Name: 双色光电联相显微镜用于观察线粒体和溶酶体之间的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学习双色光电联相显微镜技术，用于高分辨率观察HeLa细胞中线粒体与溶酶体的相互作用。该方法结合荧光与电镜优势，揭示细胞器在不同应激条件下的动态关系，为神经退行性疾病研究提供新思路。

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本研究由韩国科学技术信息通信部资助的韩国脑科学研究所（KBRI）基础研究计划（24-BR-01-03）支持。TMEM192-V5-APEX2 质粒由首尔国立大学的 Hyun-Woo Rhee 惠赠。透射电子显微镜（TEM）数据在 KBRI 脑科学研究核心设施获取。

样品制备的逐步操作流程如图1所示。
1. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>将HeLa细胞以每35 mm玻璃网格底培养皿1 × 105个细胞的密度接种于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基中，在37 °C条件下培养。</li>
	<li>接种细胞后的第二天，当细胞融合度达到30%–40%时，使用转染试剂按照生产商说明书共同转染TMEM192-V5-APEX2和Mito-mEosEM质粒（每种质粒DNA各1 µg，加入3 µL转染试剂）。转染后，用DMSO或U18666A（2 µg/mL）以及Bafilomycin A1（100 nM）处理细胞，持续18小时。</li>
</ol>
2. 共聚焦显微成像
<ol>
	<li>用巴佛洛霉素和U18666A处理细胞18小时后，移除培养基，立即通过轻柔吹打加入250 µL预热（30 °C–37 °C）的固定液（含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1 M二甲胂酸钠溶液，pH 7.0）。立即吸除固定液，更换为1.5 mL新鲜固定液，冰上孵育30分钟。随后用1 mL冰浴的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞，每次10分钟，共洗涤3次。 
	注意：醛类蒸气有毒，所有操作均应在通风良好的通风橱中进行。</li>
	<li>加入1 mL冰冷的20 mM甘氨酸溶液以淬灭醛基，冰上孵育10分钟。再用冰冷的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>将10 mM H2O2加入0.1 M二甲胂酸盐溶液中，新鲜配制含300 µM Amplex-Red的溶液。向样品皿中加入500 µL Amplex-Red溶液，冰上孵育5分钟。</li>
	<li>移除Amplex-Red溶液，并用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液冲洗3次，每次10分钟。</li>
	<li>完成Amplex-Red染色后，使用共聚焦显微镜以3 × 3拼图扫描模式对目标细胞周围区域进行成像。使用40倍（或60倍）物镜同时采集微分干涉差（DIC）图像和荧光信号，以识别并记录网格皿上的网格线及字母标记。 
	注意：这些全景图像将作为在塑料包埋样品中定位特定目标细胞的参考图谱。</li>
	<li>使用40倍（或60倍）物镜对目标细胞进行高倍成像，并采集Z轴层扫图像。 
	注意：该高倍图像将与电子显微镜图像叠加，用于生成关联成像结果。</li>
</ol>
3. 电镜包埋样品的制备
<ol>
	<li>LM 成像后，在 4 °C 条件下加入 1 mL 1% 还原四氧化锇（由含 3% 亚铁氰化钾的 0.3 M 卡可基酸盐缓冲液与等体积 2% 水溶液四氧化锇配制而成）进行后固定 1 小时，随后在 4 °C 条件下用蒸馏水冲洗 3 次，每次 10 分钟。 
	注意：四氧化锇蒸气有毒，所有操作均应在通风良好的通风橱中进行。</li>
	<li>在室温下用蒸馏水冲洗 3 次，每次 10 分钟，然后在梯度乙醇系列中依次脱水，每次 15 分钟（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 和 100%），室温下进行。</li>
