Name: 研究维生素 A 膜受体和视蛋白与其配体在产生视黄基蛋白中的相互作用的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 探索维生素A稳态调控机制，研究RBPR2与RBP4的生理相互作用及11-顺式视黄醛与视蛋白的结合过程。本方法利用定量技术揭示肝脏与眼睛之间的远距离通讯机制，为理解饮食和遗传因素导致的视觉疾病提供重要依据。

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作者感谢贝亚塔·亚斯特任布斯卡博士（俄亥俄州凯斯西储大学药理学系）在视紫红质吸光度实验方案方面提供的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院眼科研究所资助（项目编号：EY030889 和 3R01EY030889-03S1），以及明尼苏达大学向 G.P.L. 提供的部分启动资金支持。

1. 表面等离子共振（SPR）方法学
<ol>
	<li>小鼠 RBP4 蛋白的制备与纯化
	<ol>
		<li>设计引物以扩增全长小鼠 RBP4（msRBP4）cDNA（NCBI 参考序列：NM_001159487.1）。将 msRBP4 cDNA 克隆至 pET28a His 标签卡那霉素抗性表达载体中，并在 BL-21 DE3 细胞中表达（材料表）。</li>
		<li>将连接好的 msRBP4-pET28a 载体转化至 BL-21 DE3 感受态细胞中（按照制造商说明书操作），随后涂布于含卡那霉素 50 µg/mL 的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上30,37。将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养，次日筛选阳性克隆。</li>
		<li>挑取单个菌落，接种于 5 mL 含卡那霉素 50 µg/mL 的 LB 液体培养基中，37 °C 过夜培养。</li>
		<li>以步骤 1.1.3 的初级培养物 1% 体积接种于 500 mL 含卡那霉素 50 µg/mL 的 LB 液体培养基中进行二级培养，37 °C 培养 3–4 小时；使用分光光度计检测光密度。当 OD 值处于 0.6 至 1.0 之间时，加入 0.5 mM IPTG，在 24 °C 下诱导蛋白表达过夜。</li>
		<li>采用 0.1–1 mM 的多种 IPTG 浓度及 16–30 °C 的温度范围，优化 msRBP4 的表达水平与稳定性。</li>
		<li>将培养物（来自步骤 1.1.5）在 16,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，沉淀置于冰上保存。</li>
		<li>用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%（v/v）Triton X-100，10% 甘油，0.5 mM PMSF 及蛋白酶抑制剂，pH 8.0）重悬沉淀。使用输出功率为 250 瓦、频率为 20 kHz、输出强度为 40–50% 的匀浆器进行超声处理，工作模式为开启 15 秒、关闭 30 秒，重复 5 次。</li>
		<li>在 16,000 × g 条件下离心 20 分钟，去除细胞碎片和未裂解细胞。将裂解液上清通过预先用缓冲液平衡的镍-NTA 柱。</li>
		<li>用含 30 mM 咪唑的裂解缓冲液（来自步骤 1.1.8）洗涤层析柱。</li>
		<li>使用含 250 mM 咪唑的缓冲液洗脱结合的 msRBP4 蛋白，收集洗脱组分。通过 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各组分，并用考马斯亮蓝 R-250 染色液（甲醇:水:乙酸 = 45:45:10）染色，再用不含染料的甲醇:水:乙酸（45:45:10）溶液脱色，以肉眼观察蛋白量。</li>
		<li>合并未使用的组分，使用 10 kDa 截留分子量（MWCO）的 10K 透析盒对合并组分进行透析。</li>
		<li>通过 12% SDS-PAGE 凝胶评估透析后组分的纯度，并测定蛋白浓度。 
		注：表面等离子共振（SPR）分析中使用的是无配体 RBP4（Apo-RBP4）蛋白。如需制备全反式视黄醇结合的 RBP4（holo-RBP4，即 RBP4-视黄醇复合物），请参考已发表的详细方案36,37。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过色氨酸荧光分析和圆二色性（CD）光谱法初步验证 RBPR2 与 STRA6 肽段与 RBP4 的结构特征及相互作用
	<ol>
		<li>色氨酸荧光分析
		<ol>
			<li>使用在线蛋白质组成分析工具（https://web.expasy.org/protparam/），将氨基酸序列以单字母代码形式粘贴，以评估重组 RBP4 蛋白及 RBPR2 和 STRA6 各自肽段的结构组成，并确定各肽段和蛋白中色氨酸（Trp）残基的存在情况（材料表）。</li>
			<li>点击“计算参数”按钮，评估色氨酸（Trp）残基的氨基酸组成。 
			注：被分析的各个肽段或蛋白中必须含有色氨酸残基。</li>
