Name: 用小胶质细胞组装视网膜类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 了解小胶质细胞与视网膜类器官共培养模型的构建方法。该模型利用人胚胎干细胞分化的小胶质细胞，研究视网膜退行性疾病中神经免疫相互作用的病理机制，为开发新疗法提供重要研究平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由国家自然科学基金（82101145）和北京市自然科学基金（Z200014）资助。

本研究经首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。HESC 细胞系 H9 来源于 WiCell 研究所。实验前将细胞培养基在室温（RT）预温 30 分钟。
1. 人小胶质细胞的制备
<ol>
	<li>将hESCs在干细胞培养基中培养至细胞密度达到80%-90%。每孔接种至少1 × 106个细胞。</li>
	<li>吸除干细胞培养基，并用1× DPBS（每孔1 mL，6孔板）清洗细胞。下一步需要2 × 107–1 × 108个细胞。若数量不足，可合并2–5孔的细胞进行后续操作。</li>
	<li>使用0.5 mM EDTA溶液在37 °C培养箱中孵育约5分钟以解离干细胞集落（每孔1 mL，6孔板）。</li>
	<li>5分钟后观察集落形态。当集落边缘略微卷起并出现松散间隙时，细胞已准备好进行分化，此时吸除EDTA溶液。若未达到该状态，继续在37 °C孵育1–2分钟。总孵育时间不得超过8分钟。</li>
	<li>用6 mL含6 µL 10 mM ROCK抑制剂Y-27632溶液的Medium A（表1）轻柔冲洗每孔细胞。轻敲培养皿底部以帮助细胞脱落。将此日记为第0天。 
	注意：不要使用移液器吹打细胞。次日细胞将形成拟胚体（EBs）。</li>
	<li>24小时后，在显微镜下观察细胞，确认拟胚体形成。用10 mL移液器将EBs收集至15 mL离心管中，静置5分钟使EBs沉降至管底。</li>
	<li>小心吸除上清液，用6 mL新鲜Medium A重悬EBs，转移至新的低黏附6孔板孔中。置于37 °C培养箱中继续培养。 
	注意：第1天更换培养孔的目的是减少EB形成过程中大量死亡细胞对细胞生长状态的不利影响。</li>
	<li>每天更换新鲜Medium A，直至第4天（每孔6 mL，6孔板）。</li>
	<li>第4天，在10 cm培养皿中加入3 mL 0.1%鱼胶原溶液，于5% CO2、37 °C培养箱中包被至少1小时。 
	注意：若包被时间少于1小时，后续操作将难以进行。</li>
	<li>用10 mL移液器小心收集EBs至15 mL离心管中，静置5分钟使EBs沉降至管底。</li>
	<li>吸除0.1%胶原溶液，并用5–6 mL 1× DPBS清洗10 cm培养皿一次。吸除DPBS。</li>
	<li>在15 mL离心管中用15 mL Medium B（表1）轻柔重悬EBs，转移至已包被的10 cm培养皿中。置于37 °C、5% CO2培养箱中培养1周。 
	注意：前7天内请勿移动培养皿。</li>
	<li>每周更换一次新鲜Medium B，直至第49天（每10 cm培养皿15 mL），并每周在显微镜下观察细胞状态。 
	注意：第49天后，可在培养皿上清液中观察到若干分泌细胞。</li>
	<li>在室温下以200 ×g离心上清液中的细胞5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，用2 mL新鲜Medium B重悬细胞，转移至新的低黏附6孔板孔中。置于5% CO2、37 °C培养箱中培养。 
	注意：接下来的7天内请勿移动培养板。小胶质细胞可能黏附于低黏附孔底部。</li>
	<li>第56天，更换为Medium C（表1）（每孔2 mL，6孔板）。小胶质细胞将黏附于低黏附孔底部，并在显微镜下呈现分支状形态。 
	注意：每3天更换一次Medium C（每孔2 mL，6孔板），小胶质细胞可在Medium C中持续培养约15天。</li>
</ol>
2. 人类视网膜类器官的生成及与小胶质细胞的共培养
<ol>
	<li>将hESCs在干细胞培养基中培养至细胞密度达到80%-90%，每孔接种至少1 x 106个细胞。</li>
	<li>向培养孔中加入Dispase（6孔板每孔1 mL），37 °C孵育5分钟，随后吸除Dispase溶液。</li>
	<li>向孔中加入Medium D（表1）（6孔板每孔1 mL），用10 µL移液器将细胞切割成小块。</li>
	<li>轻柔收集所有细胞碎片及培养基至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>以200 x g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞轻柔重悬于200 µL冷基质中，将1.5 mL微量离心管放入培养箱孵育20分钟。操作需迅速，因基质在室温（RT）下会凝固。20分钟后，基质将在培养箱中完全凝固。</li>
	<li>准备一个10 cm培养皿，加入15 mL Medium D。用Medium D重悬基质，并轻轻摇动培养皿。</li>
	<li>随后将培养皿放入培养箱培养5天，期间勿移动培养皿。将该日设定为第0天（ROs）。细胞将在3天内贴壁。</li>
	<li>在第5天（ROs）和第10天（ROs），更换Medium D培养基。</li>
	<li>在第12天（ROs），移除培养基，每皿加入3 mL Dispase，作用5分钟。</li>
	<li>吸除Dispase，每皿加入15 mL Medium E（表1）。</li>
	<li>收集小胶质细胞：在第56天（MGs），轻柔吸除Medium C，每6孔板孔加入Accutase（1 mL/孔），37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>用5 mL移液器将小胶质细胞收集至15 mL离心管中，于室温下以200 x g离心5分钟。</li>
	<li>轻柔吸除上清液，将小胶质细胞重悬于1 mL Medium E中，并加入第12天消化后的ROs中。 
	注：第12天（ROs）时细胞处于贴壁状态；第13天（ROs）时细胞开始悬浮于Medium E中。若从第12天（ROs）至第19天（ROs）期间培养基变黄，需用Medium E更换培养基。</li>
	<li>在第19天（ROs），通过轻柔旋转培养皿使类器官聚集至皿中央，轻柔吸除Medium E，并更换为Medium F。</li>
	<li>将含Medium F的类器官转移至新的悬浮培养皿中。</li>
	<li>每周更换一次培养基，并挑选类器官用于实验。</li>
</ol>

