Name: 在受限冲击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 了解受限冲击射流混合器合成脂质纳米颗粒的方法，该方法利用湍流微混合环境实现可重复的单分散纳米颗粒制备。该技术解决了传统微流控设备混合效率低和易污染的问题，适用于从实验室到工业规模的药物递送系统开发。

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BKW 获得美国国家科学基金会（NSF）奖学金（DGA1148900）、Tessera Therapeutics 公司的支持、比尔及梅琳达·盖茨基金会（BMGF，合同编号：OPP1150755 和 INV-041182）以及美国食品药品监督管理局（FDA）资助项目（编号：75F40122C00186）的资助。

本研究中所用试剂和设备的详细信息列在材料表中。
1. 缓冲液、溶剂和抗溶剂流的制备
<ol>
	<li>将所有脂质组分按所示质量浓度溶解于乙醇中，如图所示 表1，以制备patisiran LNP制剂10使用前将溶液加热至 37 °C 通过温和超声处理，重新溶解任何已沉淀的固体。 
	注意：可制备数毫升的较大体积储备液，并储存于 4 °C.</li>
	<li>配制100 mM、pH 4的醋酸盐缓冲液储备液：将186 mg醋酸钠和464 mg乙酸溶于80 mL无核酸酶水中。根据需要使用浓盐酸或氢氧化钠调节pH，并加水定容至100 mL。</li>
	<li>配制1 M、pH 7.5的HEPES缓冲液母液：将23.82 g HEPES盐溶解于80 mL无核酸酶水中，根据需要使用浓HCl或NaOH调节pH，最后定容至100 mL。</li>
	<li>将目标核酸聚合物和100 mM乙酸盐缓冲液储备液用无核酸酶水稀释，以制备 300 µg/mL 30 mM 乙酸盐缓冲液中的 RNA 溶液。根据设计的实验准备足量的工作溶液，本方案需要 1500 µL CIJ 和 MIVM 混合器的总量。 
	注意：供应商提供的 RNA 通常已溶于适当的缓冲液中，浓度一般为 10 mg/mL（酵母 RNA）或 1 mg/mL（编码荧光素酶的 mRNA，LucRNA，或编码绿色荧光蛋白的 mRNA，GFP-RNA）。酵母 RNA 可作为沉淀实验中的低成本模型 RNA 使用。</li>
</ol>
2. 使用双射流CIJ混合器配制LNPs
<ol>
	<li>仪器准备与清洗
	<ol>
		<li>使用前立即用乙醇冲洗CIJ混合器进行清洗。将两个5 mL注射器装满乙醇，并分别锁入CIJ的两个入口端口。快速推动注射器活塞，将混合器流出液作为废液收集。 
		注意：CIJ混合器的构建和操作可参照先前所述方法29。可使用多种支撑架固定CIJ混合器，包括铁架台、离心管架或锥形瓶。CIJ供应商列于材料表和补充文件1中。</li>
		<li>从CIJ上取下用于乙醇冲洗的注射器。这些注射器可储存并重复用于后续CIJ的乙醇冲洗。</li>
		<li>通过向入口接头通入干燥氮气流，吹干CIJ的内部通道。若无氮气，可使用干燥且经过滤的空气，但必须确保不被泵油雾或气溶胶污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶剂与反溶剂流的准备
	<ol>
		<li>混合脂质储备液，并用额外的乙醇稀释，在1.5 mL微量离心管中制备总量为500 µL、浓度为6 mg/mL的脂质溶液，具体组成见表1。 
		注意：该配方为常用的Onpattro组分，包含50 mol% MC3、10 mol% DSPC、38.5 mol%胆固醇和1.5 mol% DMG-PEG2000。</li>
		<li>将100 mM pH 4的乙酸盐缓冲液储备液稀释至10 mM，总体积为4 mL，作为CIJ混合器流出液的淬灭浴。 
		注意：可在淬灭浴中加入磁力搅拌子以辅助混合。</li>
		<li>用1 mL注射器抽取在步骤1.4中制备的500 µL RNA溶液。将注射器倒置，排出含有核酸聚合物的水相反溶剂流中的任何空气。</li>
		<li>用1 mL注射器抽取在步骤2.2.1中制备的500 µL脂质溶液。将注射器倒置，排出含有脂质的乙醇溶剂流中的任何空气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在CIJ混合器中制备LNP
	<ol>
		<li>将清洁的CIJ混合器置于淬灭浴小瓶上方。 
		注意：可使用铁架台夹具或试管架作为CIJ混合器的支撑。典型的CIJ装置参见图1A。</li>