			<li>将 RBPR2 和 STRA6 各自肽段稀释至不同微摩尔浓度，分别与 3 µg msRBP4 在 96 孔板中室温孵育 5 分钟。以 290 nm 激发光激发混合物，扫描 300 nm 至 400 nm 波长范围内的发射光谱。</li>
			<li>以空白组（仅缓冲液，无肽段和蛋白）和肽段对照组（无蛋白）进行数据归一化，并作图。 
			注：随着肽段浓度由低至高增加，若观察到色氨酸荧光信号增强，则提示该肽段与 RBP4 蛋白之间存在正向相互作用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>圆二色性（CD）光谱分析
		<ol>
			<li>将各肽段及重组 RBP4 蛋白稀释于 1× PBS 缓冲液（pH 7.0）中。为进行质量检测，使用 0.1 至 10 μg/mL 范围内的不同浓度 RBPR2 和 STRA6 肽段及 RBP4 蛋白，具体方法如下所述。</li>
			<li>将稀释后的各肽段和蛋白分别加入光程为 0.1 cm 的比色皿中，使用圆二色光谱仪在 195–250 nm 波长范围内测定 CD 吸光度/椭圆率。使用以下公式计算平均残基椭圆率（θ）： 
			[v] = (S × mRw)/(10cl) 
			其中 S 表示以 mθ 为单位的 CD 信号；mRw 表示平均残基分子量；c 表示蛋白浓度（mg/mL）；l 表示光程（cm）。</li>
			<li>使用 BeStSel 二级结构分析工具（https://bestsel.elte.hu）基于 CD 光谱数据计算分子结构的二级结构百分比变化。 
			注：二级结构可反映蛋白是否正确折叠以及构象是否保守，这对相互作用研究及其结果至关重要。请检查预测的结构域构象，确认无误后继续开展相互作用研究。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. SPR分析以测定维生素A膜受体（RBPR2和STRA6）与其生理配体RBP4的结合亲和力及动力学参数
<ol>
	<li>用于RBP4在CM5芯片表面的固定化时，我们采用表面等离子共振（SPR）传感器芯片，该芯片表面共价连接有羧甲基葡聚糖交联层，延伸至约100 nm，并固定于金膜表面。在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）存在条件下， NN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将芯片表面的羧基转化为 N-羟基琥珀酰亚胺酯可自发与氨基酸和蛋白质的氨基发生反应，从而使配体共价结合到芯片表面材料表).
	<ol>
		<li>固定纯化的 毫秒传感器芯片上的 RBP4 蛋白图1 和 图2）。在软件中 运行 菜单，选择 向导 并继续进行 固定化 选项。将配体（毫秒将步骤1.1中获得的RBP4蛋白用固定化缓冲液（10 mM醋酸钠缓冲液，pH 5.0）稀释至10 µg/mL（4 µL配体 + 396 µL缓冲液），并将偶联试剂分装至小瓶中。打开 固定化设置向导 软件控制窗口 选择 CM5 芯片，以及选项 固定2号流动池 和 目标水平 的 1,200 反应单元（RU) 以在动力学研究中达到30 RU的Rmax值 洗涤液：乙醇胺输入名称 RBP4 并点击 下一步. 
		注：可选： 系统准备 对话框用于 运行前启动 如果此前已使用运行缓冲液PBST（含0.05% Tween 20去污剂溶液的磷酸盐缓冲盐水）进行过预处理，则此步骤非必需。</li>
		<li>在 架子位置 对话框中，单击 推出载架. 取出试管架，将各试剂按指定体积加入试管中：每管加入 156 µL 的 毫秒RBP4、177 µL 乙醇胺、89 µL EDC、89 µL NHS 以及一个空离心管。插入装有样品管的支架，然后点击 好的，下一步.</li>
		<li>在 准备运行程序 对话框中，单击 开始并保存.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RBPR2与STRA6肽段动力学实验设置
	<ol>
		<li>梯度稀释小鼠 RBPR2、突变型 RBPR2 和 STRA6 肽段（先前化学合成）31 并列于 材料表在0.8–26.6 μM范围内的运行缓冲液中。</li>
		<li>打开控制软件并选择 动力学/亲和力向导. 点击 文件 | 打开模板 并选择 动力学/亲和力输入注射序列对话框 流路 2-1 (流通池 2 作为 活性 和 流通池 1 作为 参考文献），检查 芯片类型 CM5，然后单击 下一步. 在 设置 对话框，检查该 运行启动循环，输入 溶液：缓冲液 和 循环：并单击 下一步.</li>
		<li>在 注射参数 对话框中，输入以下数值 样本 参数： 结合时间：120 秒，流速 30 μL/min，解离时间 300 秒；用于 再生 参数：输入再生溶液名称：Glycine-HCl (pH 2.5) 接触时间：30 s，流速：30 μL/min 并点击 下一步.</li>
		<li>在 样本 对话框中，输入 名称 的 肽, 分子量，以及 浓度 并点击 下一步. 在 架子位置 对话框中，将稀释后的多肽分配为不同浓度（1 至 100 µM）的单独样品，每份约 120 µL，并将约 230 µL 缓冲液、约 120 µL 缓冲液以及约 1,000 µL pH 2.5 的甘氨酸溶液分别分配至 Rack 上的相应位置。点击 推出载架 并插入所有小瓶。点击 下一步，以及在 准备运行程序 对话框中，单击 开始，输入文件名，然后 保存 (图2).</li>