	<li>按体积比 3:1、1:1 和 1:3 将乙醇与环氧树脂混合，每种混合液共配制 300 µL。将每种环氧树脂混合液倒入培养皿中，在室温下孵育 1 小时。随后使用 100% 环氧树脂进行过夜浸渗。</li>
	<li>取包埋胶囊或 PCR 管，加入新鲜环氧树脂，将其倒置于目标区域上，放入 60 °C 烤箱中聚合 48 小时。</li>
</ol>
4. 切片与透射电子显微镜成像
<ol>
	<li>待环氧树脂完全聚合后，将底部玻璃浸入液氮中，使其与聚合物块分离。</li>
	<li>将样品块放入超薄切片机的样品台中，并固定于修块位置。使用剃刀刀片将树脂修整成围绕目标区域的梯形或矩形。</li>
	<li>将修整后的样品块重新装入样品台，并调整金刚石刀片位置，确保样品块的前缘与金刚石刀片边缘完全平行。</li>
	<li>使用超薄切片机从平面包埋的细胞中切下约60–70 nm的超薄切片。将连续切片收集在经formvar膜覆盖的载网槽上，并在加热板上烘干。</li>
	<li>用对比染色剂染色2分钟，再用柠檬酸铅染色1分钟。</li>
	<li>将载网放入透射电子显微镜（TEM）样品台中进行观察。根据光学显微镜下的微分干涉差（DIC）图像确定目标细胞位置。在1,700倍放大倍数下，通过拼接重叠图像的方式对整个细胞区域成像。</li>
</ol>
使用 ImageJ Fiji 进行图像拼接。
<ol>
	<li>开始图像拼接时，启动 ImageJ Fiji25，然后点击 文件 | 新建 | TrakEM2（空白）| 选择存储文件夹，以创建一个新的 TrakEM226 项目（图 2A1）。</li>
	<li>通过将原始图像瓦片数据拖放到工作区中，打开图像瓦片数据集（图 2A2）。</li>
	<li>点击鼠标右键，选择 对齐 | 拼接此层中的所有图像 | 弹性（非线性块对应），然后点击 确定，接受其余参数的默认值（图 2A3）。</li>
	<li>点击鼠标右键，选择 导出 | 生成平面图像 以创建拼接图像，然后点击 文件 | 另存为 保存图像。</li>
</ol>
6. 调整荧光图像大小
<ol>
	<li>打开照片放大软件（参见材料表）。点击文件 | 打开，并选择荧光图像。</li>
	<li>输入宽度和高度，使其与电子显微镜图像尺寸相同，并选择调整大小时应用的算法（图2B1）。</li>
	<li>点击文件 | 另存为，保存调整后的图像。</li>
</ol>
7. 使用 Big Warp 插件进行基于标志点的图像配准
<ol>
	<li>打开 ImageJ Fiji，将调整大小后的荧光显微图像（FM 图像）和拼接好的电子显微图像（EM 图像）拖入软件中。</li>
	<li>点击 Plugins | BigData Viewer | Big Wrap 开始配准，然后点击下拉菜单，选择 FM 图像作为移动图像，EM 图像作为目标图像（图 2C1）。 
	注意：每个 FM 和 EM 图像将弹出三个新窗口（BigWrap 移动图像、BigWrap 固定图像和 Landmarks），用于显示标记点。</li>
	<li>使用 缩放（鼠标滚轮）、图像旋转（按住鼠标左键移动鼠标）和 移动（按住鼠标右键移动鼠标）等功能对比 FM 和 EM 图像，然后按键盘上的 空格键 开启 标记点模式，再按 鼠标左键 在 FM 和 EM 图像中至少标记三个共同识别的标记点（图 2C2，粉色圆点和红色箭头）。</li>
	<li>标记完所有识别出的标记点后，进入 File | Export Moving Image | OK，此时将弹出一个包含已变换 FM 图像的新窗口（图 2C3）。 
	注意：新生成的弹出窗口是基于标记点变换后的 FM 图像。请检查图像对齐情况，如有必要，可通过添加或修改标记点并重新计算变换来进行调整。</li>
	<li>点击 File | Save As 保存变换后的 FM 图像。</li>
</ol>
8. CLEM 图像的叠加
<ol>
	<li>在 ImageJ 中，拖放转换后的 FM 图像和拼接后的 EM 图像。</li>
	<li>单击 图像 | 类型 | 8 位彩色，为 LM 和 EM 图像设置相同的图像类型（图 2D1）。 
	注意：EM 图像必须按以下顺序转换两次：8 位 -&#62; RGB 彩色 -&#62; 8 位彩色。</li>
	<li>单击 图像 | 颜色 &#62;| 合并通道，从下拉菜单中分别选择 FM 和 EM 图像，将图像合并为一幅复合图像（图 2D2）。</li>
	<li>单击 文件 | 另存为，保存 CLEM 图像。</li>
</ol>

