用小胶质细胞组装视网膜类器官
2024年7月26日
小胶质细胞是视网膜中独特的常驻免疫细胞，在各种视网膜退行性疾病中起着至关重要的作用。生成视网膜类器官与小胶质细胞的共培养模型有助于更好地了解视网膜疾病的发病机制和发展进展。
首先，在细胞密度为 80% 至 90% 的干细胞培养基中获得人胚胎干细胞去除用过的培养基后，用 1 毫升 1X DPBS 冲洗每个孔中的细胞。将每个孔中的干细胞集落与 1 毫升 0.5 毫摩尔 EDTA 在 37 摄氏度下孵育约 5 分钟。检查菌落形态，确认边缘略微卷曲，有松散的间隙。
吸出 EDTA，如有必要，将细胞在 37 摄氏度下再孵育 1 到 2 分钟，但不要超过 8 分钟。用 6 毫升含有 6 微升 10 毫摩尔 ROCK 抑制剂 Y-27632 溶液的培养基 A 轻轻冲洗每个孔中的细胞。轻轻敲击培养皿底部以帮助冲洗细胞。
24 小时后，在显微镜下观察细胞以确认胚胎体的形成。使用 10 毫升移液器，将胚胎体收集到 15 毫升离心管中，等待胚胎体沉降到底部 5 分钟。然后小心吸出上清液，将胚胎体重悬于 6 毫升新鲜培养基中 A.将它们转移到六孔板的新低粘附孔中，并在 37 摄氏度的培养箱中培养。
第 4 天，在 10 厘米的培养皿中涂上 3 毫升 0.1% 鱼明胶溶液，并在 5% 二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中孵育至少 1 小时。然后去除明胶溶液，用 5 到 6 毫升 1X DPBS 冲洗培养皿一次。小心地将胚胎体收集到 15 毫升离心管中，等待胚胎体在 5 分钟内沉降到底部。
用 15 毫升培养基 B 轻轻重悬胚胎体，并将它们转移到涂层的 10 厘米培养皿中。49 天后在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中培养一周。在室温下以 200 x g 离心细胞 5 分钟。
小心吸出上清液，并用 2 毫升新鲜培养基 C.Transfer 将细胞重悬于 6 孔板的新的低粘附孔中。将板在 5% 二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中孵育。在第 56 天，用每孔 2 毫升培养基 C 替换用过的培养基。
在显微镜下检查板，以确定分枝的小胶质细胞粘附在低粘附力的底部。要收获用于共培养的小胶质细胞，请用 1 毫升 Accutase 轻轻替换每个孔中的培养基 C，并在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。使用 5 mL 移液器，将小胶质细胞收集到 15 mL 试管中，并在室温下以 200 x g 的离心力离心细胞 5 分钟。
弃去上清液后，用 1 毫升培养基 E 悬浮小胶质细胞。
概述
本研究通过生成视网膜类器官和小胶质细胞的共培养模型，探讨小胶质细胞在视网膜退行性疾病中的作用。该模型旨在增强对视网膜疾病发病机制和发展的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 视网膜生物学
- 免疫学
背景
- 小胶质细胞是视网膜中的驻留免疫细胞。
- 它们在视网膜退行性疾病的病理过程中扮演着关键角色。
- 了解小胶质细胞的功能可以帮助开发治疗方法。
- 共培养模型允许对细胞相互作用进行更全面的分析。
研究目的
- 开发一个可靠的视网膜类器官和小胶质细胞共培养模型。
- 研究视网膜疾病的潜在病理机制。
- 增强对小胶质细胞在视网膜环境中行为的理解。
使用的方法
- 该研究利用了一个包含由胚胎干细胞衍生的视网膜类器官和人类小胶质细胞的共培养模型。
- 人类胚胎干细胞被培养到达特定密度后进行小胶质细胞分离。
- 该模型观察了为期30天的发育阶段。
- 培养条件包括在37摄氏度下进行控制气体的孵育。
- 使用免疫荧光技术来确认小胶质细胞和视网膜标记物的存在。
主要结果
- 共培养的视网膜类器官显示出显著的GFP自身荧光，表明活跃的小胶质细胞。
- 免疫荧光确认了视网膜光感受器标记物（CRX）和小胶质细胞标记物（IBA1）的表达。
- 该研究突出了疾病模型化过程中小胶质细胞和视网膜细胞之间的相互作用。
结论
- 本研究展示了一个反映视网膜疾病复杂性的功能性共培养模型。
- 它允许对小胶质细胞在视网膜病理中的角色进行洞察，可能指导治疗策略。
- 该模型的应用还可以延伸到更好地理解神经免疫相互作用在眼部疾病中的机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Integrating microglia into human retinal organoids addresses a critical gap in disease-relevant modeling for retinal and CNS drug discovery. This co-culture system enhances predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for neuroimmune interactions. The platform supports translational continuity from discovery through preclinical research, enabling more informed portfolio decisions in ophthalmic and neurodegenerative pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglia-mediated mechanisms in retinal disease models.
- Supports functional target validation by recapitulating immune cell interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroimmune targets in ophthalmology.
- Improves predictive confidence for early-stage asset triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated co-culture system for compound screening in a human-relevant context.
- Enables quantitative assessment of microglial and photoreceptor marker expression.
- Supports reproducible assay development for immune-modulating therapeutics.
- Prepares a scalable platform for screening neuroinflammatory modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for translational biomarker exploration.
- Bridges discovery and preclinical validation for retinal and CNS indications.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on human cell-derived data.
- Supports mechanistic studies of neuroimmune interactions in disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture model fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational research for retinal and CNS drug programs.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of microglia-retina interactions and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible organoid systems with quantifiable immune and neuronal markers.
- Analytics: Provides immunofluorescence and autofluorescence readouts for comparative analysis of disease and intervention effects.
- Translational Research: Supports alignment with human disease mechanisms and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neuroimmune and ophthalmic research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes co-culture protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by modeling human disease complexity early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets targeting retinal and CNS diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation and co-culture techniques.
- Needs access to advanced imaging and immunofluorescence analytics.
- Demands cross-team standardization for reproducible outputs.
- May require adaptation for different disease models or cell sources.
- Potential variability in cellular responses should be considered in experimental design.