		<li>在软件中，单击 开始菜单 并选择 评估选择 打开文件 在软件中，从下拉选择菜单中选择 Fc2-1，以分析参照细胞经空白扣除后的活性传感图在结合与解离阶段的数据 毫秒RBP4 和突变体 毫秒RBPR2 和 毫秒STRA6 肽段</li>
		<li>点击下拉菜单 动力学/亲和力 按钮并选择 表面结合；以打开 选择曲线 对话，检查 在表格中包含该列 并点击 下一步选择 数据对话 显示减去空白的传感图；点击 动力学与亲和力，保持默认参数，然后单击 适合 曲线拟合选项。检查 报告 平衡解离常数 K 的标签d 和 Ka 或 K开启 结合速率和Kd 或 K关闭 解离速率。将动力学数据传感器图以制表符分隔的 .txt 格式保存，并使用这些数值绘制图表（图3).</li>
		<li>为了确定亲和动力学常数 Kd （平衡状态下与一半受体结合的配体浓度），将从评估结果生成的 .txt 格式文件中的数据列复制并粘贴到软件中用于 XY 作图的数据区域。点击 分析 和 非线性回归（曲线拟合），检查 数据列，然后单击 好的. 在 参数 对话框中，单击 结合饱和度 和 单一位点特异性结合拟合模型 其公式为： 
		Y = (Bmax × X) / (Kd + X) 
		其中，Bmax 为最大结合位点数（响应单位），X 为肽段浓度，Y 为结合量（响应单位）图3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分光光度法测定视网膜裂解液中G蛋白偶联受体-11-cis 视黄醛蛋白复合物（视黄基 Schiff 碱蛋白视紫红质）含量的方法
<ol>
	<li>将预定的成年 WT-C57BL/6J 小鼠组运送至暗室。</li>
	<li>在黑暗环境中适应过夜 12–16 小时，在红光下将小鼠放入安乐死舱，打开调节器上的 CO2 气体阀门至 5 L/min，持续约 5 分钟。通过按压颈部并向后拉尾部（颈椎脱位）确认动物死亡。</li>
	<li>摘除眼球，并在冰浴缓冲液中匀浆，缓冲液含 20 mM bis-tris propane（1,3-双(三(羟甲基)甲氨基)丙烷；BTP）pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA 及蛋白酶抑制剂（材料表）。</li>
	<li>将匀浆液在 4 °C 条件下以 16000 × g 离心 15 分钟，弃去含有水溶性胞质蛋白的上清液。将沉淀的膜及膜蛋白重悬并溶于含 20 mM n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）、20 mM bis-tris propane（BTP）pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM EDTA 及蛋白酶抑制剂的缓冲液中，在 4 °C 旋转平台上孵育 1 小时。</li>
	<li>将重新溶解的膜组分在 4 °C 条件下以 16000 × g 离心 1 小时。将上清液与 30 μL Rho 1D4 抗体磁珠混合，在 4 °C 旋转平台上孵育 1 小时。</li>
	<li>使用磁力架分离磁珠，弃去上清液，并用含 20 mM bis-tris propane（BTP）pH 7.4、500 mM NaCl 和 2 mM DDM 的缓冲液洗涤磁珠。</li>
	<li>通过在室温下用含 0.2 mg/mL 1D4 肽（-TETSQVAPA）的缓冲液（20 mM bis-tris propane（BTP）pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM DDM）孵育 5–10 分钟，洗脱视紫红质蛋白（图 4 和 图 5）。</li>
	<li>使用矩形、亚微体积、石英比色皿（孔径 2 mm，光程 10 mm，容积 50 μL），在分光光度计的快速扫描模式下测定 200 nm 至 800 nm 范围内的吸光度。 
	注：仅使用高质量石英比色皿（图 4）。</li>
	<li>为验证并确定样品质量，检测洗脱液并暴露于强光下 1 分钟，然后重复步骤 3.8。</li>
	<li>扣除空白吸光度后，计算分析所得吸收光谱的比值：500 nm 处为结合 11-cis 视黄醛的视蛋白，380 nm 处为光照后结合全-trans 视黄醛的视蛋白，280 nm 处为无配体的脱辅基视蛋白（Apo-Opsin）（图 6）。无配体视黄醛的游离视蛋白在 500 nm 处提供基线吸光度。</li>
	<li>为定量视紫红质浓度，使用比尔-朗伯定律： 
	A=ε·C·l 或 C=A/ε·l 
	其中 A 为吸光度，ε 为摩尔消光系数（视紫红质 ε500 = 40,600 M−1 cm−1，游离脱辅基视蛋白 ε280 = 81,200 M−1 cm−1），C 为浓度，l 为光程。</li>
	<li>为以百分比形式定量配体结合型视蛋白，使用 A280/A500 的比值。</li>
	<li>绘制扣除空白后的吸光度光谱，并计算游离视蛋白值32。</li>
	<li>使用消光系数 ε500 = 40600 M−1 cm−1 计算视紫红质浓度。脱辅基视蛋白（无配体）浓度则通过比尔-朗伯定律，使用消光系数 ε280 = 81,200 M−1 cm−1 计算。</li>
</ol>

