Name: 长期监测高度分化和极化视网膜色素上皮培养物中的耗氧率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 了解如何使用Resipher设备长期监测视网膜色素上皮培养物的耗氧率。该方法可在理想培养条件下连续数周评估线粒体功能，为研究RPE退行性病变和视力丧失提供重要的生物能量学分析工具。

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我们感谢 Daniel Hass 博士和 Jim Hurley 博士提出测试 O 的想法2 新培养基与条件培养基中溶解度的对照实验。感谢Magali Saint-Geniez博士对本文稿提供的编辑意见。感谢Kellogg眼科中心仪器与电子服务核心实验室的Scott Szalay使用Resipher USB电缆对缺氧舱进行改装。HFT研究未使用任何联邦资金。电子服务核心实验室由美国国家眼科研究所P30 EY007003项目资助。本研究得到防盲研究组织（Research to Prevent Blindness, RPB）的无限制部门资助。J.M.L.M.获得干性年龄相关性黄斑变性James Grosfeld倡议项目、E. Matilda Ziegler盲人基金会、Eversight眼库资助、美国国家眼科研究所K08EY033420项目资助，以及Dee和Dickson Brown和David与Lisa Drews发现希望基金会的支持。D.Y.S.获得新南威尔士大学（UNSW）Scientia项目资助。L.A.K.获得Iraty奖、Monte J. Wallace、Michel Plantevin、美国国家眼科研究所R01EY027739项目资助以及美国国防部陆军医学研究获取活动VR220059项目的支持。