Microglia-Integrated Retinal Organoids: A Model for Studying Retinal Diseases

<ol><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+induction+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (170), e62298(2021).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+pu.1-+and+irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>O'koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+function+is+distinct+in+different+anatomical+locations+during+retinal+homeostasis+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration.</a> Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).</li>
<li>Margeta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+impairs+the+response+of+neurodegenerative+retinal+microglia+and+prevents+neuronal+loss+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma.</a> Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+innate+responses+in+microglia+derived+from+retinoblastoma+patient-specific+IPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs.</a> Glia. 72 (5), 872-884 (2024).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+microglia+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+empower+retinal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ.</a> Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct+human+retinoblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstruct human retinoblastoma in vitro.</a> J Vis Exp. (188), e62629(2022).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li>
<li>Usui-Ouchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+human+ipsc-derived+macrophage+progenitors+into+retinal+organoids+to+generate+a+mature+retinal+microglial+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche.</a> Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+microglia-like+cells+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).</li>
</ol>

作者们未意识到存在任何可能影响本研究客观性的附属关系、会员资格、资助或财务持有情况。

由于人视网膜来源受限，目前对视网膜炎症反应的理解几乎都来自动物模型。为克服这一局限，研究人员分化获得了视网膜类器官。视网膜类器官模型的开发一直是研究热点，旨在模拟人视网膜的复杂性，用于疾病建模和治疗策略开发。已有多个研究成功报道了从人多能干细胞生成视网膜类器官1,2,12,13。然而，这些模型大多缺乏小胶质细胞，而小胶质细胞在视网膜发育和疾病发病机制中具有关键作用。近期研究尝试将小胶质细胞整合到视网膜类器官或脑类器官模型中16,17,18，但具体方法尚不明确。本文提供了一种详细的分步操作方案，用于在早期阶段将来源于同一条hESC系的小胶质细胞与视网膜类器官进行共培养。尽管已有研究利用动物模型或细胞培养系统探讨了小胶质细胞在视网膜疾病中的作用7,8,9，但本文所呈现的共培养模型为研究小胶质细胞-视网膜相互作用及其在疾病发病机制中的意义，提供了一个更具生理相关性的基于人源的系统。
关键步骤在于人干细胞的状态以及小胶质细胞和视网膜类器官的分化。小胶质细胞和视网膜类器官（ROs）应逐步分化，并在不同阶段使用正确的试剂和培养皿（经组织培养处理的培养皿或悬浮培养皿）。该模型有助于我们理解小胶质细胞如何参与视网膜疾病发生的过程，在未来的药物筛选和疾病机制研究中具有重要意义。然而，我们目前发表的方法仍存在一些局限性。由于小胶质细胞的分化周期较长，且缺乏合适的冷冻保存方法，因此在进行共培养时，需合理规划小胶质细胞和视网膜类器官的分化时间。
除了视网膜类器官外，我们认为将免疫细胞整合到其他类器官模型中也有助于促进类器官的发育。因此，测试其他类器官系统至关重要。将多种细胞类型与类器官整合以形成完整器官，代表了未来极具前景的研究模型。