Correlative Microscopy Reveals Stress-Induced Mitochondria-Lysosome Interactions

<ol><li>Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+mitochondrial+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of mitochondrial membrane dynamics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).</li>
<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Lopez, J., Tait, S. W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+apoptosis%3A+Killing+cancer+using+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within.</a> Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).</li>
<li>Wang, C., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+apoptosis%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in apoptosis*.</a> Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).</li>
<li>Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+mitochondria+and+cell+metabolism%3A+A+functional+triangle+in+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).</li>
<li>Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+machineries%2C+regulation+and+cellular+functions+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).</li>
<li>Talari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-droplet+associated+mitochondria+promote+fatty-acid+oxidation+through+a+distinct+bioenergetic+pattern+in+male+wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats.</a> Nat Commun. 14 (1), 766(2023).</li>
<li>Enkler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf1+coordinates+fatty+acid+metabolism+and+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis.</a> Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).</li>
<li>Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+biology+and+function%3A+Modern+view+of+cellular+debris+bin%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin.</a> Cells. 9 (5), 1131(2020).</li>
<li>Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysosome-centered+view+of+nutrient+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A lysosome-centered view of nutrient homeostasis.</a> Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).</li>
<li>Thelen, A. M., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+the+lysosome+in+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism.</a> Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome-related+organelles+mediate+mitochondrial+clearance+during+cellular+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation.</a> Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).</li>
<li>Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+mitochondria-lysosome+contacts+by+gba1+dysfunction+in+dopaminergic+neuronal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease.</a> Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).</li>
<li>Pickrell, A. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+pink1%2C+parkin%2C+and+mitochondrial+fidelity+in+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease.</a> Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).</li>
<li>Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+regulation+of+inter-mitochondrial+contact+fate+and+motility+in+charcot-marie-tooth+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2.</a> Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).</li>
<li>Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome+contacts+regulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+dynamics+via+lysosomal+trpml1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).</li>
<li>Juhl, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+membrane+contact+sites+for+sterol+transfer+between+endo-lysosomes+and+mitochondria+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells.</a> Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).</li>
<li>Khalil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+pathway+for+erythroid+iron+delivery+through+lysosomal+trafficking+of+transferrin+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2.</a> Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).</li>
<li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+%28clem%29+combining+live-cell+imaging+and+immunolabeling+of+ultrathin+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections.</a> Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).</li>
<li>Loginov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+organelle+microscopy%3A+Fluorescence+guided+volume+electron+microscopy+of+intracellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).</li>
<li>De Beer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+tissues%3A+A+multiscale+workflow+from+live+imaging+to+3D+cryo-CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meosem+withstands+osmium+staining+and+epon+embedding+for+super-resolution+clem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem.</a> Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+apex2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trakem2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trakem2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Redmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+autophagy+with+bafilomycin+and+chloroquine+decreases+mitochondrial+quality+and+bioenergetic+function+in+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons.</a> Redox Biol. 11, 73-81 (2017).</li>
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<li>Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+research+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microsc%22%5BJournal%5D)">The autophagy research in electron microscopy.</a> Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).</li>
<li>Hao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-reprogramed+megamitochondrion+contacts+and+engulfs+lysosome+to+mediate+mitochondrial+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion.</a> Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).</li>
<li>Hoglinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Npc1+regulates+ER+contacts+with+endocytic+organelles+to+mediate+cholesterol+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress.</a> Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).</li>
<li>Jung, M., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+imaging+by+correlative+light+and+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy.</a> J Vis Exp. (149), e59750(2019).</li>
<li>Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+organelle+dynamics+between+light+microscopic+live+imaging+and+electron+microscopic+3d+architecture+using+fib-sem%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem.</a> Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-targeted+biosensor+for+the+super-resolution+imaging+of+lysosome-mitochondrion+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction.</a> Front Pharmacol. 13, 865173(2022).</li>
<li>Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2018).</li>
<li>Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome+contacts+regulate+mitochondrial+fission+via+rab7+gtp+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis.</a> Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了使用遗传编码的mEosEM和APEX2标签，通过双色CLEM观察固定细胞中线粒体与溶酶体相互作用的方法。在过去几十年中，显微镜技术的进步显著提升了对细胞器网络动态变化的观察能力。32,33，细胞器相互作用的研究正变得日益引人关注。超分辨率显微镜已被用于观察线粒体与溶酶体之间高度动态接触的变化34,35,36然而，尽管使用了超分辨率显微镜，仍难以分辨线粒体内膜和外膜（约22 nm）以及嵴连接处（约28 nm）的厚度变化。37透射电子显微镜具有能够以极高分辨率观察生物样品结构的优点，但其缺点是图像只能以黑白形式呈现，使得在复杂图像中难以区分细胞器。在本实验方案中，我们采用了一种结合光学显微镜与电子显微镜优势的关联显微成像技术（CLEM），通过使用不同颜色对两种不同的细胞器进行染色，以监测它们之间的相互作用。特别是双色 CLEM 技术，对于观察和分析线粒体在溶酶体内的降解过程——即线粒体自噬（mitophagy）——是一种极为宝贵的工具，如图所示。 图3.
活细胞成像通常在生理条件下进行，使研究人员能够实时观察动态的细胞过程。然而，电子显微镜技术往往需要耗时的样品制备步骤，包括固定和染色。活细胞成像与电子显微镜样品制备之间的时间延迟限制了该技术的时间分辨率，可能导致某些动态细胞事件被遗漏。为了克服活细胞CLEM的这一局限性，我们开发了一种双色CLEM方法，其中mEosEM探针23和化学染料（Amplex-Red）通过APEX2邻近标记酶38进行标记，即使在严苛的固定环境中也能保留荧光信号。在之前的一项活细胞CLEM研究中39，由于在活细胞成像后进行透射电镜取样时存在时间分辨率问题以及样品制备中的技术局限性，发现荧光信号与电镜图像之间存在不一致。然而，通过对固定后的细胞进行足够长时间的荧光成像（以高倍率对整个细胞进行z轴层扫成像），我们可以解决时间分辨率问题，并提高光学显微镜与电镜图像之间的关联性（图3 和 图4）。
获得成功 CLEM 结果的另一个关键因素是如何准确地将 LM 图像与 EM 图像进行配准。为此，我们首先在光学显微镜成像过程中结合微分干涉差（DIC）和荧光成像模式，围绕目标细胞创建导航图。利用该导航图，我们能够轻松地在超薄切片机和透射电子显微镜（TEM）上识别出目标细胞。其次，通过在高倍率下获取整个细胞的 TEM 拼接图像，我们获得了多个可用于图像配准的解剖标志点。根据我们的经验，标志点数量越多，在 Big Warp 插件中实现的 LM 与 EM 图像配准精度就越高。
本研究中，我们通过高分辨率的CLEM结果展示了溶酶体与线粒体之间的相互作用区域。此外，双色探针可实现线粒体与溶酶体之间的精确区分。然而，该方法仍存在一些局限性。首先，若APEX2酶介导Amplex-Red进行邻近标记时反应时间过长，Amplex-Red将发生扩散，导致染色范围超出目标蛋白的定位区域38。其次，溶酶体被线粒体包裹区域的厚度（z轴体积）非常小，因此在50 nm厚的连续切片中难以确定两种细胞器膜的融合状态。此外，准确对齐光学显微镜下的光学切片与超薄切片机获得的机械切片的z轴方向，仍是一项重大挑战。为克服这些局限性，可将双色CLEM与传统的电子断层扫描技术40或连续切片体积-CLEM41相结合使用。