Investigating Vitamin A Receptor Kinetics and Function for Retinoid Homeostasis

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<li>Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+extracellular+RBP4+ligand+binding+domain+on+the+RBPR2+receptor+for+vitamin+A+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport.</a> Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).</li>
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<li>Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analyses+of+retinol+transport+by+the+membrane+receptor+of+plasma+retinol+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein.</a> J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).</li>
<li>Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinol+binding+protein+receptor+2+%28Rbpr2%29+is+required+for+photoreceptor+outer+segment+morphogenesis+and+visual+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish.</a> Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定发表研究成果等方面均未发挥作用。

方案中的关键步骤 
SPR 方法学 
计算机模拟 建模与对接分析：RBPR2（https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1）和STRA6的预测结构，以及已知的结构&#160;毫秒RBP4 PDB 数据库（RSCB PDB ID: 2wqa）应用于对接研究29,31此外， 体外 应采用细胞培养方法来验证维生素A受体（RBPR2和STRA6）上假定结合位点与其配体（RBP4）之间的相互作用29,31(补充图 S1、补充图 S2 和补充图 S3）。使用CD光谱法测定肽的质量。此前，对于远紫外CD光谱，采用1 mm矩形比色皿，样品浓度为0.1 μg/μL，体积约200 μL（含3–4 μg RBP4蛋白、...