由于人视网膜来源有限，将人类干细胞分化为三维（3D）视网膜类器官成为模拟视网膜结构与功能的一种颇具前景的体外模型1。该模型包含视网膜中的多种细胞类型，如光感受器细胞、视网膜神经节细胞、双极细胞、Müller细胞、水平细胞和星形胶质细胞2。这一模型使得研究人员能够模拟并研究视网膜发育机制以及视网膜疾病的发病过程。然而，由于目前采用的定向分化方法使视网膜类器官主要来源于神经外胚层3，因而缺少来自其他胚层的多种细胞类型，例如源自卵黄囊的小胶质细胞以及源自中胚层的血管周细胞4,5,6。
目前，许多视网膜疾病，如视网膜色素变性7、青光眼8和视网膜母细胞瘤9，已被证实与视网膜内的小胶质细胞密切相关。然而，由于缺乏合适的研究模型，小胶质细胞与这些疾病之间关系的具体机制仍不明确。尽管小鼠已被广泛用作研究视网膜疾病的理想模型，但近期研究指出，小鼠与人类的小胶质细胞在寿命、增殖速率以及人类同源基因的缺失等方面存在显著差异10,11。这些发现表明，从小鼠模型中得出的结论可能并不完全可靠，因此构建包含小胶质细胞的人类视网膜类器官显得尤为重要。
在过去的几十年中，已开发出多种用于视网膜类器官三维分化的技术12,13。为了促进小胶质细胞在视网膜类器官中的共培养操作，我们选择了一种从贴壁培养过渡到悬浮培养的分化方法。该方法成功实现了将小胶质细胞整合入视网膜类器官，并至少维持其存活60天14。

<table><tbody><tr><td>Acctuase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CRX(M02)</td><td>abnova</td><td>H00001406-M02</td><td>抗体；稀释比例按照制造商说明书进行</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Abcam</td><td>ab5076</td><td>抗体；稀释比例按照制造商说明书进行</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (1U/mL)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 基础培养基</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industry</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G7041-100G</td><td>固体</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>H9 细胞系</td><td>WiCell Research Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>RD Systems&amp;nbsp;</td><td>203-IL-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech</td><td>200-34-50UG</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>基质胶（Matrix）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>RD Systems&amp;nbsp;</td><td>216-MC-500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>干细胞培养基&amp;nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5990</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>X-ViVO</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小胶质细胞构建视网膜类器官

Assembling Retinal Organoids with Microglia

由于人类视网膜的可及性有限，视网膜类器官（ROs）是研究人类视网膜疾病的最佳模型，有助于揭示视网膜发育机制及视网膜疾病的发生过程。小胶质细胞（MG）是视网膜和中枢神经系统（CNS）中独特的常驻巨噬细胞，具有重要的免疫功能。然而，由于视网膜类器官的分化来源为卵黄囊，其本身缺乏小胶质细胞。小胶质细胞在这些视网膜疾病中的特异性致病机制仍不明确，因此，建立包含小胶质细胞的视网膜类器官模型显得尤为必要。本文中，我们成功构建了由人源干细胞分化而来的小胶质细胞与视网膜类器官共培养的模型。在该研究中，我们将小胶质细胞进行分化后，在早期阶段与视网膜类器官进行共培养。由于引入了免疫细胞，该模型为视网膜疾病建模和药物筛选提供了优化平台，有助于深入研究视网膜及中枢神经系统相关疾病的发病机制与治疗策略。