		<li>将步骤2.2.3和步骤2.2.4中装填好的两个注射器连接至CIJ混合器的入口端口。</li>
		<li>快速推动两个注射器，使溶剂与反溶剂流混合，并在淬灭浴中收集脂质纳米颗粒（LNP）。 
		注意：推动注射器时必须迅速（小于1秒），同时保持平稳和均匀。流动不对称或过慢会导致生成多分散性高、粒径较大的LNP。</li>
		<li>保持注射器连接状态，将CIJ混合器从淬灭浴上方移开。 
		注意：切勿取下注射器或让滞留体积的液体流入淬灭浴，因为这部分物料混合不充分，若混入淬灭浴将对最终分散体系的性质产生不利影响。</li>
		<li>将CIJ混合器移至废液容器上方，取下注射器，使残余的滞留体积流入废液容器。处理掉这些注射器，并按照第2.1节所述重复清洗过程。</li>
		<li>按照下文第5节所述方法分析CIJ制备的LNP。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
使用四射流 MIVM 混合器配制脂质纳米颗粒（LNPs）
<ol>
	<li>组装一种被称为微型MIVM的MIVM混合器，µMIVM以区别于用于放大生产的较大型模型
	<ol>
		<li>收集组装MIVM混合器所需的全部单独组件：底座接收器、混合几何圆盘、顶部圆盘、O型圈和扳手。 
		注意：MIVM 的构建、组装和操作此前已用于疏水性物质的包封，相关供应商列于 补充文件 1 以及 材料表29参见 图2 有关组件和搅拌器支架术语的示意图。</li>
		<li>将O形圈嵌入混合盘的凹槽中。</li>
		<li>将混匀盘上的孔与顶盘上的销钉对齐，然后将其推合，注意不要使O形圈移位。</li>
		<li>将配对好的混合盘、O型圈和上盘组件松松地拧入底部接收器中。 
		注意：在此步骤之前，需将出口管路从底部接收器上拆除。</li>
		<li>使用扳手将顶部圆盘拧紧到底部接收器中。 
		注意：若观察到螺纹咬合现象，可在顶部圆盘的螺纹处涂抹食品级或制药级防咬合剂。</li>
		<li>将出口管路接头插入底部接收器并拧紧，以完成MIVM的组装。</li>
		<li>将组装好的MIVM安装到混合架上，使出口管路穿过支撑板。 
		注意：应定期执行调整MIVM混合器支架的程序，以确保混合器支架上的机械限位装置配置正确29.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶剂与反溶剂流的制备
	<ol>
		<li>将两种乙醇脂质溶剂流溶液按照所述加入1.5 mL微量离心管中混合，如 表2通过稀释脂质储备液，并根据需要添加额外的乙醇，使最终脂质浓度达到6 mg/mL。 
		注意：此脂质溶液的组成与2.2.1节相同，但总体积不同 1000 µL.</li>
		<li>将100 mM pH 4的乙酸盐缓冲液母液稀释至10 mM，总体积为8 mL，作为MIVM洗脱液淬灭浴。 
		注意：也可向淬灭浴中加入磁力搅拌子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用MIVM混合器配制LNPs
	<ol>
		<li>将8 mL淬灭浴置于混合器支架下方，使流出管路的液体排入淬灭浴中。</li>
		<li>用平头针将溶剂和非溶剂分别吸入1 mL气密式注射器中。去除所有气泡，并丢弃针头。通过倒置注射器并排出其中空气，对每个注射器进行预处理。</li>
		<li>将四个注射器按顺时针方向依次安装到混合器上（注射器1-4， 表 2）与对侧的相同血管。参见 图1B 用于最终外观示意图。</li>
		<li>握住移动板两侧的轴承座。避免将手指放在轴承座的底面，因为机械限位装置可能导致夹伤危险。小心地降低移动板，直至其均匀地落在注射器上。 
		注意：操作前，所有注射器的活塞必须处于相同的高度。</li>
		<li>平稳而缓慢地按压平板，目标是在约0.5 s至1 s内完成此操作，适用于这些流速体积。</li>
		<li>盖上含有LNP分散液的淬灭浴。</li>
		<li>使用后请按照下文步骤3.5中的说明对MIVM进行清洁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用由注射泵驱动的MIVM混合器配制脂质纳米颗粒
	<ol>
		<li>按照第3.1步所述组装MIVM。</li>
		<li>按所需配比配制溶剂和反溶剂溶液，并准备足够体积以满足目标制剂规模的需求（表3). 