线粒体和溶酶体是维持细胞稳态所必需的主要膜结合细胞器。线粒体是高度动态的细胞器，其形态受分裂和融合事件的调控。1通常，线粒体被称为细胞的“动力工厂”，以其在氧化磷酸化、ATP 生成以及代谢物储存（如&#160;钙2除了在能量代谢中的作用外，线粒体还参与多种其他细胞信号转导过程，包括细胞凋亡。3,4钙信号传导5,6和脂质代谢7,8同样，溶酶体是高度动态的细胞器，作为细胞的回收中心发挥多种功能，通过蛋白质降解、自噬、内吞作用和吞噬作用维持细胞内部的清洁。9除了在降解过程中的作用外，溶酶体还在细胞生理过程中发挥多种功能，例如营养感应和稳态维持10脂质代谢11以及细胞去分化12.
尽管已有大量关于单个细胞器功能的研究，我们近期的研究重点集中在线粒体与溶酶体之间尚不明确的相互作用上，这种相互作用已被证明会影响细胞的生理和病理过程。线粒体与溶酶体之间的接触已在多种细胞类型中被观察到，包括癌细胞、神经元以及诱导性多能干细胞（iPSC）来源的细胞13，且主要出现在细胞应激状态或帕金森病13,14和腓骨肌萎缩症15等神经退行性疾病中。线粒体与溶酶体之间的接触通过两种细胞器之间交换离子（如Ca2+）16、胆固醇17和铁18，在线粒体代谢稳态维持中发挥重要作用。此外，线粒体与溶酶体的接触在细胞器质量控制中也起着关键作用。例如，受损的线粒体可通过线粒体自噬（mitophagy）过程被靶向降解，即被自噬体包裹后递送至溶酶体进行降解。因此，在受损线粒体对细胞或其他正常线粒体造成进一步损伤之前，便可被及时清除。这种线粒体与溶酶体之间的相互作用对于维持细胞稳态、防止功能异常细胞器的积累至关重要。由此，只有受损的线粒体被选择性地清除，从而确保健康的线粒体在细胞内发挥最佳功能。
相关联的光镜与电镜技术（CLEM）是一种成像技术，近年来因其结合了光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）的优势，能够在不同尺度上提供详细的结构信息，而受到研究领域的广泛关注。在 CLEM 中，首先使用光学显微镜对样品成像，以识别特定的兴趣区域，随后进行电镜样品制备步骤，如固定、脱水和包埋。然后在同一样品上进行电子显微镜观察。尽管最近已有活细胞 CLEM 方法的报道19,20,21,22，但将高度动态生物样品的光学图像与固定细胞的电子显微图像精确地整合到同一平面上仍然具有挑战性。对于线粒体和溶酶体等高度动态的细胞器而言，其精确定位在活体光学显微镜观察过程中可能发生改变，甚至在固定所需的短暂延迟期间仍会持续移动。
因此，在本实验方案中，采用了两种即使在固定剂溶液中仍保持活性的不同分子标签，以观察线粒体与溶酶体之间的相互作用。这两种细胞器通过交换离子（如 Ca2+）16、胆固醇17 和铁18，在线粒体代谢稳态维持中发挥重要作用。通过使用 TMEM192-V5-APEX2 和 Mito-mEosEM 两种构建体，可在透射电镜（EM）和光镜（LM）水平上观察培养细胞中线粒体与溶酶体的相互作用。对于线粒体，选择 mEosEM 标签是因为其能够在含固定剂溶液及 OsO4 的电镜样品制备过程中保持荧光信号23。对于溶酶体，则使用 APEX2 标签（一种分子量约为 28 kDa 的蛋白质）来研究特定蛋白在 EM 与 LM 水平上的定位24。在过氧化氢（APEX2 的底物）存在下，Amplex-Red 可在标签靶向位置形成不溶性聚合物，从而通过共聚焦显微镜观察到该信号。在本方案中，采用双色 CLEM 技术对固定细胞中溶酶体与线粒体之间相互作用的结构进行可视化观察。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学品与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>16200</td><td>醛类蒸气具有极高毒性，仅可在通风橱中使用。</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢溶液</td><td>默克</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛溶液</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-100-00</td><td>醛类蒸气具有极高毒性，仅可在通风橱中使用。</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>ThermoFisher</td><td>A12222</td><td></td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>默克</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>质粒转染</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>3% 柠檬酸铅</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>22410</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 4% 水溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>16320</td><td>剧毒。仅可在通风橱中使用。</td></tr><tr><td>六氰合铁(II)酸钾三水合物&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠三水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-500G</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>电子显微镜科学</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>UranyLess EM 染色剂</td><td>电子显微镜科学</td><td>22409</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒构建&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito-mEosEM</td><td>addgene</td><td>132706</td><td>DOI:&amp;nbsp;10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>TMEM192-V5-APEX2</td><td>Sharma N.&amp;nbsp; 等</td><td>N/A</td><td>DOI:&amp;nbsp;10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 μm 注射器滤器</td><td>赛多利斯</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 带网格盖玻片培养皿</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>BEEM 包埋胶囊</td><td>Ted Pella</td><td>130</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 支持的单槽铜网</td><td>Ted Pella</td><td>01705</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀</td><td>DiATOME</td><td>DU4530</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置共聚焦显微镜</td><td>尼康</td><td>A1 Rsi/Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件与算法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH / 开源</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>ImageJ BigWarp 软件包</td><td>NIH / 开源</td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/bigwarp</td></tr><tr><td>Photozoom Pro 8&amp;nbsp;</td><td>BenVista</td><td></td><td>https://www.benvista.com/photozoompro&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;替代软件&lt;br/&gt; 图像缩放器 &lt;/strong&gt;https://imageresizer.com/&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;千兆像素人工智能&lt;/strong&gt; https://www.topazlabs.com/gigapixel&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;ON1 调整大小 &lt;/strong&gt;https://www.on1.com/products/resize-ai/</td></tr></tbody></table>

