通过检测人纯化血小板磷脂酰丝氨酸暴露及微囊泡释放表征促凝血血小板

血小板促凝物质的形成对于维持止血至关重要。该过程涉及血小板表面磷脂的表达和微囊泡的释放，这对凝血过程至关重要。对这一过程的评估为血小板促凝反应在多种人类疾病中的作用提供了新的数据。

流式细胞术已成为评估血小板和微囊泡中磷脂酰丝氨酸表达的基石技术，并已获得广泛认可。从血液中分离和分析纯化血小板耗时较长，且需要专业的实验室设备，因此目前尚无法用于常规临床诊断。由于微囊泡体积微小，且目标标志物的阳性事件数量较少，分析磷脂酰丝氨酸暴露和微囊泡释放也具有挑战性。

首先，使用含有枸橼酸钠、柠檬酸和右旋葡萄糖抗凝剂的采血管采集外周静脉血。轻轻颠倒混匀采血管，使血液与抗凝剂充分混合，并在室温下静置15分钟。使用自动细胞计数仪计数血小板，以确定离心所需的正确转速。

为制备富血小板血浆，将血液在室温下以250 g离心10分钟，离心时不得使用刹车。然后向9毫升富血小板血浆中加入1毫升ACDA和6.25 µL阿皮拉司（apyrase）。将混合物在室温下以1,100 g离心10分钟。

使用 Pasture 移液管移除含有贫血小板血浆的上清液，并将小板沉淀物轻轻重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中。然后向离心管中加入 3 至 4 毫升洗涤缓冲液，再次离心。移除上清液后，将沉淀物重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中。

将150微升血小板悬液转移至1.5毫升离心管中，用于在自动细胞计数仪中进行细胞计数。向剩余的悬液中加入3至4毫升洗涤缓冲液，按照之前展示的方法进行一次额外洗涤。接着，用反应缓冲液重悬血小板沉淀，使最终浓度达到每升5 × 10¹¹个血小板。

首先，获取用于流式细胞术的经洗涤血小板，并将其悬浮于所需缓冲液中。将所有激动剂和荧光染料用反应缓冲液配制。进行细胞内检测时，向不同的处理管中各加入100 µL洗涤后的血小板，其浓度为50 × 10⁹ 个血小板/升。

轻轻振荡每个等分试样，在 37 °C 下孵育 5 分钟。然后向每个微量离心管中加入 5 µL 未稀释的 Annexin V-FITC 并进行孵育。随后，向每根试管中加入 500 µL 反应缓冲液以终止反应过程。

使用前向散射（FSC）圈定血小板群体，并利用密度图独立识别各个群体。将阴性对照阈值设定在静息状态血小板群体最右侧。激活后，将位于此阈值右侧的事件归类为暴露磷脂酰丝氨酸的血小板。

对于微囊泡的区分，将阈值设定为静息血小板群体中观察到的最低前向散射光（FSC）值。激活后，将低于此阈值且磷脂酰丝氨酸呈阳性的事件归类为微囊泡。基线测量表明，未激活的血小板中表现出磷脂酰丝氨酸暴露的比例低于2.9%。

激活后，血小板中磷脂酰丝氨酸阳性的比例在胶原作用下为26.7%，凝血酶作用下为9.1%，胶原与凝血酶共同作用下为36.2%。离子载体处理导致49.6%的血小板呈磷脂酰丝氨酸阳性。微囊泡的基础比例为0.3%；仅在胶原和凝血酶共同作用时观察到显著增加，约为11.4%，而离子载体处理时更显著升高至44%。