		注意：这些组分与水相抗溶剂（步骤 1.4）和乙醇溶剂（步骤 3.2.1）流中的成分相同，但已按比例放大，以适用于更大体积的注射器使用 表3.</li>
		<li>将溶液装入20 mL体积的气密性注射器中，并在末端连接带有鲁尔接头的PTFE管。通过倒置注射器和管路并排出所有空气，对注射器和管路进行预冲洗。</li>
		<li>将注射器安装到注射泵中，并将注射器连接至MIVM上的混合器入口，如图所示。 图3A. 
		注意：CIJ 也可在以下模式运行 通过 以相同方式泵送，但仅使用一个反溶剂和溶剂流路注射器。</li>
		<li>将100 mM pH 4的乙酸盐缓冲液母液稀释至10 mM，总体积为320 mL，作为MIVM洗脱液淬灭浴。</li>
		<li>将淬灭浴置于MIVM出口下方。</li>
		<li>将注射泵的体积流速设置为 20 mL/min。 
		注意：可通过手动设置注射泵的数值，将体积流速调节在 2 mL/min 至 40 mL/min 范围内，以形成具有不同微混合条件的脂质纳米颗粒（LNPs）。</li>
		<li>启动注射泵，但让前10秒的流出液流入废液杯中。在初始10秒流出后，将MIVM流出液收集至淬灭浴中。</li>
		<li>移除并盖上盖子，该淬灭浴中含有以选定流速（20 mL/min）制备的脂质纳米颗粒（LNP）分散液。 
		注意：通过选择适当的淬灭浴体积，可重复此步骤以在不同流速下合成脂质纳米颗粒（LNPs）。</li>
		<li>每次实验之间（更换流速时），通过冲洗至少两倍于出口管路体积的溶液来清洗MIVM，以防止在开始下一次脂质纳米颗粒（LNP）合成前收集到先前流速条件下制备的LNP。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用后的设备清洁
	<ol>
		<li>将混合器从支架上取下，同时保持注射器连接，将其置于废液容器上方。取下注射器，使滞留体积的液体排入容器中。然后将混合器组件倒置，使用扳手拆卸混合器。</li>
		<li>用溶剂（如乙醇）冲洗出口管路，并用空气或氮气吹干。</li>
		<li>用适当的溶剂（如去离子水或乙醇）冲洗混合装置，随后再用乙醇冲洗一次。使用空气或氮气气流干燥各组件。</li>
		<li>用去离子水冲洗O形圈，然后吸干。 
		注意：如果发现 O 形圈出现拉伸或变形，请将其风干过夜后再使用。由于 O 形圈属于耗材，应保持充足的库存储备。若次日其形状未能恢复，请丢弃该 O 形圈。</li>
		<li>用溶剂彻底冲洗上部圆盘，并用气流或氮气流吹干表面和注射器接头。</li>
		<li>用合适的溶剂（例如去离子水或乙醇）冲洗每支注射器。使用乙醇进行最后一次冲洗，然后在下次使用前晾干。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 脂质纳米颗粒的后期处理
<ol>
	<li>缓冲液置换与乙醇去除
	<ol>
		<li>使用截留分子量为20 kDa的透析盒，在pH 7.4的10 mM HEPES缓冲液中对LNP分散液进行透析。 
		注意：此步骤通过将乙酸盐缓冲液替换为 HEPES，既可去除残留的 10% 乙醇，又能提高分散液的 pH 值。</li>
		<li>将1 M HEPES储备液稀释至10 mM，总体积为1 L。</li>
		<li>使用注射器和针头将LNP分散液加入一个12 mL透析盒中。</li>
		<li>将透析盒浸入1 L HEPES缓冲液中，并对缓冲液进行磁力搅拌。3小时后更换外部HEPES缓冲液，再继续透析3小时，总透析时间为6小时，随后取出透析盒。</li>
		<li>从透析盒中取出透析后的LNP分散液，并弃去使用过的透析盒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LNP 悬液浓度 通过 超速离心
	<ol>
		<li>将悬液移入适当尺寸的离心过滤器中，其截留分子量为100 kDa30. 
