结合成像与电生理技术在小鼠中可视化并记录扩散性去极化

本研究的目的是利用脑模型来理解扩散性去极化与轻度创伤性脑损伤之间的关系。我们团队及其他研究团队近期已证实，在小鼠的轻度闭合性颅脑损伤中会发生扩散性去极化。常用的体内电生理放大器会滤除与扩散性去极化相关的缓慢细胞外电位变化，从而几乎无法检测到扩散性去极化现象。

本方案的优势在于结合成像技术和活体电生理学，以确认轻度创伤性脑损伤后是否存在扩播性去极化。我们已开始了解扩播性去极化在轻度创伤性脑损伤相关的急性行为变化、病理改变以及长期认知缺陷中的作用。首先，将麻醉后的动物置于立体定位仪中，并使用加热垫维持动物的体温。

使用10号手术刀片，沿中线从前向后做切口。立即在切口处涂抹氰基丙烯酸酯胶水。然后将皮肤向两侧推开，暴露颅骨。

在颅骨上再添加一到两滴氰基丙烯酸酯胶水，以提供额外保护。在胶水干燥的同时，使用无菌手术剪扩大小脑部位的切口。接着，使用0.8毫米的钻头在颅骨上钻出导向孔，并将螺钉旋入颅骨。

将多余的导线缠绕在螺钉上，为后续放置头帽留出一定余量。所有颅骨螺钉就位后，将金针逐一插入目标头帽连接器中。利用立体定位仪臂固定连接器，将其针脚置于螺钉头部正上方附近，确保导线无接触。

用氰基丙烯酸酯胶密封整个区域，确保颅骨螺钉前方的成像区域不受干扰。在金质引线基部周围构建牙科水泥，确保颅骨螺钉上的金质引线与头固定装置中的金质引线互不相连。待牙科水泥固化后，再移除头固定连接器。

首先，打开 IOS 计算机和 LED 面板。将已植入电极的麻醉动物固定在相机下方的撞击床上，并调节焦距环以覆盖皮层表面。

加载固有光学信号（IOS）设置后，按下“实时”按钮以查看小鼠，并将动物颅骨置于摄像头正下方居中。然后，点击“多维度采集”以进入采集设置，并选择所需的时间点。将图像保存至指定文件路径，并使用适当的文件名前缀。

将动物身上的金针连接到头期连接器，然后连接到头期装置。打开电生理计算机，并将计算机连接至电生理设备。加载Intan软件的设置后，点击“选择文件格式”图标，在弹出窗口中选择“每种信号类型一个文件”格式。

然后，在硬件带宽（Hardware Bandwidth）的 BW 选项卡下，选择放大器带宽为 0.13 至 500 赫兹。在滤波器显示选择器（Filter Display Selector）中选择“宽”（Wide）。设置低通和高通滤波器后，单击选择文件名图标，以选定用于保存的文件路径。

进行撞击时，打开电磁撞击器并拨动杠杆，检查撞击头是否能正常回缩和伸出。迅速将动物放置在泡沫床板上，并将床板滑至撞击器头部下方。使撞击器头部对准中线，并将其定位在前囟前方1毫米处。

然后，降低撞击器尖端，直至其牢固接触动物头部顶端。推动杠杆使撞击器尖端回缩，随后手动将其下移五毫米，再启动撞击杠杆。立即从泡沫床中取出动物，并在五秒内将其置于相机下进行成像。

在多维采集窗口中点击“Acquire”以开始IOS成像。采集四分钟的图像以记录完整的去极化扩散事件。要开始电生理记录，请在Intan软件中点击“Record”图标。

记录完成后，将动物从头端放大器和连接器上断开，并放回其笼中。要打开图像序列，请依次点击文件、导入和图像序列。使用光标绘制一个方框，定义感兴趣区域，以生成扩布性去极化的曲线图。

转到图像，然后依次选择堆栈和绘制 Z 轴轮廓以绘制图形，并点击实时按钮。在生成的图中，点击列表以生成数值列表。为便于可视化，使用火焰查找表将灰度图像进行转换。

通过观察窗可见去极化波在大脑皮层和大血管上扩布。电生理记录中的高频活动显示，假手术动物在撤除异氟烷后迅速恢复；但在去极化动物中，高频活动在数分钟内仍持续受到抑制，之后才恢复。

功效图显示，在两种条件下，从抑制状态恢复后，功效均明显上升。