视网膜类器官的生成步骤已在我们之前的研究中描述15。本文展示了小胶质细胞以及小胶质细胞与视网膜类器官共培养的代表性结果。
此处展示了小胶质细胞分化的各个阶段（图1A）。第0天代表干细胞培养阶段。随后，将干细胞消化并进行悬浮培养以形成拟胚体（EB）。在该过程的最初4天内，细胞将形成拟胚体（图1B）。接着，我们将悬浮的拟胚体转移至贴壁培养的10 cm培养皿中。大约7天后，细胞形态接近图1C所示状态。随着培养的进行，贴壁细胞会向培养上清液中分泌造血祖细胞（图1D）。此过程大约需要45天。此时，可从上清液中收集细胞并转移至6孔板中。在接下来的7天内，小胶质细胞将逐渐成熟（图1E），并可用于后续实验。
在视网膜类器官分化的第12天，将贴壁细胞消化并转为悬浮培养，并向视网膜类器官中加入含有小胶质细胞的E培养基。小胶质细胞将迁移进入视网膜类器官内部。为了清晰观察小胶质细胞的形态，我们在人胚胎干细胞（hESCs）中加入了EGFP慢病毒转染，使分化后的小胶质细胞表达GFP并具有自发荧光（绿色）（图2A-C）。我们还通过免疫荧光染色检测了与小胶质细胞共培养50天后的视网膜类器官的组织结构，使用了光感受器细胞标志物CRX和小胶质细胞标志物IBA1进行分析（图2D）。
<img alt="干细胞分化过程示意图；hESC 经培养基变化在 63 天内分化为小胶质细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：由人胚胎干细胞（hESC）分化获得小胶质细胞的示意图与时间线。（A）该方案从在6孔板中解冻并传代hESC开始。（B）在含培养基A的条件下形成均一的拟胚体（EB）。（C）将拟胚体转移至包被培养皿中，在第4–56天形成造血祖细胞。（D、E）在第56天收集含有细胞的上清液（D），并将其转移至低黏附性6孔板中，于第63天形成小胶质细胞（E）。比例尺：500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分化实验；EGFP荧光显微镜；类器官分析，结果比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：小胶质细胞与视网膜类器官共培养过程中的代表性时间点图像。（A）来源于EGFP-hESC的小胶质细胞的代表性图像。（B）EGFP+小胶质细胞与视网膜类器官共培养，分化18天后的图像。（C）EGFP+小胶质细胞与视网膜类器官共培养，分化30天后的图像。比例尺：300 µm。（D）使用CRX（光感受器细胞标志物；红色）和IBA1（小胶质细胞标志物；绿色）检测与小胶质细胞共培养50天后视网膜类器官的组织结构。DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：30 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：本研究中所用培养基的组成。 表中列出了配制每种培养基500 mL所需的成分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/Table%201-67016R1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

小胶质细胞是视网膜中独特的常驻免疫细胞，在多种视网膜变性疾病中发挥关键作用。建立视网膜类器官与小胶质细胞的共培养模型，有助于更深入理解视网膜疾病的发病机制及发展过程。