双色相关光镜与电镜技术用于线粒体与溶酶体相互作用的可视化研究

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

线粒体和溶酶体等细胞器具有动态结构。尽管透射电子显微镜在结构分析方面具有更高的分辨率，但通过靶向特异性标记，光学显微镜对于动态细胞器的可视化仍至关重要。以下方案描述了一种结合双色共聚焦光镜与电镜联用技术（CLEM）的方法，用于观察线粒体与溶酶体之间的相互作用。本研究中，线粒体使用 mEosEM（Mito-mEosEM）标记，溶酶体则通过 TMEM192-V5-APEX2 标记。CLEM 图像所得结果使我们能够观察在外界应激条件下线粒体与溶酶体之间相互作用的变化。使用抑制溶酶体功能的巴佛洛霉素（bafilomycin, BFA）处理后，线粒体与溶酶体之间的接触增加，导致线粒体碎片化并被包裹在溶酶体内。相反，使用抑制溶酶体胆固醇外排的 U18666A 处理，则导致溶酶体被线粒体包围，表明存在一种不同的相互作用模式。本研究提供了一种在固定细胞中有效观察线粒体与溶酶体相互作用的方法。此外，利用双色探针进行 CLEM 成像为今后研究细胞器动态及其对细胞功能与病理的影响提供了有力工具。