膳食获取的维生素A/全反式维甲酸转 视黄醇（retinol/ROL）是参与视觉功能的重要成分1,2. 发色团 11-顺式 视黄醛是膳食维生素A的代谢产物，可与光感受器中的G蛋白偶联受体（GPCR）视蛋白结合，生成视黄醛蛋白——视紫红质。当光线照射到眼睛时，视紫红质的构型会发生根本性变化，这一过程通过其11-顺式顺式-视网膜组分到全-转-视黄醛。这种构型变化会触发视杆细胞内的光转导级联反应，将光转化为电信号，并通过视神经传递至大脑的视觉皮层。3,4,5,6,7,8,9,10血清和眼内ROL浓度降低会影响视黄醛蛋白的形成，进而导致视蛋白错位、脱辅基视蛋白积聚、夜盲以及光感受器外节变性，最终引发视网膜色素变性或莱伯先天性黑蒙，可能导致失明3,10.
全部-转 视黄醇是膳食维生素A的基本运输形式，也是所有功能性类视黄醇和膳食维生素A代谢物的来源。肝脏是膳食维生素A储存的主要器官。肝内的视黄醇以与视黄醇结合蛋白4（RBP4）形成的复合物形式通过血清运输。RBP4主要在肝脏中表达，与视黄醇底物和转甲状腺素蛋白（transthyretin, TTR）形成全复合物后进入血液循环。11,12,13,14,15,16,1720世纪70年代关于RBP4细胞表面受体的报道提出了膜转运蛋白可能参与视黄醇类物质进出细胞运输的假说。在眼部视网膜色素上皮（RPE）中，RBP4结合的视黄醇（RBP4-ROL）的细胞表面受体被鉴定为视黄酸诱导基因6蛋白（STimulated by Retinoic Acid 6 Retinol, STRA6）。STRA6可结合循环中的全型RBP4复合物，并将RBP4结合的视黄醇转运穿过RPE，供光感受器细胞利用18,19.STRA6基因的突变可导致多种疾病及表型，这些疾病和表型与眼部视黄醇（ROL）浓度降低相关。发育过程中发生的STRA6突变可导致无眼症、小眼球症以及其他非眼部症状，这些症状与Matthew-Wood综合征相关的表型存在重叠20,21,22,23,24,25,26,27STRA6 在不同器官和组织中表达，例如眼内的视网膜色素上皮（RPE），但并非在所有组织中均有表达26,27尽管类视黄醇的主要储存部位是肝脏，但STRA6在肝脏中并不表达。
Alapatt 及其同事发现，视黄醇结合蛋白4受体2（RBPR2）能够以高亲和力结合RBP4，并负责肝脏对RBP4结合的视黄醇的摄取，这一功能与RPE中的STRA6相似28。已有研究报道，RBPR2在结构上与STRA6具有同源性29,30,31。据推测，RBP4可结合RBPR2上的S294、Y295和L296残基，该氨基酸结合结构域在RBPR2与STRA6之间部分保守29,30,31。根据这些研究，诸如STRA6和RBPR2等含有一个或多个胞外结合残基/结构域的维生素A膜受体，被认为可与循环中的RBP4-ROL相互作用。因此，膜受体在介导循环RBP4与其靶组织（如肝脏和眼睛）细胞表面受体结合并实现视黄醇内化的过程中发挥着重要作用。
在本研究的第一部分，我们利用表面等离子体共振（SPR）技术研究了两种维生素A膜受体（RBPR2和STRA6）与其生理配体RBP4的相互作用31表面等离子体共振技术（SPR）可实时测定蛋白质与配体复合物的结合亲和力及结合/解离动力学。该方法旨在提供关于RBPR2和STRA6中RBP4结合基序的关键动力学、结构及生物化学信息，这对于理解维生素A缺乏相关病理状态至关重要。31,32如上所述，循环中的ROL通过STRA6被视网膜色素上皮细胞（RPE）内化，以生成发色团11-顺式 视黄醛，在感光细胞中与视蛋白结合形成视黄亚胺蛋白视紫红质33我们采用分光光度法对G蛋白偶联受体-视蛋白及其配体11-顺式 小鼠视网膜裂解液中视黄醛蛋白复合物，对于理解视网膜色素变性或莱伯先天性黑蒙等眼病状态下视紫红质（rhodopsin）减少的机制至关重要34。通常，这些方案可用于研究 体外 突变体的生理学后果 RBP4, STRA6，或 RBPR2 影响全身及眼部维生素A稳态，或突变视紫红质及类视黄醇循环蛋白对视觉功能的影响35,36.