由于人类视网膜获取受限，视网膜类器官（retinal organoids, ROs）是研究人类视网膜疾病的最佳模型，可揭示……

首先，获取处于干细胞培养基中、细胞密度为80%至90%的人胚胎干细胞。移除用过的培养基后，用1毫升1×DPBS冲洗每个孔中的细胞。在37摄氏度条件下，将每个孔中的干细胞集落与1毫升0.5毫摩尔EDTA共同孵育约5分钟。观察集落形态，确认边缘略微卷起并出现松散间隙。吸除EDTA，如有必要，将细胞在37摄氏度孵育额外1至2分钟，但总时间不得超过8分钟。用6毫升含6微升10毫摩尔岩藻激酶抑制剂Y27632溶液的培养基A，轻柔冲洗每个孔中的细胞。轻敲培养皿底部，以助冲洗细胞。24 小时后，在显微镜下观察细胞，以确认拟胚体的形成。使用 10 毫升移液管将拟胚体收集至 15 毫升离心管中，静置 5 分钟，使拟胚体沉降至管底。随后小心吸除上清液，并将拟胚体重悬于 6 毫升新鲜培养基 A 中。将其转移至新的六孔板低黏附孔中，并在 37 °C 培养箱中进行培养。第4天，用3毫升0.1%的鱼明胶溶液包被一个10厘米的培养皿，在5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中孵育至少1小时。随后吸除明胶溶液，并用5至6毫升1×DPBS冲洗培养皿一次。小心地将胚体收集至15毫升离心管中，静置5分钟，待胚体沉降至管底。用15毫升培养基B轻轻重悬胚状体，并将其转移至包被的10厘米培养皿中。在37°C、5% CO₂培养箱中培养一周。培养49天后，在室温下以200 × g离心5分钟。小心吸除上清液，并用 2 毫升新鲜的 C 培养基重悬细胞，转移至六孔板中的一个新的低吸附孔中。将培养板置于含 5% 二氧化碳、37 °C 的培养箱中孵育。在第 56 天，每孔更换为 2 毫升 C 培养基。在显微镜下观察培养板，识别分支状的小胶质细胞并确认其贴附于低黏附培养孔底部。为收获用于共培养的小胶质细胞，轻轻将每孔中的C型培养基替换为1毫升Accutase，并在37°C下孵育3分钟。使用5毫升移液管将小胶质细胞收集至15毫升离心管中，在室温下以200×g离心5分钟。弃去上清液后，用一毫升培养基 E 重悬小胶质细胞。首先，从人胚胎干细胞获取人小胶质细胞，并在第 56 天收获。对于视网膜类器官的衍生，将人胚胎干细胞在干细胞培养基中培养，直至细胞密度达到 80% 至 90%。每孔加入一毫升显示液（displays）处理培养细胞，并在 37°C 下孵育五分钟。去除显示液后，向每孔加入一毫升培养基 D。用10微升移液器将细胞切成小块。轻柔地将所有细胞碎片和培养基收集到1.5毫升微量离心管中。在200×g下离心5分钟。去除上清液后，将细胞在200微升冷基质中轻轻重悬。将1.5毫升微量离心管放入培养箱中孵育20分钟。在培养箱中孵育20分钟后，基质将凝固。用15毫升D培养基准备一个10厘米的培养皿。用D培养基重悬基质，并轻轻摇动培养皿。将培养皿放入培养箱中培养五天。在第12天，更换为3毫升疾病培养基。5分钟后，吸除Dispase，并加入15毫升培养基E。在第12天将收获的小胶质细胞加入已消化的视网膜类器官中。第19天时，轻轻摇晃培养板，使类器官聚集至培养皿中央，然后将培养基E更换为培养基F。最后，将含有培养基F的类器官转移至新的悬浮培养皿中。到第30天，与小胶质细胞共培养的视网膜类器官显示出明显的GFP自发荧光，表明小胶质细胞的存在。共培养的视网膜类器官显示出光感受器标志物CRX和小胶质细胞标志物IBA1的清晰免疫荧光信号。

assembling-retinal-organoids-with-microglia

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用小胶质细胞组装视网膜类器官

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。...

由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

本文介绍了一种优化的视网膜类器官诱导系统，该系统适用于多种人类多能干细胞系，可高效且高重复性地生成视网膜组织。...

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

本方案为视网膜类器官样本的透射电子显微镜制备提供了优化且详细的实验流程，适用于对成熟视网膜类器官中突触结构进行分析的相关研究。...

为透射电子显微镜制备视网膜类器官样本

我们提出了一种通过将诱导性多能干细胞（iPSC）来源的造血祖细胞（HPCs）整合到类器官发育过程中，以生成含常驻小胶质细胞的人脑类器官的实验方案。...

衍生含小胶质细胞发育的人脑类器官

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

此处，我们提供了一种详细的从小鼠眼球中分离视网膜的方法，适用于后续的长期研究 离体 实验。本方案旨在使这一技术要求较高的方法更易于研究人员掌握，以便利用在维持视网膜胶质细胞活性条件下所提供的研究路径 原位...

一个 离体 研究小鼠视网膜胶质细胞相互作用的外植体模型

本文介绍了如何对小鼠离体视网膜进行解剖和记录。具体而言，我们描述了如何记录荧光标记的视网膜神经节细胞群体对光刺激的反应，并进一步识别和分析其形态学特征。...

一种用于记录遗传标记视网膜神经节细胞光反应的离体视网膜制备方法

本视频展示了三种视网膜形态计量学分析方法，包括测量内核层厚度、定量视网膜神经节细胞（RGCs）数量以及测量RGCs的大小。该技术可为形态计量学分析提供一种简单而科学的平台。...

视网膜切片的形态计量分析

本视频文章展示了全装片小鼠视网膜神经节细胞的膜片钳记录技术的实验装置、细胞体膜片钳操作步骤以及动态钳记录的实施方法。该技术可用于研究兴奋性和抑制性突触输入对神经元放电的精确贡献，及其相对强度和时间关系。...

在小鼠视网膜神经节细胞中实现包含突触和人工电导的动态钳制技术

了解小胶质细胞与视网膜类器官共培养模型的构建方法。该模型利用人胚胎干细胞分化的小胶质细胞，研究视网膜退行性疾病中神经免疫相互作用的病理机制，为开发新疗法提供重要研究平台。

利用小胶质细胞构建视网膜类器官

探索更多视频