高度分化且极化的视网膜色素上皮细胞培养物中耗氧率的长期监测

视网膜色素上皮（RPE）的退化是导致视力丧失的多种原因的基础。在许多情况下，RPE退化与线粒体功能障碍有关。我们可以通过检测氧消耗速率（OCR）来评估线粒体功能。

本文介绍了一种测量视网膜色素上皮（RPE）中耗氧率（OCR）的新方法。得益于多个实验室的研究工作，现已明确RPE需要线粒体活性来维持其健康与功能。目前的研究更加关注RPE优先利用哪些营养物质，以及在应激条件下这种偏好是否发生变化。

以往评估RPE中OCR的方法存在局限性。要么RPE处于非理想的培养条件下生长，要么无法进行长期的检测。因此，在能够维持体内特征的高保真培养体系中测量OCR是主要挑战之一。

本文介绍的用于监测OCR的方法使我们能够在多种实验条件下对RPE进行干预的同时，持续数周测量OCR。所有这些操作均在RPE处于理想培养条件下进行，使其能够模拟体内理想的RPE状态。Resipher是一种用于长期监测细胞（如视网膜色素上皮）耗氧量的新型装置。

与Seahorse分析仪等短期检测方法不同，Resipher可在标准条件下支持长期监测，能够在数周内进行详细的生物能量谱型分析，同时保持细胞健康状态。开始时，将传感盖置于空的96孔接收板上，并将其放入细胞培养孵育箱中。将设备对齐并安装到传感盖上，然后通过提供的USB线缆将其连接至集线器，形成Resipher三明治结构。

现在，访问 Lucid Lab 网站，点击右上角的“新建实验”按钮以创建新实验。为实验命名，并输入与研究相关的任何实验记录。接下来，创建孔板条件和处理组。

例如，若要检测培养基中不同血清浓度对氧消耗率的影响，请在组名中选择“血清”。输入将使用的培养基血清浓度，并通过点击加号按钮添加更多的血清百分比数值。然后指定哪些孔将加入特定的血清百分比，并为这些孔选择一种颜色模式。

根据需要点击“添加组”按钮以增加更多组。接下来，定义酶标板设置，并选择相应的设备和酶标板类型。为此，请点击“添加酶标板”按钮，选择设备，然后选定酶标板类型。

选择处理组，然后单击相应的孔。接着单击“立即开始”按钮以启动实验。请确认网站上的指示灯以及集线器上的发光二极管均为稳定的绿色。

让系统运行 15 至 60 分钟，以测试每个传感器是否校准良好并能检测大气中的氧气。随后，将设备从传感盖上取下，并将其倒置放入培养箱中，使设备上的电机复位。现在，将带有传感盖的培养板连同含有 RPE 细胞培养物的 96 孔板一起放回细胞培养操作台中。

将含有RPE细胞培养物的培养板中的培养基更换为相同类型和体积的培养基，以获取每个孔的基础氧消耗率数值。随后，将传感盖板转移至含有细胞培养物的培养板上，并将原培养板的普通盖板盖在空的96孔接收板上，以保持普通盖板的无菌状态。最后，将带有细胞培养物和传感盖板的培养板放回细胞培养箱中。

将设备与感应盖对齐并安装，并通过提供的 USB 线缆将其连接至集线器。检查网站界面和集线器上的指示灯是否均为稳定的绿色。让设备在每个孔中至少测量 12 至 24 小时的氧消耗率（OCR），以获取基础 OCR 值。

实验结束后，在细胞培养罩内将传感盖浸入70%乙醇中10分钟以进行消毒。待乙醇和水完全蒸发后，将传感盖放置于新的96孔接收板上。开始时，在罩内将传感盖与细胞培养板组装好，然后转移至低氧培养箱中。

在缺氧室中组装三明治结构。随后，在缺氧室中放置一个含有无菌水的培养皿，以帮助维持湿度。最后，将便携式氧气传感器放入缺氧室中。

然后密封缺氧室。确保 USB 线从缺氧室中引出，并使用腻子或硅脂密封电缆穿出的孔洞。将缺氧室连接至气体钢瓶，通入含低浓度氧气及标准细胞培养浓度二氧化碳的混合气体。

缓慢用气瓶中的1%氧气和5%二氧化碳气体置换缺氧 chamber 内的空气，直至氧气传感器显示达到所需的氧气浓度（通常为1%至10%）。随后关闭缺氧 chamber 的进气口和出气口阀门，将整个 chamber 转移至培养箱中。然后设置并开始实验。与大气氧浓度平衡的培养基在较大体积时需要更长时间才能达到平衡。

缺氧舱存在缓慢漏气现象，导致30小时后氧气浓度接近大气浓度。新鲜培养基与条件培养基之间的氧气溶解度相同，表明随着时间推移，培养基成分的变化并未影响氧气溶解度。为开始在标准细胞培养孵育箱中利用Resipher系统监测高度分化的RPE细胞培养物的氧气消耗速率（OCR）。

实验结束后，打开计算器以估算细胞单层处的氧浓度，并输入以微升为单位的培养基体积。输入气液界面处的饱和氧浓度。在通量输入框中，输入系统报告的通量或耗氧率（OCR）。

根据这些数值，可计算出培养液柱中每个高度的稳态氧浓度，并在图中显示。该图的 x 轴表示距孔底部上方的高度（单位：毫米）。y 轴表示在该高度处计算得到的氧浓度。

孔底部的氧气浓度在图表下方的行中报告。