有关建立人原代或iPSC-RPE培养物的实验方案，请参见以下参考文献15,16,17,18。这些方案中人组织的获取和使用已通过密歇根大学机构审查委员会（HUM00105486）的审查并获准。
1. 该系统在RPE培养中的通用应用
<ol>
	<li>将人诱导多能干细胞（iPSC）来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞或原代人RPE细胞接种于与系统兼容的96孔板中。
	<ol>
		<li>假设已在24孔细胞培养板上培养成熟的细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，然后加入500 &#181;0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液材料表在细胞培养孵育箱中孵育10–40分钟，每5–10分钟检查一次，直至细胞变圆且几乎准备脱落。</li>
		<li>轻轻吹打培养基使细胞从细胞培养塑料表面脱落，随后转移至3倍体积的细胞培养基（1,500 &#181;升/24孔），在离心机中以250 × g离心沉淀 &#215; g 室温下持续5分钟。 
		注意：RPE细胞培养基的配方详见于 表1 以及在先前已发表的参考文献中可获取9,15,16,17,18.</li>
		<li>用含15%胎牛血清（FBS）的RPE细胞培养基重悬细胞，并用血细胞计数板计数细胞。</li>
		<li>每96孔板每孔接种74,000个细胞（通常为225–300 &#215; 105 细胞/平方厘米2），在使用高度特化的细胞外基质包被底物包被后（材料表按照制造商的说明进行操作。 
		注意：仅在与 Resipher 兼容的培养板上接种细胞（材料表）且仅限于与传感盖板上的探针阵列相对应的孔（32通道盖板为第3、4、9和10列；参见 材料表）。该系统的传感盖可配备4、32或96通道传感器（传感器位置见图示 图1A- D），且兼容多种标准细胞培养板。</li>
		<li>由于边缘孔容易发生蒸发，从而显著影响氧气供应及氧消耗率（OCR）的检测结果，因此应避免在所有边缘孔（96孔板的A行和H行）接种细胞。此外，加入200 &#181;在96孔板的每个空孔中加入L的无菌水，以减少蒸发效应。</li>
		<li>将培养板置于稳定的台面上静置10分钟，使细胞沉降，然后放回培养箱。24–72小时后更换培养基，替换为含5% FBS的标准RPE培养基。培养至少4周，每周更换培养基两次。 
		注意：&#160;细胞在呈现色素沉着、鹅卵石样形态且高度致密时，即可用于实验图1E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用系统进行设置与数据采集
	<ol>
		<li>将传感盖板置于空的96孔接收板上，然后将其放回细胞培养孵育箱中。将设备与传感盖板对齐并安装，并通过提供的USB线缆将其连接至集线器（Hub）。此装置即构成一个Resipher系统。 &#34;三明治&#34; (图2A).</li>
		<li>前往 Lucid 实验室网站&#160;应用（https://lab.lucidsci.com/）并点击&#160;新实验 右上角的按钮以创建新实验。</li>
		<li>命名 实验标题 并输入任何相关 实验注意事项 针对特定研究（例如，正在使用的iPSC-RPE的传代次数）。</li>
		<li>创建 良好培养条件 和 处理组例如，如果要检测培养基中不同血清浓度对OCR的影响，则应选择 血清 在 组名，然后输入将要使用的培养基血清浓度，通过点击添加更多血清百分比数值 + 按钮。指定哪些孔将接受特定的血清百分比，并为这些孔选择颜色模式。根据需要，通过点击添加更多组（例如，测试不同的实验变量） 添加组 按钮。</li>
		<li>定义 培养板设置 并选择相应的 设备 和 板型. 点击 添加培养板 按钮并选择 设备；选择 培养板类型. 选择 处理 并点击相应的孔。</li>
		<li>点击 立即开始 单击按钮以启动实验。请检查网站上的指示灯以及集线器上的LED灯是否正常工作。 实心绿色.</li>
		<li>让系统运行15至60分钟，以确保每个传感器均得到适当校准，并能准确检测大气中的氧气浓度，该浓度应约为200 &#181;在含5% CO₂的完全加湿细胞培养箱中2 (图2Bi). 
		注意：如果在标准细胞培养箱设置中，任何传感器的读数偏离其他传感器平均值超过20%，则应考虑在数据分析中排除该孔，因为该传感器&#160;有缺陷的图 2Bii). 
		注意：如果所有传感器的读数均偏离其他传感器平均值以及预期大气氧浓度超过20%，2 报告为 200 &#181;在标准细胞培养箱设置中，感应盖使用次数过多；应更换为新的感应盖（图 2Biii). 
		注意：获取 O2 实验开始前检测空气中的读数可显著提高后续故障排查的效率。若实验结束后发现某个孔的检测结果为异常值，而该孔的传感器存在校准偏差，则问题可能出在传感器本身，而非生物学重复样本。</li>
		<li>将设备从感应盖上取下（但不要拔下设备上的USB线缆）。将设备倒置放入培养箱中，以使设备上的电机复位。在电机声音完全停止前（约20-30秒），请勿重复使用该设备。 
		注意：实验过程中，即使设备未置于检测盖上，也必须始终通过 USB 线缆将其与集线器保持连接。这可使设备持续监测并报告细胞培养箱内的环境状况。</li>
		<li>将带有感应盖的培养板与一塊含有RPE细胞培养物的96孔板一同放回细胞培养操作台。用相同培养基和相同体积的培养基更换RPE培养板中各孔的培养液，以获取每个孔的基线OCR值。务必在所有不含RPE细胞的孔中加入无菌水，以帮助防止蒸发。 