<table><tbody><tr><td>2-D 定量试剂盒</td><td>Cytiva</td><td>80648356</td><td></td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>Cytiva</td><td>BR100050</td><td></td></tr><tr><td>Biacore 分析软件</td><td>Biacore S200</td><td>版本 1.1</td><td></td></tr><tr><td>Biacore 传感芯片 CM5</td><td>Cytiva</td><td>BR100530</td><td></td></tr><tr><td>双(三羟甲基)氨基甲烷丙烷（Bis tris propane）</td><td>Sigma</td><td>B6755-25G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>BL21 DE3 感受态细胞</td><td>Thermo Scientific</td><td>EC0114</td><td></td></tr><tr><td>圆二色光谱仪</td><td>Jasco</td><td>J-815 圆二色光谱仪</td><td></td></tr><tr><td>盐酸甘氨酸（Glycine HCL）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>模型拟合、数据分析</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷（DDM）</td><td>EMD Millipore</td><td>324355-1GM</td><td>2–20 mM</td></tr><tr><td>pET28a His标签卡那霉素抗性表达载体&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>69864-3</td><td></td></tr><tr><td>质粒纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Rho1D4 磁珠</td><td>CubeBiotech</td><td>33299</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A_Lyzer 10K 透析盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>吐温20（Tween20）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td>0.05%</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>Cary 60 UV-Vis</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;肽名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;肽序列&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;HPLC纯度&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;质谱&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>小鼠 Rbpr2 (42)</td><td>HVRDKLDMFEDKLESYLTHM&lt;br/&gt; NETGTLTPIILQVKELISVTKG</td><td>92.14%</td><td>符合</td></tr><tr><td>小鼠 Stra6 (40)</td><td>SVVPTVQKVRAGINTDVSYL&lt;br/&gt; LAGFGIVLSEDRQEVVELVK</td><td>90.84%</td><td>符合</td></tr><tr><td>小鼠 Rbpr2 突变体 S294A (42)</td><td>HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM&lt;br/&gt; NETGTLTPIILQVKELISVTKG</td><td>0.92%</td><td>符合</td></tr></tbody></table>

研究维生素a膜受体与视蛋白与其配体相互作用以生成视黄醛蛋白的方法学

Methodology for Studying Interactions of Vitamin A Membrane Receptors and Opsin Protein with their Ligands in Generating the Retinylidene Protein

