肠和直肠组织显微镜图像；按第1天和第3天（D1、D3）比较；光学与电子显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：牛回肠和直肠类器官来源的二维单层细胞的显微特征。 （A）在细胞培养小室中培养第1天和第3天（D1和D3）的二维单层细胞代表性相差显微图像。比例尺 = 100 µm。（B）二维单层细胞的代表性扫描电子显微图像，左图为低倍放大，右图为高倍放大。在回肠（上）和直肠（下）单层细胞中均可清晰观察到细胞表面精细结构，包括微绒毛。左侧比例尺 = 10 µm，右侧比例尺 = 2 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="共聚焦显微镜图像；F-actin、E-cadherin、SNA 标记分布；回肠与直肠组织比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：源自回肠和直肠类器官的二维单层细胞的免疫荧光表征。（A, B）图 A 显示回肠类器官，图 B 显示直肠类器官。左侧图像中，用鬼笔环肽（红色）标记 F-actin 纤维，显示细胞骨架结构及顶膜刷状缘的形成。中间图像显示黏附连接的基底外侧定位，由 E-cadherin（绿色）标记，提示细胞间黏附及单层结构的完整性。右侧图像中，SNA（绿色）标记黏液分泌性杯状细胞，z 轴层扫图像显示回肠单层细胞顶膜分泌黏液的情况。所有图像中的细胞核均用 DAPI 复染（蓝色）。此外，所有图像的 z 轴层扫结果进一步证实培养小室中形成了单层细胞结构。比例尺 = 25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养显微图像与TEER图；评估生长阶段及通透性变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：亚优条件下二维单层细胞形成的表征。（A）代表性相差显微图像显示：（i）单层细胞在细胞培养小室边缘部分脱落；（ii）出现三维样外向生长及单层内形成间隙；（iii）由于接种密度低于最佳水平，导致细胞贴壁不均，表现为单层形成不完全或延迟；（iv）在后期阶段，原本已形成的二维单层中出现间隙，可能由疑似污染引起。比例尺 = 100 µm。（B）第3天后经时下降的TEER值伴随通透性升高，表明未能建立稳定且具有功能的上皮屏障。结果来自一次实验（设两个技术重复），以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：基于细胞外基质的水凝胶中牛肠类器官培养物的密度变化。 在基于细胞外基质（ECM）的水凝胶中培养的牛肠类器官；（A）高密度和（B）低密度。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/R1.Suppl%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：组织供体基本信息汇总。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/R1.Dykstra.JoVE.SupplTable1_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本研究介绍了一种从类器官生成牛肠道二维单层细胞的实验方案，为研究宿主与病原体相互作用提供了更便捷的途径。方案包括评估膜完整性和功能性的方法，推动了 体外 模拟牛胃肠道生理的模型。该方法有望带来重要的生物医学和农业效益，包括改进治疗策略。