		注意：通常情况下，我们建议 60-100 &#181;每96孔使用L型RPE培养基，依据数据显示，较低的培养基体积会导致营养物质迅速耗尽，而较高的体积则会引起意外的低氧状态9.</li>
		<li>将传感盖转移至含有细胞培养物的培养板中，同时将标准（非Resipher）盖转移至含有细胞培养物的空96孔接收板中，以保持标准盖的无菌状态，供实验过程中多个时间点使用。</li>
		<li>将细胞培养板和传感盖放回细胞培养箱中。再次对准设备并将其安装到传感盖上，并通过提供的USB线缆连接至集线器（组装 &#34;三明治&#34;）。检查网站界面和集线器上的所有指示灯是否均 实心绿色. 
		注意：O2 浓度数据将立即显示，而氧消耗率（OCR）数据需在积累足够的氧气2 数据收集已完成，约1小时。</li>
		<li>让设备对每个孔的OCR至少测量12-24小时，以获取基线OCR。 
		注意：基础氧消耗率（OCR）会因多种因素而异，包括施加于细胞的培养基类型。 图2C，含有不同浓度FBS（0%、5%、15%）的标准RPE培养基的OCR值略有差异。此外，FBS浓度较高的培养体系在培养基加入细胞后，能够维持更长时间的线粒体活性，之后才因线粒体代谢物耗尽而导致OCR下降（曲线右侧）。</li>
		<li>在获得基础 OCR 后，重复步骤 1.2.8–1.2.12，但将含有 RPE 培养物的培养板中的培养基更换为实验条件（通常， &#177; 一种药物或不同培养基条件的比较。 
		注意：常规的培养基更换也可采用相同方式进行。每次打开细胞培养箱时，都会对 OCR 读数造成显著干扰，因为 OCR 读数依赖于温度、湿度和 CO₂ 水平。2 浓度以及其他因素均会因打开培养箱门而暂时受到干扰。在将设备从感应盖上取下的任何过程中，无需在线暂停实验。当打开细胞培养箱门或更换被检测孔板的培养基后，通常需要2-4小时才能重新建立稳定的氧浓度梯度，并开始准确测量耗氧率（OCR）。</li>
		<li>在获得数据后，减去 基线 在实验条件施加后，通过测定各孔的氧消耗率（OCR），以确定其OCR变化 ΔOCR 由处理所引发。</li>
		<li>实验结束后，对传感盖进行灭菌并重复使用（可重复使用3-5次，但重复使用会导致性能下降）。灭菌时，将整个盖子浸入70%乙醇中，在细胞培养罩内放置10分钟，然后取出，置于柜中，探针面朝上（避免触碰 delicate 的探针尖端），待乙醇和水分完全蒸发后，再将传感盖放置于新的96孔接收板上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拍摄明场图像，以将氧消耗率（OCR）值归一化为细胞数量。 
	&#8203;注意：RPE 中的黑色素积累有助于基于明场显微镜下活体培养物的细胞数量简单计数来标准化氧消耗率（OCR）。
	<ol>
		<li>取下装置并将其倒置，如步骤1.2.8所述。在细胞培养操作台中，将RPE培养板上的传感盖替换为标准的96孔板盖。</li>
		<li>使用标准倒置显微镜，对每个孔进行明场成像。 
		注意：在不同孔之间保持成像区域的一致性（孔内的相对位置和物镜放大倍数）。</li>
		<li>在细胞培养超净台中，将RPE培养板的标准96孔板盖替换为感应板盖，然后放回培养箱中继续监测。</li>
		<li>使用 ImageJ 或其他软件对每个孔中的细胞数量进行计数。</li>
		<li>将不同实验组的氧消耗率（OCR）归一化至细胞数量。该系统以 fmol 为单位报告 OCR&#8729;（毫米）2)-1&#8729;s-1- 每单位横截面积的耗氧量。因此，为将OCR标准化至每细胞，需将OCR除以每平方毫米的细胞数量2 （而非每孔细胞数）。同样，可将系统报告的OCR值乘以孔的横截面积（约31 mm²）2 对于标准96孔板）以得到单位为fmol的OCR&#8729;s-1&#8729;良好-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定RPE生物能量参数的对照设置。 
	注意：为了确保该系统和RPE培养物对线粒体干预的反应具有可预测性，可以使用一些已明确靶向线粒体氧化磷酸化特定步骤的小分子进行验证。这些测试类似于使用Seahorse分析仪进行线粒体应激测试时所执行的步骤。10 并为RPE培养物提供生物能量学特征分析。
	<ol>
		<li>在65培养基中培养RPE细胞 &#181;在含5% FBS的标准RPE培养基中培养，并测量24小时OCR以建立基线。</li>
		<li>吸弃培养基，加入 65 &#181;含5% FBS 的标准 RPE 培养基与线粒体解偶联剂（3 &#181;M羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯腙 [FCCP] 或 500 nM Bam15， 材料表。在培养箱中孵育过夜。 
		注意：线粒体解偶联剂应显著增加耗氧率（OCR）。需确保增加后的OCR未达到或接近约275 fmol的理论最大扩散限制OCR值。&#8729;（毫米）2)-1&#8729;s-1 65 &#181;标准培养条件下培养基体积为 L。不同常用培养基体积对应的最大 OCR 值详见讨论部分。</li>
		<li>过夜孵育后，吸除含线粒体解偶联剂的培养基，并更换为 65 &#181;含5% FBS的标准RPE培养基1 L。继续观察培养板24小时，以确定去除药物后RPE氧耗率（OCR）的恢复情况。</li>
		<li>通过从处理前测得的氧消耗率（OCR）中减去处理后测得的OCR，计算解偶联剂对OCR的影响（图3). 