		注意：离心过滤器有多种规格，通常为 0.5 mL 至 12 mL。</li>
		<li>以 2000 x g 离心分散液 g 10-20 分钟（室温），使浓度提高约 5-20 倍。 
		注意：离心过程中，每5分钟检查一次样品，以确保留有适量液体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 脂质纳米颗粒（LNP）的表征
<ol>
	<li>通过动态光散射（DLS）测量流体动力学直径
	<ol>
		<li>分配 750 µL 或 900 µL 将制备好的LNP分散液（无需稀释）分别加入塑料微量比色皿或方形比色皿中。 
		注意：也可在合适的比色皿中使用较小体积。</li>
		<li>设定LNPs所分散溶剂的适当黏度（例如，10 vol%乙醇混合液为1.26 cP）。</li>
		<li>收集背向散射光 173° 角度在 25 °C，随后根据 ISO 标准文件 13321:1996 E 的定义，采用斯托克斯-爱因斯坦模型及光散射相关函数级数展开的一阶累积量对脂质纳米颗粒（LNP）的粒径进行测定。</li>
		<li>至少重复测量三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zeta电位测量
	<ol>
		<li>添加约~800 µL 将制备好的LNP分散液注入折叠毛细管zeta电位仪样品池中。 
		注意：为避免毛细管通道内产生气泡，需将一半液体注入倒置的细胞中，然后旋转。</li>
		<li>至少重复测量三次。 
		注意：为了获得最佳效果，缓冲液电导率应保持在0.2–2毫西门子/厘米之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用市售RNA定量试剂盒测定包封效率（EE）
	<ol>
		<li>使用无核酸酶水将检测试剂盒中提供的 pH 7.5 的 20x Tris-EDTA (TE) 缓冲液稀释至 1x 浓度。</li>
		<li>配制2 wt%的Triton X-100溶液。</li>
		<li>将适量的LNP分散液用1x TE缓冲液稀释，得到总质量浓度约为 0.6 µg/mL 用于RNA，乙醇含量低于0.2 vol%。</li>
		<li>制备与前一步骤类似的样品，但含有0.5 wt.% Triton X-100，该试剂可有效溶解LNPs，从而分别在无和有Triton X-100的条件下区分“游离”RNA与总RNA浓度。</li>
		<li>配制相应浓度的对照RNA溶液 0 µg/mL, 0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0.4 µg/mL, 0.6 µg/mL, 0.8 µg/mL 和 1.0 µg/mL 在1x TE缓冲液中。 
		注意：RNA试剂盒最初可能需要稀释。</li>
		<li>重复上一步操作，但使用0.5 wt.% Triton X-100。</li>
		<li>将试剂盒中提供的Ribogreen染料用1x TE缓冲液稀释200倍。</li>
		<li>向所有已配制的对照RNA和样品溶液（无论是否含有Triton X-100）中加入适量体积的稀释后Ribogreen染料。染料在对照RNA和样品溶液中的稀释倍数应相同，均为两倍。因此，染料的总体稀释倍数为试剂盒中原始浓度的400倍。</li>
		<li>涡旋混合容器。</li>
		<li>准备一个96孔、未经处理、平底、不透明白板，用于酶标仪分析。</li>
		<li>分配 100 µL 将样品和RNA对照的体积分别加入到板的不同孔中。 
		注意：观察含有Triton X-100的溶液中是否产生气泡。每份样品至少进行三次重复实验，需要至少 350 µL 样本的数量。</li>
		<li>使用酶标仪记录荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为528 nm，每次读数光照持续时间约为10 s。无需振荡。 
		注意：EE 由以下公式确定 <img alt="包封效率方程，用于化学实验中计算包封效率（EE）的公式。" src="/files/ftp_upload/67047/67047eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">，其中 I含Triton 我不含Triton 分别代表含和不含Triton X-100的三份样本重复实验的平均荧光强度，以及一个含Triton 和一个不含Triton 分别表示在有和无Triton X-100条件下，对两条平均校准曲线进行线性拟合所得的斜率31.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Synthesizing Lipid Nanoparticles Using CIJ and &#181;MIVM Mixer Technologies

