在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

我们的研究重点是通过在受限几何空间中溶剂与非溶剂流的湍流混合来理解纳米颗粒的形成过程。受限条件下的湍流混合能够在连续流动条件下实现脂质纳米颗粒的可重复制备，其规模范围从实验室级别的每分钟数百微升到工业级别的每分钟数十升。脂质纳米颗粒通常采用微流控装置或移液器混合方法制备。

这些微流控装置在类似毛细管的通道中混合乙醇溶剂和水相抗溶剂液流。然而，由于通道尺寸小且流速低，雷诺数较低，导致产生层流混合。而移液混合则是通过将溶剂液流直接注入抗溶剂浴中来生成脂质纳米颗粒（LNPs）。

目前制备脂质纳米颗粒的方法存在可扩展性差和重复性不佳的问题。例如，移液器混合法由于依赖非封闭的手动混合，其操作本身具有较大的变异性。虽然微流控装置在一定程度上解决了这些问题，但其运行流速极低，且由于脂质RNA在通道壁上的沉积，容易发生污染和堵塞。

这些问题凸显了在从实验室到临床规模的各个阶段，都需要具备可重复且高通量的技术。本方案展示了通过跨不同批次规模的湍流混合，实现脂质纳米颗粒可重复且可放大的制备方法。研究人员可先在小规模上自信地开展LNP制剂的筛选或优化，再制备更大批次的材料用于后续试验。

湍流混合可确保纳米颗粒的一致性，且不受批次大小的影响。受限几何结构的湍流混合器解决了现有脂质纳米颗粒制备技术的主要问题。利用湍流条件可实现更快的分子尺度混合，从而能够将不同大小的寡核苷酸整合到LNP核心中。

CIJ混合器还可消除脂质在混合器壁上沉积所引起的污染问题。在相同雷诺数下的湍流具有自相似的柯尔莫哥洛夫尺度涡流，从而实现一致的混合效果。受限撞击射流混合器将两个高雷诺数的流体流在较大的混合腔室内对向引导，以实现混合。

每个射流的线性动量在形成微米级湍流涡旋的过程中被耗散，从而导致溶剂与反溶剂流的快速且均匀混合。开始制备脂质纳米颗粒时，用乙醇填充两支5毫升注射器，并将每支注射器固定到受限撞击射流（或称CIJ）混合器的入口端口。快速推动注射器活塞，将混合器流出的液体作为废液收集。

从CIJ中移除乙醇冲洗用的注射器。通过进样适配器吹入干燥的氮气流，以干燥CIJ的内部通道。在1.5毫升微量离心管中混合脂质储备溶液，并用乙醇稀释。

将100毫摩尔/升 pH 4的乙酸盐缓冲液母液稀释至10毫摩尔/升，总体积为4毫升。为制备抗溶剂流，将RNA与乙酸盐缓冲液在1.5毫升离心管中混合。在1毫升注射器中准备500微升溶液。

将注射器倒置，排出水相反溶剂流中的任何空气。同样，用一个一毫升的注射器收集500微升脂质溶液。然后，将注射器倒置，排出乙醇溶剂流中的空气。

将洁净的CIJ混合器置于淬灭浴小瓶上方。将两支注射器连接至CIJ混合器的进样口。快速推动两支注射器，使溶剂与反溶剂流混合，并在淬灭浴中收集脂质纳米颗粒。

将CIJ混合器从淬灭浴中取出，此时注射器仍连接在上面。将CIJ混合器置于废液容器上方，取下注射器，使残留的滞留体积液体流入废液容器中。随后，盖上装有脂质纳米颗粒分散液的淬灭浴瓶，并轻轻摇晃小瓶。

多入口涡流混合器将流体沿切线方向注入混合腔，形成在旋转涡流中层状排列的流层。混合腔内的高雷诺数可产生微米尺度的湍流涡旋，这些涡旋迅速混合各层流层，其原理类似于连续流动撞击混合器（CIJ混合器）内部的湍流涡旋。开始组装微型多入口涡流混合器（MIVM）时，需在工作平台上准备好所需的底部接收器、混合结构圆盘、顶部圆盘、O型圈以及扳手。

将O形圈嵌入混匀圆盘的凹槽中。将混匀圆盘上的孔与顶盘上的定位销对齐，轻轻压合，确保O形圈不脱落。将已配合好的混匀圆盘、O形圈与顶盘组件松松地拧入底部接收器中。

然后，使用扳手将顶部圆盘拧紧到底部接收器中。将出口管路接头插入并拧紧到底部接收器中，以完成MIVM的组装。将组装好的MIVM安装到混合支架上，使出口管路从支撑板中穿出。

接下来，按所需配比配制溶剂和反溶剂溶液。将30毫升溶液装入气密式注射器中。将注射器和管路倒置，排出其中的任何空气。

在末端安装带有鲁尔接头的聚四氟乙烯管。将注射器安装到注射泵中，并将其连接至MIVM上的混合器入口。将100毫摩尔/升pH 4的乙酸盐缓冲液原液稀释至10毫摩尔/升，总体积为320毫升。

在注射泵上，将体积流速设置为 20 毫升每分钟。启动注射泵，使前 10 秒的流出液流入废液烧杯中。10 秒后，将 MIVM 流出液收集至淬灭浴中。

现在，取下并盖紧装有脂质纳米颗粒分散液的淬灭浴。每次实验之间，通过冲洗至少两倍于出口管路体积的液体来清洁MIVM。将混合器从支架上取下时，保持注射器连接，将其置于废液容器上方。

取下注射器，使残留液体流入容器中。然后将混合器组件倒置，使用扳手将其拆开。用乙醇冲洗出口管路和混合结构，并用气流或氮气吹干各部件。

然后，用去离子水冲洗O形圈，并用吸水纸吸干。使用空气流或氮气流干燥表面之前，先用乙醇彻底冲洗顶部圆盘和注射器。