		注意：加入线粒体解偶联剂后OCR的增加表明细胞的线粒体呼吸储备能力19.</li>
		<li>为测量使用Seahorse分析仪进行线粒体应激测试时通常检测的其他线粒体参数，请按照上述相同步骤使用以下化合物：图4).
		<ol>
			<li>使用寡霉素，浓度为 1 &#181;M 用于评估与ATP合成相关的呼吸作用。</li>
			<li>使用抗霉素A和鱼藤酮，浓度均为1 &#181;M 用于评估非线粒体呼吸。 
			注意：FCCP、寡霉素、抗霉素A和鱼藤酮可能对RPE具有毒性。如果这些药物引起明显的细胞死亡，则氧消耗率（OCR）的测量结果将不准确。因此，仅应在无明显细胞死亡的时间点进行OCR测量，通常是在添加药物后的最初几小时内。图4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 测量经历上皮-间质转化的视网膜色素上皮细胞中线粒体代谢的变化
<ol>
	<li>按照第1.2节所述的相同方案进行操作。</li>
	<li>在获得基础OCR测量值后，向RPE培养物中添加TGF-β2（10 ng/mL）以诱导EMT，并持续监测OCR达3周。每2-3天更换含有新鲜TGF-β2的培养基（图5）。</li>
	<li>每周至少两次，按照第1.3节的方法获取明场图像，以确保细胞数量未发生变化。若细胞数量发生变化，需将每个孔的OCR值归一化至相应的细胞数。 
	注意：该相同方案也可用于其他EMT诱导剂，以在培养期间细胞处于培养箱中时，长期监测OCR的变化。</li>
</ol>
3. 测定缺氧RPE中线粒体代谢的变化
注意：在低氧、常氧或高氧条件下应用该系统的方法与第1.2节相同，只是需将“夹心”结构置于放置于标准细胞培养孵育箱中的低氧舱（材料表）内。
<ol>
	<li>在低氧培养箱的盖子上钻一个孔，用于穿过 USB-C 型电缆，并使用硅胶或填料进行密封（图6A).</li>
	<li>在生物安全柜中将传感盖与细胞培养板组装，然后转移至低氧舱内。</li>
	<li>设置 &#34;三明治&#34; （将培养板、传感盖和设备）放入缺氧室中。同时，在缺氧室内放置一个含有无菌水的培养皿，以帮助维持湿度。最后，放入便携式氧气浓度计2 低氧培养箱中的传感器（材料表。设置如图所示 图6A.</li>
	<li>密封腔室并将其连接至装有低氧浓度 O₂ 的气瓶2 和标准细胞培养中的CO₂浓度2 （例如，1% O₂）2 和 5% CO2).</li>
	<li>缓慢地用1% O₂气体置换缺氧 chamber 中的空气2/5% CO₂2 气缸中的空气，直至氧传感器显示 O2 所需浓度，通常介于1%至10%之间。 
	注意：便携式 O2 传感器需要时间达到平衡，因此应缓慢将气瓶中的气体加入低氧舱中。</li>
	<li>关闭低氧室的进气阀和出气阀，将整个低氧室转移至培养箱中。</li>
	<li>按照第1.2节中的步骤设置并启动实验。 
	注意：在将培养基加入细胞前，先在低氧舱中预平衡，可缩短细胞单层达到真正低氧状态所需的时间图6B).</li>
</ol>
4. 计算RPE单层细胞处的O2浓度，以确定细胞处于缺氧、常氧还是高氧条件
注意：默认情况下，该系统通过使用标准培养板及相应的单层细胞培养推荐感应盖，测量距培养孔底部约 1 至 1.5 mm 处的 O2 浓度（参见 https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf）。尽管该系统并未直接测量细胞单层处的 O2 浓度，但可利用系统数据估算 RPE 层面的 O2 浓度。具体而言，已知在培养基液柱顶部（O2 可获得）与底部（O2 被消耗）之间存在氧气浓度梯度，可将菲克扩散定律与测得的 OCR 速率结合，外推细胞单层处的 O2 水平。我们提供了一个在线计算器用于此类估算：&#160;https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion（同时以开源交互式笔记本形式提供，地址为 https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture，该计算器的源代码可在 https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator 获取）。
<ol>
	<li>计算器访问后，输入 微升为单位的培养基体积 （例如，100 &#181;L).</li>
	<li>输入气液界面处的饱和氧浓度（细胞上方培养基液柱的顶部）。该值约为185 &#181;M 在标准大气压和5% O₂条件下2 和 95% 湿度。 
	注意：这也可从 O 测得2 通过系统探针在仅含培养基的孔（孔底部无细胞）中进行的测量。</li>
	<li>在 流量输入，输入 通量/氧耗率 由系统报告。</li>
	<li>根据这些数值， 培养基中每一高度处的稳态氧浓度 柱状图中的数值已计算并显示在图表中（图7）。该 x轴 图的横轴是 孔底部上方的高度（单位：mm）。该 y轴 是 计算的 O₂2 该高度处的浓度 （在 &#181;M)</li>
	<li>O2 孔底部（细胞所在位置）的浓度在图线下方的行中报告。 
	注意：通常估计，RPE 在体内 观察到一个O2 浓度为 4-9%。每 10 &#181;氧的摩尔浓度2 在标准大气条件下相当于约 1% O₂2因此，细胞水平的常氧约为40-90 &#181;氧消耗率2. 培养基液柱越高，氧气浓度越低2 将位于视网膜色素上皮单层细胞的水平9因此，若细胞处于缺氧状态，可减少培养基体积；若细胞处于高氧状态，可增加培养基体积。</li>
</ol>