为了利用这种双色CLEM方案可视化线粒体与溶酶体之间的相互作用，我们使用了Mito-mEosEM和TMEM192-V5-APEX2。首先用光学显微镜对固定后的细胞进行成像，随后进行电镜取样和成像。相关联的图像结果如图3A、B和图4A所示。按照上述方案，我们检测了在外界刺激条件下是否能够观察到线粒体与溶酶体之间相互作用的变化。
使用溶酶体V-ATP酶抑制剂BFA处理细胞可抑制自噬，导致线粒体质量下降，并增加线粒体与溶酶体之间的相互作用27。在BFA处理的细胞中，我们观察到线粒体被 trapping 在溶酶体内（图3B），而DMSO处理的对照细胞中则无此现象（图3A）。尽管仅通过透射电镜图像难以区分溶酶体内致密的碎片化线粒体与其它细胞结构，但在关联成像图像中可清晰分辨（图3B1、B2）。在DMSO处理细胞的线粒体中观察到的线粒体破坏结构（图3A1、A2；蓝色箭头）与溶酶体无关；而在荧光图像中看似溶酶体被 trapping 在大型线粒体内部的结构，实际上是线粒体包裹溶酶体的结构（图3A2；红色箭头）。
接下来，我们检测了U18666A（2 µg/mL，处理18小时）的作用，U18666A是一种已知的NPC1抑制剂，可阻断胆固醇从溶酶体中转运出来28。经U18666A处理的细胞显示出线粒体与溶酶体之间直接相互作用的增加（图4）。此外，U18666A处理样本中线粒体与溶酶体之间的接触与BFA处理样本中的接触存在差异。在BFA处理的HeLa细胞中，片段化的线粒体被完全包裹在溶酶体内，这是一种先前报道过的线粒体自噬形态12,29。然而，在U18666A处理组中，部分TMEM192阳性的溶酶体似乎被线粒体所包裹（图4D、E）30,31。
<img alt="细胞制备与成像工作流程：转染、APEX2标记、共聚焦显微镜、透射电镜设置分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：利用基因编码荧光探针进行基于透射电镜的关联显微成像技术示意图。（A）在35 mm玻璃网格底培养皿中培养HeLa细胞。（B）利用APEX2蛋白对固定后的细胞进行Amplex-Red标记。（C）使用共聚焦显微镜采集荧光图像。通过电动载物台和拼图扫描功能，获取目标细胞的大视野概览图像和高分辨率图像。大视野图像可作为导航图，用于在树脂包埋样品中定位目标细胞。（D）继续进行后固定、脱水及包埋处理。（E）在盖玻片上的目标细胞位置，使用装有树脂的PCR管或BEEM胶囊进行包埋。（F）树脂聚合后，移除盖玻片，在包埋块底面留下印刻的网格图案。（G）根据树脂表面的印刻网格图案定位目标细胞，并使用超薄切片机将目标细胞切成约60 nm厚的切片。（H）将连续切片收集到经formvar膜包被的铜载网槽上。（I）使用透射电子显微镜对载网进行成像。缩写：TEM = transmission electron microscopy；CLEM = correlative light and electron microscopy；ROI = region of interest。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图像处理示意图：图像拼接、荧光图像缩放、标志点配准、CLEM叠加。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：使用ImageJ Fiji进行图像处理及CLEM图像生成。（A1）Fiji与TrakEM2的主图形用户界面。（A2）导入使用透射电子显微镜（TEM）在1,700倍放大倍数下获取的瓦片图像数据集。（A3）利用TrakEM2的图像对齐方法进行图像对齐及拼接图像示例。（B1-B3）使用图像放大软件将小尺寸光学显微图像转换为大尺寸高质量图像。（C1-C3）利用Big Warp插件软件实现光学显微图像与电子显微图像之间配准的工作流程。（D1-D3）将经过变换的荧光显微镜（FM）图像与电子显微镜（EM）图像叠加，以合成相关显微镜图像。缩写：TEM = transmission electron microscopy；CLEM = correlative light and electron microscopy；FM = fluorescence microscopy。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="共聚焦、透射电镜、CLEM 示意图；线粒体、溶酶体定位；细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：经或未经巴佛洛霉素 A1 处理的线粒体与溶酶体接触位点的 CLEM 图像。 HeLa 细胞共转染 Mito-mEosEM（线粒体；绿色）和 TMEM192-APEX2（溶酶体；红色），然后用 Amplex-Red 染料染色。(A) 未经处理的 HeLa 细胞。基于线粒体信号和形态，将荧光信号提供的分子信息（左图）与透射电镜（TEM）获得的超微结构信息（中图）进行叠加（右图）。(A1,A2) 在未经处理的 HeLa 细胞中，线粒体内膜出现断裂（蓝色箭头），或线粒体与溶酶体彼此非常接近（红色箭头）。(B1,B2) 经巴佛洛霉素 A1 处理 18 小时的 HeLa 细胞中，观察到线粒体自噬现象，表现为未降解的线粒体被包裹在溶酶体内（绿色箭头）。比例尺 = 1 µm (A1,A2,B1,B2)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞中线粒体（绿色）和溶酶体（红色）的共聚焦显微镜、透射电子显微镜、相关光电子显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4U18666A处理的线粒体与溶酶体接触位点的CLEM图像 (A在U18666A处理下表达Mito-mEosEM和TMEM192-V5-APEX2（Amplex-Red标记）的HeLa细胞的双色CLEM图像2 µg/mL 18 小时）。(A1，A2红色箭头指示线粒体与溶酶体之间的接触位点。比例尺 = 1 µm. (B1-B3，C1-C3红色箭头通过连续图像显示线粒体与溶酶体之间的细胞器间融合现象。比例尺 = 500 nmB1-B3). 比例尺 = 1 µm (C1-C3). (D，E线粒体与溶酶体融合位点的高倍透射电镜图像。伪彩用于区分线粒体（绿色）和溶酶体（红色）。比例尺 = 100 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种利用相关联的光学显微镜与电子显微镜技术，分别对经mEosEM和APEX2标记的线粒体与溶酶体进行成像，以可视化其相互作用的方法。

