利用高效液相色谱法对小鼠眼部及非眼部组织中膳食维生素A代谢物进行定量分析

我们的实验室研究两种关键的维生素A转运蛋白，即STRA6和RBPR2。这些膜蛋白促进血液中的维生素A进入眼和肝脏等组织。通过高效液相色谱法（HPLC），我们可在转基因小鼠中建立全身性维生素A谱，从而研究这些转运蛋白的生理功能。

本领域中另一种常用的技术是表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR），用于研究蛋白质与其配体之间的结合亲和力和动力学。我们已应用SPR技术来探究STRA6或RBPR2与RBP4-视黄醇结合复合物之间的相互作用。该方法目前面临的一个挑战是样品通量较低。

溶剂蒸发步骤是本方案中的主要瓶颈，未来的研究人员应尝试使用氮气吹干蒸发等干燥方法，与真空蒸发相比，这些方法具有更高的通量。我们已确定RBPR2在肝脏功能中作为维持全身维生素A稳态的重要促进因子的作用。在转基因小鼠中干扰RBPR2的表达后，通过HPLC定量发现，所有检测的全身组织中维生素A水平均出现显著紊乱。

大多数基于高效液相色谱法（HPLC）的维生素A检测方案采用反相方法，通常无法使类视黄醇异构体实现有效分离。我们的正相方案可分离视黄醛和视黄醇异构体，从而建立详细的维生素A谱型，这对于研究维生素A在光转导级联反应中的光异构化过程至关重要。首先，将提取的小鼠组织放入含有50%冰冻生理盐水和50%甲醇的组织研磨管中。

将研杵插入研磨管中，轻轻旋转五次以匀浆组织。立即将匀浆后的组织转移至15毫升离心管中。向匀浆样品中加入2毫升甲醇和1毫升0.1摩尔的羟胺溶液。

将混合物在室温下静置15分钟。进行类视黄醇提取时，向匀浆中加入10毫升己烷，并将试管水平涡旋至少10秒。将匀浆与己烷的混合物在1,000 ×g下离心3分钟，以分离各相。

使用移液器将己烷层转移至另一个15毫升玻璃管中，并将样品置于真空离心浓缩仪中，以彻底蒸发提取样品中的己烷。用100微升己烷重悬15毫升管中的干燥类视黄醇，并充分涡旋振荡，确保所有类视黄醇完全溶解。将全部100微升己烷移入第二个玻璃管中，并涡旋振荡该管，使类视黄醇充分溶解。

然后用移液器将全部100微升己烷转移至单个玻璃进样插件中，用于高效液相色谱分析。根据适当条件设置高效液相色谱运行程序。通过各目标类视黄醇标准品的保留时间和紫外光谱来鉴定色谱峰。

使用色谱数据系统对已识别的色谱峰进行积分，并参照外标曲线以定量分析物。对于生物组织的色谱图，需手动积分色谱峰，以校正保留时间的变异。在对照小鼠眼球的色谱图中，鉴定出13-顺式-视黄醛、11-顺式-视黄醛、全反式-视黄醛、11-顺式-视黄醇和全反式-视黄醇。

在经羟胺处理的小鼠眼部色谱图中，保留时间有所增加。这些视网膜醛的顺式与反式异构体也同时存在。在小鼠肝脏组织的色谱图中，棕榈酸视黄酯和全反式视黄醇被鉴定为维生素A的主要形式，而小鼠血液的色谱图则显示出一个反式视黄醇峰。

紫外吸收光谱证实了色谱峰中存在类视黄醇异构体。