Novel OCR Monitoring System for Differentiated RPE Cultures

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<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
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Richard A. Bryan 和 Kin Lo 供职于 Lucid Scientific 公司，该公司生产 Resipher 系统。

视网膜色素上皮（RPE）的线粒体代谢在常见致盲性视网膜疾病（包括年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR））的发病机制中起关键作用。RPE线粒体代谢的建模研究 体外 可使其代谢状态与周围组织分离，同时以受控方式对组织施加不同的模拟疾病损伤。此类 体外 RPE 线粒体代谢的建模得益于高保真度的人原代和 iPSC-RPE 培养技术的发展，这些培养体系能够达到适当的分化状态和极性，从而更接近真实 RPE 的生理特性 体内.&#160;尽管监测此类培养物中的氧消耗率（OCR）是监控线粒体代谢的理想方法，但OCR监测所需的装置通常无法满足形成高度极化且完全分化视网膜色素上皮（RPE）所需的培养条件。本文中，我们介绍Resipher作为一种新型系统，可通过对高度分化且极化的RPE培养物进行实时、长期的OCR评估，来监测RPE线粒体代谢。
已有其他方法用于监测RPE中的耗氧率（OCR）。Seahorse XF分析仪旨在通过急性调控线粒体功能来短时间监测OCR。然而，Seahorse检测要求细胞培养在专用培养板上，而这种培养板不利于维持RPE的高极性和分化状态21。Calton、Vollrath及其同事改进了Seahorse方法，将生长于微孔支持膜上的高度分化的RPE培养物切割成小片后放入Seahorse检测板中进行评估。但该方法仍仅适用于短期终点检测，因为在检测过程中细胞无法接触CO2，检测只能在非无菌条件下进行，且切割微孔膜会导致支持膜边缘区域的细胞随时间推移发生死亡和功能障碍22。Barofuse是一种无泵灌注系统，可将生长在微孔支持膜上的RPE条带装入灌注系统中，从而实现实时监测OCR23。与Calton、Vollrath及其同事改进的Seahorse装置类似，Barofuse在评估RPE时的主要局限性也在于需要切割微孔支持膜，并且检测仍为短期终点式。Oxygraph同样设计用于检测代谢干预后OCR的快速动力学变化24。尽管尚未用于RPE培养物，但若将其用于评估高度极化和分化的RPE培养物，其局限性将与Seahorse和Barofuse相同。
与这些其他方法不同，本文所述的OCR系统能够在标准细胞培养条件下，使用标准RPE培养基，在标准细胞培养板/基质中培养RPE细胞的同时，实时监测OCR2 培养箱，可对高度分化且具有极性的视网膜色素上皮（RPE）培养物进行便捷、高效的检测。除了系统可实时获取细胞耗氧率（OCR）变化数据外，在OCR监测周期结束后，同一组细胞还可用于其他后续检测。这使得实验具有高度灵活性，可在数周内反复检测某种干预措施对OCR的影响（例如——RPE上皮-间质转化诱导过程中的 图5）或可测试干预措施长期恢复效果的场景（例如——线粒体解偶联后的恢复情况 图3）或可监测初始干预后级联代谢变化的情况（例如——当培养基中的营养物质耗尽后，血清对耗氧率（OCR）的影响 图2）。本文中的OCR系统特别适用于测量高度极化和分化的RPE培养细胞中的OCR。这类培养细胞在功能上为终末分化、无分裂能力，细胞排列紧密且色素沉着显著，这意味着每个孔中的细胞数量几乎相同。9，从而在大多数实验中无需将OCR归一化至细胞数量。即使在需要归一化至细胞数量的情况下，由于RPE细胞色素沉着较重且细胞边界清晰，可通过明场成像进行非侵入性的简单细胞计数来实现归一化。对于涉及未分化RPE及RPE增殖的实验，例如EMT实验 图5，将每孔的耗氧率（OCR）根据细胞数量进行标准化，是了解其真实情况的必要步骤 &#34;每细胞&#34; OCR 是。
在视网膜范围之外，该系统已被用于研究多种细胞类型的细胞呼吸和代谢活性，包括胰岛细胞25、骨骼肌26、卵巢癌27、心肌细胞28，甚至整个生物体，如C. elegans29。利用本文所述的OCR系统对OCR进行实时、长期监测，揭示了这些不同疾病模型中生物能量转换和线粒体功能障碍的关键机制。
Resipher 系统确实存在局限性。其测定耗氧率（OCR）的方法在本质上不同于 Seahorse 分析仪、BaroFuse 或 Oxygraph 系统。该方法需要建立一个氧气（O2）梯度以计算 OCR，而该梯度的建立可能需要数小时。因此，其他系统中可实现的快速动力学实验，在本系统中无法完成。此外，与其他系统不同，Resipher 没有用于快速递送小分子或收集代谢物的注射端口。相反，必须在细胞培养操作台中移除传感盖，手动加入药物或更换培养基，并手动收集待分析的代谢物。
为建立并排查本文所述OCR系统实验中的问题，建议采取以下措施。首先，尽量减少蒸发。请记住，O2 RPE单层上方培养基柱中的梯度高度依赖于该液柱的高度9，并且系统根据 O 计算 OCR2 梯度。因此，如果存在显著的&#160;由于实验过程中培养基液面因蒸发而降低，O2 梯度会发生变化，影响 OCR 读数。保持培养箱水盘充满水至关重要，同时建议在 96 孔板所有未使用的孔中也加入水。此外，由于板边缘孔的蒸发速率较高，因此在上述典型实验中，这些孔不接种细胞。OCR 系统上的湿度传感器可帮助监测培养箱内的湿度。在图 8A 中，实验过程中湿度的下降表明培养箱的水盘已无水。随着孔内蒸发加快，O2 孔中的浓度读数将逐渐升高并最终 &#34;直线（心电图无波动）&#34; 在大气氧浓度下2 浓度（约 200 µM）(图8A).
其次，确认 OCR 系统的&#34;sandwich&#34;结构已正确组装。设备底部和传感盖顶部的金属接触点应保持清洁，无任何阻碍充分接触的碎屑。设备与传感盖应平整、均匀地贴合在96孔板上，不得倾斜。连接设备与集线器的USB线缆不应受拉力，以免对&#34;sandwich&#34;结构产生扭矩，影响设备的正常运动。
第三，确保设备和感应盖传感器已校准。 图2B 详细介绍如何在每次实验开始时快速检查传感器功能是否正常。第四，在实验处理前，需确认某个特定孔未出现异常的耗氧率（OCR）值。在确认传感器正常工作后，测定所有细胞孔的基线OCR值，有助于判断某些孔中的细胞是否处于不健康状态。 图8B 显示多个孔正在进行基础OCR评估，其中蓝色孔明显表现出较低的OCR（因此，高O2 浓度）。该孔为异常值，应从实验操作中剔除。
第五，进行活跃的OCR读数时，尽量减少环境干扰。O2 梯度对温度、湿度和培养箱中 CO 的变化高度敏感2 水平和大气压。培养箱门的开启会显著影响这些因素，导致 OCR 读数出现暂时性干扰，直至培养基液柱的 O2 梯度恢复至平衡状态（图8C）。影响OCR的参数可在系统在线界面中进行监测 &#34;环境&#34; 标签图8A).
第六，确定实验所需的最适培养基体积。培养基体积不足可能导致过度蒸发（见上述第一个故障排除措施）或培养基中营养物质过早耗尽而产生假象，而培养基体积过大则会限制氧气2 RPE单层细胞的可利用性降低，引发缺氧9. 图7 是用于确定培养基体积对溶氧影响的在线计算器的截图2 RPE单层细胞处的浓度。特定培养基体积下可能达到的最大OCR显示在 图9A. 如果在特定实验中使用给定体积时的OCR速率接近图中所示速率 图9A，然后 O2 当RPE单层的氧浓度接近无氧状态（0%）时，需要使用较少的培养基体积。通常情况下，涉及RPE培养中线粒体高活性过程的实验，每96孔的培养基体积不应超过75 µL。
第七，进行适当的归一化处理，以分离实验干预对OCR的影响。由于不同孔的基线OCR可能存在差异，因此在实验干预前获取每孔的基线OCR读数至关重要。通过从实验干预后的OCR值中减去基线OCR值，获得净OCR变化值 &#34;Delta OCR&#34; 这展示了实验干预对OCR的影响。获取该结果的方法如下 &#34;Delta OCR&#34; 在……中得到展示 图3 和 图9B如果研究者关注一种实验干预对另一种实验干预诱导耗氧率（OCR）能力的影响，则需增加一个归一化步骤， &#34;Delta-Delta OCR&#34;，是必需的。此类示例如图所示。 图9B，其中棕榈酸盐（一种实验干预）诱导OCR增加（通过诱导β-氧化）的能力取决于RPE细胞培养所用的培养基类型（第二种实验干预）。
最后，尽量降低污染风险。该系统通过将氧气传感器置入细胞上方的培养基中来监测耗氧率（OCR），但这会增加感染风险。实验过程中若出现OCR意外下降，或实验开始时OCR值异常偏低，可能提示存在污染。需要在细胞培养显微镜下主动监测培养板是否发生污染。如果重复使用检测用盖子，可能引起96孔板之间的交叉污染。为尽量减少此类交叉污染，在完成实验后、将检测盖用于新实验之前，应将整个盖子浸入70%乙醇中20分钟以进行去污处理（参见操作规程第1.2.15节）。
总之，本文介绍了一种利用名为Resipher的新型系统，通过检测氧消耗率（OCR）对高保真度视网膜色素上皮（RPE）培养物中的线粒体代谢进行实时、长期监测的实验方案。该方法可广泛应用于高度极化和分化的RPE培养体系，特别适用于研究分离RPE的生理代谢特性，以及疾病或干预条件下RPE代谢的改变。 体外 视网膜疾病模型，包括年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）。