膳食维生素A/全反式视黄醇（ROL）在体内的分布对于维持外周组织中视黄醇类物质的功能以及生成视觉功能所需的视黄醛蛋白至关重要。RBP4-ROL 是视黄醇与视黄醇结合蛋白4（RBP4）在血液中形成的复合物。两种膜受体——肝脏中的视黄醇结合蛋白4受体2（RBPR2）和眼部的受视黄酸刺激基因6（STRA6）——可结合循环中的RBP4，该机制对于将ROL内化进入细胞至关重要。建立研究受体-配体动力学的方法，对于理解维生素A受体在视黄醇稳态中的生理功能具有重要意义。通过表面等离子共振（SPR）检测，我们可以分析维生素A膜受体与其生理配体RBP4之间的结合亲和力及动力学参数。
这些方法可以揭示RBP4在RBPR2和STRA6中结合基序的新结构和生化信息，这对于理解维生素A缺乏症的病理状态至关重要。在眼部，内化的ROL被代谢为11-cis视黄醛，这是一种视觉发色团，可与光感受器中的视蛋白结合形成视黄醛蛋白——视紫红质。光的吸收导致11-cis视黄醛发生cis到trans的异构化，从而诱导视紫红质的构象变化，并继而激活光转导级联反应。血清和眼部ROL浓度的降低会影响视黄醛蛋白的形成，进而导致视紫红质错位定位、脱辅基蛋白视蛋白积聚、夜盲症以及光感受器外节退化，最终引发色素性视网膜炎或莱伯先天性黑蒙症。
因此，定量分析视网膜中G蛋白偶联受体视蛋白-11-cis 视黄醛复合物的分光光度法在理解上述病理状态下视网膜细胞变性机制方面至关重要。通过这些全面的方法，研究人员将能够更好地评估膳食维生素A的供给在维持全身和眼部视黄醇稳态中的作用，这对于在感光细胞中生成和维持视黄酰基蛋白浓度至关重要，而后者又是维持人类视觉功能的关键。

定量方法用于研究维生素A膜受体及光感受器视蛋白与其相应生理配体之间的蛋白质-配体相互作用。重组小鼠RBP4应在 E. coli 纯化的蛋白用作表面等离子共振（SPR）芯片上的偶联配体。化学合成的RBPR2、STRA6以及突变体S294A RBPR2的“SYL基序RBP4相互作用胞外位点”（约40个氨基酸的肽段）作为分析物，在不同浓度下用于测定结合动力学及平衡饱和常数Kd 相互作用图1 和 图2). 
作为RBPR2和STRA6配体的重组RBP4蛋白，对这些肽段中的相互作用位点表现出结合亲和力，其Kd值分别约为22.38 µM和26.73 µM。氨基酸基序“SYL”在RBPR2和STRA6中均对稳定这些相互作用起关键作用；如预测所示，S294A突变肽的Kd值升高至约114.9 µM，表明需要更高数量的突变型RBPR2...

本文介绍了两种定量研究维生素A膜受体及光感受器视蛋白与其各自生理配体之间蛋白质-配体相互作用的方法。

研究维生素A膜受体与视蛋白与其配体相互作用以生成视黄醛蛋白的方法学

膳食维生素A/全反式视黄醇（ROL）在体内的分布对于维持外周组织中类视黄醇功能至关重要，并且……

我们的研究探讨了维生素A稳态的调控机制，重点研究视黄醇结合蛋白受体2（RBPR2）与其配体RBP4之间的生理相互作用，以及其在全身维生素A转运中的作用。我们还研究了11-顺式-视黄醛如何与视紫红质结合，这一过程对光信号转导和视觉功能至关重要。我们采用两种已知技术，建立肝脏受体介导的维生素A储存与分布之间的联系，并探讨中断该机制后导致致病性脂褐素积累，进而影响视觉健康的后果。本实验方案采用两种技术，重点关注肝脏与眼睛之间在维生素A转运过程中的远距离通讯。该方案使由饮食或遗传因素引起的疾病状况之间的关联更加明显且易于分析。血液血清蛋白及其相关因子可稳定视黄醇结合蛋白受体与其配体RBP4之间的相互作用。发现所有相关机制虽然复杂，但对于回答某些尚未探索的领域至关重要。未来，我们的研究重点将放在转化研究方案、研究人类患者样本中疾病表型的相关性，以及寻找疾病中维生素A受体的遗传变异。首先将纯化的msRBP4蛋白固定在传感器芯片上。为此，请进入“运行”菜单，选择向导，然后选择固定化选项。接下来，将配体用固定化缓冲液稀释至浓度为 10 微克/毫升，并将偶联试剂分装至小瓶中。现在，打开固定化设置向导窗口。选择 CM5 芯片并固定化流通池 2。然后将目标值设为 1,200 响应单位，以在动力学研究中获得 30 响应单位的 Rmax。选择乙醇胺作为洗涤溶液。输入名称 RBP4，然后点击下一步。在“架位”对话框中，点击弹出架位。取出架位。将含有指定体积各试剂的离心管放入，并插入装有样品管的架子。然后点击“确定”和“下一步”。最后，在“准备运行程序”对话框中点击“开始”，然后点击“保存”。为建立 RBPR2 和 STRA6 肽的动态分析实验，用运行缓冲液对小鼠 RBPR2、突变型 RBPR2 以及 STRA6 肽进行系列稀释。打开控制软件并选择动力学/亲和力向导程序。在进样序列对话框中，选择流路 2-1，将流路 2 设为活性通道，流路 1 设为参比通道。在“设置”对话框中，选中“运行启动循环”选项。将溶液输入为缓冲液，指定循环次数，然后点击“下一步”。接着，进入“进样参数”对话框，输入样品参数，如接触时间为 120 秒，流速为 30 微升/分钟，解离时间为 300 秒。对于再生参数，将再生溶液设置为盐酸甘氨酸，接触时间为30秒，流速为30微升/分钟。然后，单击“下一步”。在“样品”对话框中，输入肽的名称、分子量和浓度。然后，单击“下一步”。在“支架位置”对话框中，将稀释后的多肽分配为多个120微升的独立样品，浓度范围为1至100微摩尔，并放置到支架上指定的位置。单击“弹出支架”，然后插入所有小瓶。随后，单击“下一步”。然后，在“准备运行程序”对话框中，单击“开始”。输入文件名，然后单击“保存”。现在，在软件中点击“开始”菜单并选择“评估”。打开文件后，从下拉选择菜单中选择 FC 2-