推进对胃肠道生理及其疾病的认识，在很大程度上依赖于精确的物种特异性体外模型的开发……

我们的研究目标是建立可靠的技术，以生成源自成年牛小肠和大肠类器官的稳定肠道单层界面。我们采用多模式分析方法，验证了所建立的单层结构中功能性上皮屏障的形成。与三维模型不同，二维单层结构提供了一个暴露且易于接触的管腔表面，这对于研究宿主与病原体之间的相互作用至关重要。这些包含多种细胞谱系、模拟体内肠道环境的单层细胞现在为研究特定肠道区域（如小肠和大肠微环境）中的病原体提供了定制化的实验方案。我们的研究确定了优化的培养条件，可从小牛小肠和大肠类器官细胞中建立并维持二维单层细胞。我们通过跨上皮电阻测量、细胞旁路通透性检测以及免疫细胞化学染色技术，证实了这些单层细胞能够形成具有功能的上皮屏障。本方案针对研究空白，聚焦于缺乏源自牛肠道类器官的单层细胞模型这一问题。尽管此类模型在小鼠和人类中已有深入研究，但牛作为具有重大公共卫生意义的肠道病原体的重要储存宿主，其相关模型却尚未得到充分探索。本研究建立并表征了一种牛源二维单层细胞培养系统。这一创新工具可用于研究牛肠道生理的正常与疾病状态，其潜在应用可延伸至具有重要公共卫生意义的生物医学和转化研究。首先，对用于类器官来源的二维单层培养的细胞培养小室中的细胞外基质进行包被。向每个准备好的细胞培养小室的顶端腔室中加入 100 µL 细胞外基质包被液，并盖上盖子。然后将细胞培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育1小时。对于直肠类器官细胞，孵育后用直肠单层培养基替换细胞外基质包被，并过夜孵育。在类器官经酶消化并过滤为单细胞后，将细胞悬液在4摄氏度下以200 ×g离心5分钟，然后弃去上清液。接下来，每孔细胞培养插件中加入200微升单层培养基中的细胞悬液。取出含有包被了细胞外基质的细胞培养插件的24孔细胞培养板。使用真空抽吸，小心吸去每个细胞培养插件的顶室液体，避免破坏基质包被。将200微升单细胞悬液小心地加入每个细胞培养小室的顶端室中。向每孔的基底外侧室加入500微升适当添加补充物的单层培养基。随后将培养板置于湿润的培养箱中孵育，以促进细胞黏附和生长，在细胞培养小室上形成融合的二维单层细胞层。从细胞接种后48小时开始，每隔一天更换一次顶腔和基底外侧腔中的培养基。对于类器官来源的二维单层细胞的免疫荧光染色，用手术刀片小心切下细胞培养插件的膜，并将该膜置于载玻片上。在盖玻片上加入封片剂，然后将其放置在载玻片上，再进行细胞观察。将解离后的成熟类器官接种到细胞培养小室上一天后，可见形成了一层二维单层细胞。接种五天后，扫描电子显微镜显示，二维单层细胞的顶面具有发育良好的微绒毛和清晰的细胞边界。免疫荧光染色证实，在回肠和直肠类器官来源的二维单层细胞中均存在顶面刷状缘、基底外侧黏附连接以及产黏液的杯状细胞。首先，从培养箱中取出含有类器官来源的二维单层细胞的细胞培养小室板。移除待检测细胞培养小室的顶腔和底腔中的单层细胞培养基。用预热的 PBS 分别轻轻洗涤顶腔和底腔各两次，每次分别加入 200 和 500 微升。从顶端室中移除洗涤液，并向细胞培养插件的顶端室加入200微升含0.5毫克/毫升、4 kDa FITC-葡聚糖示踪剂的PBS溶液。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育20分钟。随后，从孵育后的24孔板的基底侧室中取50微升样品，转移至适用于酶标仪的96孔板中。在取样孔的基底侧室中加入 50 微升新鲜 PBS。使用预先校准的微孔板读数仪，立即在激发波长 495 纳米和发射波长 535 纳米的条件下测定荧光强度。

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科研

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医学

使用小肠和大肠单层界面的牛类器官技术的进步

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。...

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

本文介绍了一种利用冷冻保存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案。同时，我们还描述了一种由三维类器官衍生建立细胞单层的方法，可实现对上皮细胞顶膜侧的接触与研究。...

从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型

将犬类肠道类器官与“肠芯片”微流控系统相结合，为人类肠道疾病提供了具有相关性的转化研究模型。所介绍的方案支持三维形态发生和动态培养 体外 肠道建模，助力犬类和人类肠道疾病的治疗开发，推动同一健康（One...

利用炎症性肠病患者来源的肠道类器官在犬类肠芯片中实现三维形态发生

类肠体作为一种新型模型，正在被用于研究组织生理学与病理生理学、药物开发以及再生医学。本文中，我们描述了一种牛源原代细胞二维类肠体衍生培养系统，该系统允许与相关组织细胞类型进行共培养。该模型为胃肠道研究的建模提供了转化应用优势。...

用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

通过微计算机断层扫描进行小动物血管的对比增强成像是一种快速、经济高效且高通量的技术，适用于系列研究 原位...

使用MicroCT进行对比增强血管成像

本文描述了一种在小鼠中诱导全身性热疗的方案，可模拟发热状态，持续时间可达12-24小时。...

小鼠长时间全身热疗实验方案

肺康复在呼吸系统疾病的管理中被广泛认可。成功实施肺康复的关键要素之一是坚持推荐的运动训练。本方案的目的是描述如何利用连续数据追踪技术精确测量患者对规定有氧训练强度的依从性。...

利用连续数据追踪技术研究肺康复中的运动依从性

了解牛小肠和大肠类器官来源的二维单层培养技术，用于研究宿主与病原体相互作用。该方法通过跨上皮电阻和渗透性检测评估屏障功能，为牛肠道生理学和疾病研究提供创新模型。

利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

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