视网膜色素上皮（RPE）是一层功能上终末分化的、高度极化的上皮细胞，形成视网膜中光感受器与其血液供应——即脉络膜毛细血管床——之间的屏障。与胶质细胞支持神经元的作用类似，RPE 执行多种功能以支持光感受器，包括吞噬光感受器外节段、向光感受器转运营养物质并提供代谢支持，以及分泌维持视觉功能所必需的多种生长因子，这些功能对于维持正常视觉至关重要。
视网膜色素上皮（RPE）的退化是多种常见视觉退行性疾病的基础。在年龄相关性黄斑变性（AMD）中，RPE发生死亡，导致其上方的光感受器继发性退化；而AMD是全球范围内不可治愈性视力丧失最常见的原因之一。在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中，RPE则脱离其原本静止的终末分化状态，增殖并去分化为间充质样状态（即所谓的上皮-间充质转化[EMT]），同时伴随代谢改变。RPE的去分化不仅导致其对光感受器的支持功能丧失，还会诱发更显著的纤维化状态。这最终引起光感受器退化以及RPE介导的瘢痕形成，二者均导致视力丧失1,2。
视网膜色素上皮（RPE）对光感受器的支持作用在很大程度上是代谢性的，而代谢失调是包括年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）在内的多种视网膜疾病的关键因素。RPE在光感受器与其氧气和营养来源——脉络膜毛细血管之间起到调控屏障的作用。因此，RPE选择自身代谢的物质，以及选择从脉络膜毛细血管传递给光感受器的物质，极大地决定了光感受器的代谢活动和存活状态。大量研究表明，RPE的正常功能高度依赖线粒体代谢，而光感受器则主要依赖糖酵解3。这引出了光感受器与RPE之间存在互补且相互交织的代谢状态的概念。具体而言，RPE会减少对光感受器优先利用的代谢底物的消耗，转而利用光感受器代谢产生的副产物以及光感受器未消耗的代谢物。在PVR和AMD等疾病中，有强有力证据表明RPE变得更加依赖糖酵解，而对线粒体代谢的依赖性降低；这种向糖酵解的转变可能导致光感受器缺乏所需的代谢物，从而引发退行性变4,5,6。鉴于RPE与光感受器代谢之间的高度相互依赖性，以及代谢改变在视网膜疾病中的重要作用，目前人们高度关注通过建模和调控RPE代谢来实现治疗目的。
尽管在活体（in vivo）条件下研究视网膜色素上皮（RPE）线粒体代谢是最理想的，但许多RPE线粒体代谢方面的研究实际上只能在体外（in vitro）培养系统中进行。在过去几十年中，高保真度RPE培养技术已取得显著进展，目前最优化的RPE培养体系已被用于人类临床试验中的细胞替代治疗7。为了维持这种高保真度的培养状态，RPE细胞需要在特定的培养基和特定的基质上生长数月，才能进行后续实验。在这些条件下，RPE培养细胞达到最大程度的分化和极化状态，接近活体（in vivo）中的RPE特性。然而，目前尚无任何设备能够专门在活体（in vivo）中直接测量RPE的线粒体代谢。尽管已利用电子顺磁共振（EPR）测氧技术实现了对视网膜毛细血管网络的活体（in vivo）氧监测8，但该方法无法用于RPE的分析。RPE在活体（in vivo）与体外（in vitro）条件下的代谢差异尚未被充分描述，但已有研究表明，RPE培养细胞具有较高的线粒体活性，与活体（in vivo）RPE相似3,9，提示利用高保真度RPE培养体系可深入揭示RPE线粒体代谢的特征。
由于所有线粒体代谢均会导致氧气消耗，因此测量视网膜色素上皮（RPE）的氧消耗率（OCR）可作为线粒体代谢的可靠指标。然而，在RPE培养体系中测量OCR一直存在困难，因为促进RPE最大程度极化和分化的培养条件，往往与现有技术（如Seahorse分析仪）所要求的长期精确OCR测量条件相冲突。在本方法学论文中，我们介绍了一种新型装置，称为Resipher（下文简称&#34;该系统&#34;），该系统能够在促进RPE最大程度极化和分化的培养条件下，连续数周对OCR进行实时监测。在现有OCR测量设备中，该系统首次实现了在最大程度促进RPE分化与极化的培养条件下便捷地进行OCR测量。
本文提供了将该系统用于视网膜色素上皮（RPE）培养的操作技巧，并随后展示了两个具体应用实例。首先，通过暴露于转化生长因子-β（TGFβ）诱导RPE上皮-间质转化（EMT），以模拟增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）。1,10,11,12该系统用于监测视网膜色素上皮（RPE）代谢在上皮-间质转化（EMT）过程中的演变。其次，利用该系统探讨缺氧在RPE代谢中的作用。缺氧是年龄相关性黄斑变性（AMD）发病机制中的重要因素，因为脉络膜毛细血管丛随年龄增长而变薄13,14将该系统与缺氧培养舱结合，可模拟伴随衰老过程的轻度缺氧状态下视网膜色素上皮（RPE）线粒体代谢的改变。最后，本文介绍了一种基于Resipher数据的在线计算器，可用于判断RPE细胞培养处于缺氧、常氧还是高氧环境。此类信息对于从RPE代谢研究中得出任何结论至关重要 体外 视网膜色素上皮细胞培养研究