methodology-for-studying-interactions-vitamin-membrane-receptors

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

研究维生素 A 膜受体和视蛋白与其配体在产生视黄基蛋白中的相互作用的方法

本文介绍了一种优化的制备高质量维生素A/视黄醇结合蛋白（RBP）复合物的技术，以及两种用于实时监测STRA6（RBP受体）介导的维生素A转运的实时监测技术。...

血浆视黄醇结合蛋白膜受体介导视黄醇转运的实时分析

本文描述了一种正相高效液相色谱法，用于检测和定量与视觉功能维持相关的关键类视黄醇物质，这些物质存在于眼组织和全身组织中，在全身维生素A供应的背景下，可生成必需的光敏视紫红质发色团11-cis-视黄醛。...

利用高效液相色谱法对小鼠眼部及非眼部组织中膳食维生素A代谢物进行定量分析

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

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一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文介绍了一种通用的脉冲-追踪方法的实验方案，可用于在活细胞中动态分析蛋白质的折叠、转运和降解过程。...

活细胞中蛋白质折叠、转运与降解的放射性脉冲追踪分析

转录因子（TF）与RNA聚合酶的相互作用通常通过下拉实验进行研究。我们采用生物层干涉技术（BLI）来表征GrgA与衣原体RNA聚合酶之间的相互作用。与下拉实验相比，BLI能够检测实时的结合与解离过程，具有更高的灵敏度，并且定量能力更强。...

应用生物层干涉技术（BLI）研究转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用

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本文提供了一种研究不同肽和蛋白质的天然形式、前纤维状结构及成熟淀粉样纤维与来自不同组织及脑区的分离线粒体之间相互作用的实验方案。...

淀粉样纤维与脑线粒体的相互作用及其对线粒体膜的通透化作用

微量热泳技术能够以较低的材料消耗快速获得结合常数。目前市面上有标记型和无标记型微量热泳技术可供选择；然而，无标记型热泳技术在相互作用检测的多样性方面不及使用荧光标记的技术。本文提供了一种基于标记型热泳的检测方案。...

使用微尺度热泳技术测量蛋白质-脂质相互作用

探索维生素A稳态调控机制，研究RBPR2与RBP4的生理相互作用及11-顺式视黄醛与视蛋白的结合过程。本方法利用定量技术揭示肝脏与眼睛之间的远距离通讯机制，为理解饮食和遗传因素导致的视觉疾病提供重要依据。

研究维生素A膜受体与视蛋白与其配体相互作用以生成视黄醛蛋白的方法学

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