细胞器，如线粒体和溶酶体，具有动态的结构。尽管透射电子显微镜具有更高的分辨率……

线粒体功能障碍与多种疾病相关，尤其是神经退行性疾病和代谢紊乱。因此，如果我们能够理解溶酶体如何调控线粒体，将有助于开发新的治疗策略。在本方案中，我们展示了一种双色 CLEM 方法，用于可视化线粒体与溶酶体的接触。相关光镜与电镜技术是一种结合了光学显微镜和电子显微镜优势的成像方法。在本方案中，我们利用双色探针最大化发挥相关光镜与电镜技术的优势，以可视化线粒体与溶酶体的接触。使用传统的电镜取样方法，很难清晰区分在溶酶体内降解的线粒体。本研究展示了高分辨率的CLEM结果，清晰地显示了溶酶体和线粒体的效应结构域。采用双色成像方法，可准确区分溶酶体内线粒体效应物。我们的研究揭示了线粒体与溶酶体之间存在相互作用。我们的研究发现，线粒体在不同外界应激条件下会以不同的方式与溶酶体相互作用。通过研究这些现象的成因及其调控因子，我们将更深入地理解细胞内线粒体质量控制机制。首先，在35毫米玻璃网格底培养皿中以每毫升1×10⁵的密度培养HeLa细胞。第二天，使用转染试剂将处于30%至40%融合度的细胞与质粒共转染。转染后，用二甲基亚砜或U18666A和巴佛洛霉素A1处理细胞18小时。进行共聚焦成像时，移除培养基，立即加入250微升温度为30至37摄氏度的温热固定液。立即去除固定液，加入1.5毫升新鲜固定液，冰上孵育30分钟。随后用1毫升冰冷的0.1摩尔卡考基late缓冲液洗涤细胞，每次10分钟，共洗涤三次。接下来，加入1 mL冰冷的20毫摩尔甘氨酸溶液以淬灭醛基。将细胞在冰上孵育10分钟后，用冰冷的0.1摩尔卡考基缓冲液洗涤三次，每次10分钟。然后向样品皿中加入500微升Amplex Red溶液，并在冰上孵育5分钟。随后，移除Amplex red溶液，并用0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液冲洗细胞三次，每次10分钟。使用共聚焦显微镜以3×3拼图扫描模式对目标细胞周围的区域进行成像。使用40倍物镜同时捕获微分干涉差（DIC）和荧光信号，以识别并记录网格培养皿上的网格线及字母标记。使用40倍物镜在高倍镜下对目标细胞进行成像，并采集Z轴层扫图像。使用共聚焦显微镜对Amplex Red染色的细胞成像后，加入1毫升1%的还原性四氧化锇溶液，在4°C下孵育1小时。随后在4°C下用蒸馏水洗涤样本，每次10分钟，共洗涤3次。在室温下依次用梯度乙醇溶液脱水，每次15分钟。然后按体积比3:1、1:1和1:3将乙醇与环氧树脂混合，每种混合液配制总量为300 µL。将每种环氧树脂混合液倒入培养皿中，在室温下孵育1小时。接下来，通过填充新鲜的环氧树脂来制备包埋胶囊。将管子或胶囊在感兴趣区域倒置，并置于60摄氏度的烘箱中聚合48小时。然后将底部玻璃和聚合物块浸入液氮中以分离它们。将样品块放入超薄切片机的样品夹中，并固定在修块位置。使用剃刀将树脂修整成围绕目标物体的矩形或梯形。将修整后的样品块重新放入样品夹，并调整金刚石刀片。使用超薄切片机从包埋平整的细胞中切下约60至70纳米的超薄切片。将连续切片收集于经甲醛膜覆盖的载网槽上，随后在加热板上干燥。之后，先用对比染色剂染色两分钟，再用柠檬酸铅染色一分钟。然后将载网放入透射电子显微镜（TEM）样品台中以进行观察。根据光学显微镜的微分干涉差（DIC）图像，确定目标感兴趣细胞，并在1,700倍放大倍数下，通过拼接重叠图像的方式对整个细胞区域进行成像。为了使用ImageJ Fiji获取HeLa细胞的关联光镜与电镜图像，首先启动ImageJ Fiji，点击文件、新建、TrakEM2空白项目，并选择存储文件夹以创建一个新的TrakEM2项目。将原始拼接图像数据拖放到工作区中，以打开拼接图像数据集。单击鼠标右键并选择该线条，对本图层中的所有图像进行拼接，并建立弹性非线性块对应关系。然后单击“确定”，接受其余参数的默认值。接下来，单击鼠标右键并选择“导出”，然后选择“生成平面图像”，以创建拼接后的图像。然后单击文件，选择“另存为”以保存图像。如需调整荧光图像的大小，请打开图像放大软件。单击文件，选择打开并选中该图像。输入宽度和高度，以匹配电子显微镜图像的尺寸。选择在调整大小方法中要应用的算法。单击文件并选择“另存为”以保存调整大小后的图像。打开 ImageJ Fiji，将调整大小后的荧光图像和拼接好的电子显微照片拖放到工作区中。点击插件中的“Big Data Viewer”和“Big Warp”以开始配准。然后单击下拉菜单，选择荧光显微图像作为移动图像，电子显微图像作为目标图像。利用缩放、图像旋转和移动等功能，对比荧光显微图像与电子显微图像。按下键盘上的空格键切换至标记点模式，按鼠标左键在两幅图像中均能识别的至少三个标记点处进行标记。标记完所有已识别的解剖标志后，依次点击文件、导出移动图像，然后点击确定。此时将弹出一个包含转换后荧光显微图像的新窗口。点击文件，选择另存为，以保存该转换后的荧光显微图像。为叠加 CLEM 图像，将经变换的荧光显微图像和拼接的电子显微图像拖放到 ImageJ 工作区中。点击图像，选择类型，设置为八位灰度图像，以使荧光图像和电子显微图像具有相同的图像类型。单击图像、颜色和合并通道以组合图像。然后单击文件并选择“另存为”来保存CLEM图像。在经巴佛洛霉素 A1 处理的细胞中观察到线粒体被困在溶酶体内，表明自噬受到抑制且线粒体质量下降；而对照组细胞中则显示线粒体与溶酶体相互作用，但未被溶酶体吞噬。对照组细胞中观察到的线粒体紊乱表现为线粒体包围溶酶体，而非被溶酶体吞噬。U18666A 处理的细胞显示出线粒体与溶酶体之间的相互作用增加，部分溶酶体被线粒体吞噬。