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32通道 Resipher 盖</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A for Falcon</td><td></td></tr><tr><td>链霉菌来源的抗霉素 A</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>电子传递链复合体 III 抑制剂</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>解偶联剂，用于增强线粒体呼吸</td></tr><tr><td>DMSO，细胞培养级</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>线粒体药物重悬用溶剂</td></tr><tr><td>细胞外基质包被基质：&lt;br/&gt; Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>人源视网膜色素上皮细胞（hfRPE）用细胞外基质</td></tr><tr><td>细胞外基质包被基质：玻连蛋白</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>诱导多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（iPSC-RPE）用细胞外基质</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td>解偶联剂，用于增强线粒体呼吸</td></tr><tr><td>胎牛血清（Bio-Techne S11550H）</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松-环糊精</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>低氧培养箱</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 培养基添加剂</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>O₂ 传感器</td><td>Sensit technology 或 Forensics Detectors</td><td>P100 或 FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TGF&amp;beta;2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>转化生长因子 β-2，用于诱导上皮-间质转化</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>电子传递链复合体 I 抑制剂</td></tr><tr><td>系统兼容性培养板</td><td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM（Eagle 培养基的 α 改良型）</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

高度分化且极化的视网膜色素上皮细胞培养物中耗氧率的长期监测

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

线粒体代谢对视网膜色素上皮（RPE）的正常功能至关重要，RPE 是视网膜中一层单层细胞，对光感受器的存活具有重要作用。RPE 线粒体功能障碍是年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的典型特征，其中 AMD 是发达国家不可逆失明的首要原因，而 PVR 是视网膜脱离的一种致盲性并发症。RPE 退行性疾病已可通过高度分化且具有极性的 RPE 培养系统进行良好建模，以模拟体内（in vivo）RPE 的状态。然而，在此类培养系统中监测氧消耗率（OCR）——即线粒体功能的间接指标——一直存在困难，因为促进 RPE 理想极化和分化的培养条件不利于 OCR 的便捷测量。
本文介绍了一种新型系统Resipher，该系统可在标准细胞培养箱中，于最佳生长基质和生理培养基条件下，对高度分化的视网膜色素上皮（RPE）细胞进行长达数周的氧消耗率（OCR）监测。该系统通过测量细胞上方培养基中的氧浓度梯度来计算OCR。我们讨论了该系统相较于其他OCR检测方法的优势，以及如何在RPE培养中建立该系统的测量流程。同时，本文涵盖了使用该系统的关键技巧与注意事项，对数据解读的警示，以及针对异常结果的故障排除指南。
我们还提供一个在线计算器，可根据系统检测到的细胞培养基上方的氧气梯度，推算出RPE细胞培养所经历的缺氧、常氧或高氧水平。最后，我们回顾了该系统的两个应用：一是在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）模型中测量RPE细胞的代谢状态，二是研究RPE细胞在代谢上如何适应缺氧环境。我们预期，将该系统应用于高度极化和分化的RPE细胞培养，将有助于加深对RPE线粒体代谢在生理和疾病状态下的理解。

我们介绍一种用于测量视网膜色素上皮（RPE）细胞培养中耗氧率（OCR）的新型装置。该装置可在标准细胞培养板上使用标准培养基，在标准细胞培养箱中连续数周对RPE细胞进行OCR测量。