dual-color-correlative-light-electron-microscopy-for-visualization

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科研

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Neuroscience

神经科学

双色光电联相显微镜用于观察线粒体和溶酶体之间的相互作用

相关联的光学与电子显微镜技术（CLEM）作为可视化显微注射分子及其真核细胞亚细胞靶标的工具

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

本文描述了一种方法，即利用量子点（QD）纳米颗粒对环氧树脂包埋的人类病理组织进行相关免疫细胞化学研究。我们采用 commercially available...

使用量子点纳米颗粒的关联光镜与电镜技术

本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18...

活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。...

线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。...

双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制。然而，线粒体自噬的评估 体内 由于缺乏可靠的定量检测方法，该过程受到限制。本文介绍了一种利用细胞膜通透性绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料，在活细胞中观察线粒体自噬的实验方案。...

利用线粒体与溶酶体荧光染料可视化线粒体自噬

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

通过电子显微镜、遗传传感器和免疫荧光技术研究线粒体自噬需要昂贵的设备、熟练的技术人员以及大量的时间投入。本文展示了商用荧光染料试剂盒在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

线粒体自噬的检测 秀丽隐杆线虫 使用细胞器特异性染料标记细菌和哺乳动物细胞

本方案介绍了一种用于培养SH-SY5Y细胞和原代大鼠海马神经元的增殖、分化与染色的工作流程，旨在通过受激发射损耗（STED）显微镜对线粒体超微结构进行可视化与分析。...

利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

学习双色光电联相显微镜技术，用于高分辨率观察HeLa细胞中线粒体与溶酶体的相互作用。该方法结合荧光与电镜优势，揭示细胞器在不同应激条件下的动态关系，为神经退行性疾病研究提供新思路。

双色相关光镜与电镜技术用于线粒体与溶酶体相互作用的可视化研究

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