线粒体代谢对视网膜色素上皮（RPE）的正常功能至关重要，RPE 是视网膜中一层单层细胞，在……中具有重要作用

视网膜色素上皮（RPE）的退化是导致视力丧失的多种原因的基础。在许多情况下，RPE退化与线粒体功能障碍有关。我们可以通过检测氧消耗速率（OCR）来评估线粒体功能。本文介绍了一种测量视网膜色素上皮（RPE）中耗氧率（OCR）的新方法。得益于多个实验室的研究工作，现已明确RPE需要线粒体活性来维持其健康与功能。目前的研究更加关注RPE优先利用哪些营养物质，以及在应激条件下这种偏好是否发生变化。以往评估RPE中OCR的方法存在局限性。要么RPE处于非理想的培养条件下生长，要么无法进行长期的检测。因此，在能够维持体内特征的高保真培养体系中测量OCR是主要挑战之一。本文介绍的用于监测OCR的方法使我们能够在多种实验条件下对RPE进行干预的同时，持续数周测量OCR。所有这些操作均在RPE处于理想培养条件下进行，使其能够模拟体内理想的RPE状态。Resipher是一种用于长期监测细胞（如视网膜色素上皮）耗氧量的新型装置。与Seahorse分析仪等短期检测方法不同，Resipher可在标准条件下支持长期监测，能够在数周内进行详细的生物能量谱型分析，同时保持细胞健康状态。开始时，将传感盖置于空的96孔接收板上，并将其放入细胞培养孵育箱中。将设备对齐并安装到传感盖上，然后通过提供的USB线缆将其连接至集线器，形成Resipher三明治结构。现在，访问 Lucid Lab 网站，点击右上角的“新建实验”按钮以创建新实验。为实验命名，并输入与研究相关的任何实验记录。接下来，创建孔板条件和处理组。例如，若要检测培养基中不同血清浓度对氧消耗率的影响，请在组名中选择“血清”。输入将使用的培养基血清浓度，并通过点击加号按钮添加更多的血清百分比数值。然后指定哪些孔将加入特定的血清百分比，并为这些孔选择一种颜色模式。根据需要点击“添加组”按钮以增加更多组。接下来，定义酶标板设置，并选择相应的设备和酶标板类型。为此，请点击“添加酶标板”按钮，选择设备，然后选定酶标板类型。选择处理组，然后单击相应的孔。接着单击“立即开始”按钮以启动实验。请确认网站上的指示灯以及集线器上的发光二极管均为稳定的绿色。让系统运行 15 至 60 分钟，以测试每个传感器是否校准良好并能检测大气中的氧气。随后，将设备从传感盖上取下，并将其倒置放入培养箱中，使设备上的电机复位。现在，将带有传感盖的培养板连同含有 RPE 细胞培养物的 96 孔板一起放回细胞培养操作台中。将含有RPE细胞培养物的培养板中的培养基更换为相同类型和体积的培养基，以获取每个孔的基础氧消耗率数值。随后，将传感盖板转移至含有细胞培养物的培养板上，并将原培养板的普通盖板盖在空的96孔接收板上，以保持普通盖板的无菌状态。最后，将带有细胞培养物和传感盖板的培养板放回细胞培养箱中。将设备与感应盖对齐并安装，并通过提供的 USB 线缆将其连接至集线器。检查网站界面和集线器上的指示灯是否均为稳定的绿色。让设备在每个孔中至少测量 12 至 24 小时的氧消耗率（OCR），以获取基础 OCR 值。实验结束后，在细胞培养罩内将传感盖浸入70%乙醇中10分钟以进行消毒。待乙醇和水完全蒸发后，将传感盖放置于新的96孔接收板上。开始时，在罩内将传感盖与细胞培养板组装好，然后转移至低氧培养箱中。在缺氧室中组装三明治结构。随后，在缺氧室中放置一个含有无菌水的培养皿，以帮助维持湿度。最后，将便携式氧气传感器放入缺氧室中。然后密封缺氧室。确保 USB 线从缺氧室中引出，并使用腻子或硅脂密封电缆穿出的孔洞。将缺氧室连接至气体钢瓶，通入含低浓度氧气及标准细胞培养浓度二氧化碳的混合气体。缓慢用气瓶中的1%氧气和5%二氧化碳气体置换缺氧 chamber 内的空气，直至氧气传感器显示达到所需的氧气浓度（通常为1%至10%）。随后关闭缺氧 chamber 的进气口和出气口阀门，将整个 chamber 转移至培养箱中。然后设置并开始实验。与大气氧浓度平衡的培养基在较大体积时需要更长时间才能达到平衡。缺氧舱存在缓慢漏气现象，导致30小时后氧气浓度接近大气浓度。新鲜培养基与条件培养基之间的氧气溶解度相同，表明随着时间推移，培养基成分的变化并未影响氧气溶解度。为开始在标准细胞培养孵育箱中利用Resipher系统监测高度分化的RPE细胞培养物的氧气消耗速率（OCR）。实验结束后，打开计算器以估算细胞单层处的氧浓度，并输入以微升为单位的培养基体积。输入气液界面处的饱和氧浓度。在通量输入框中，输入系统报告的通量或耗氧率（OCR）。根据这些数值，可计算出培养液柱中每个高度的稳态氧浓度，并在图中显示。该图的 x 轴表示距孔底部上方的高度（单位：毫米）。y 轴表示在该高度处计算得到的氧浓度。孔底部的氧气浓度在图表下方的行中报告。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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了解如何使用Resipher设备长期监测视网膜色素上皮培养物的耗氧率。该方法可在理想培养条件下连续数周评估线粒体功能，为研究RPE退行性病变和视力丧失提供重要的生物能量学分析工具。

高度分化且极化的视网膜色素上皮细胞培养物中耗氧率的长期监测

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