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<li>Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -S., Jadhav, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+RNA+therapeutics%3A+The+great+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape.</a> Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).</li>
<li>Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvoluting+lipid+nanoparticle+structure+for+messenger+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery.</a> Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).</li>
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作者声明无利益冲突。

已介绍使用两个对向射流湍流混合器合成含有核酸聚合物的脂质纳米颗粒（LNPs）的方法。当以适当的流速进行时，对向射流湍流混合器可确保混合时间尺度短于LNP的组装时间，从而产生均匀的过饱和条件，形成粒径小且分布窄的LNPs21。因此，采用相同化学成分但不同湍流混合器几何结构（双射流CIJ混合器和四射流MIVM混合器）制备的LNPs表现出相似的理化性质，并显示出良好的转染效率（图5 和 图6）。相比之下，采用移液方式混合（混合效果较差）所制备的LNPs粒径更大、多分散性更高（图5A），且转染效率较低。长期以来人们已认识到，混合与组装动力学在LNP制备过程中起着关键作用；Cullis等人指出，乙醇与缓冲液之间的快速对流-扩散混合可形成粒径小且分布窄的颗粒，而缓慢的扩散混合则导致形成粒径较大且分布较宽的颗粒9。在对向射流湍流混合器中，混合的时间尺度与进入混合器的流体流速成比例地减小27。这一现象可通过无量纲雷诺数（Re）进行量化，Re表示惯性力与粘性力之间的比值。当Re足够高时，CIJ和MIVM混合腔内发生湍流，湍流涡旋拉伸产生微小的长度尺度，从而通过扩散实现溶剂与反溶剂的快速混合。湍流的特征长度尺度取决于Re，而不依赖于混合装置的具体几何结构。这正是CIJ和MIVM混合器能够制备出相同LNP颗粒的原因，也是不同尺寸的MIVM混合器能够产生相同纳米颗粒（NP）尺寸的原因27。在高Re条件下（对应高入口流速），LNPs可被重复稳定地制备，且批次间无显著差异（图3B）。
本方案利用湍流受限撞击射流（CIJ）混合器，可制备具有不同理化特性的多种mRNA、DNA或siRNA脂质纳米颗粒（LNP）。该技术不仅允许在组分和浓度上具有高度灵活性，还提供了一条清晰的路径，可在实验室规模（数毫克）快速筛选配方，并将优选配方以每分钟5升的生产速率放大至工业级批量生产36。这对于其他多种技术（包括体相混合和微流控技术）而言一直是重大挑战。例如，体相加工技术甚至在数毫升规模下也难以稳定地重复生产出一致的LNP。微流控技术相较于体相混合技术显著提升了LNP的均一性和可重复性；然而，其产量仅限于毫克级别29。如引言中所述，尽管通过微流控装置的并行化尝试实现向生产规模的放大，但仍无法解决装置污染（结垢）问题，且其放大效果远不如基于受限撞击射流技术的混合器。
除了这些优势之外，CIJ 混合器将在制造具有靶向能力或可进行基因编辑的下一代脂质纳米颗粒（LNP）中发挥关键作用。目前的 LNP 配方中，脂质和核酸具有相似的扩散性，因此即使在实验室规模下混合效果略差，也能实现制备。然而，基因编辑方法可能需要包封分子量差异较大的核酸种类，例如小分子向导 RNA 和用于编码 CAS9 蛋白的大分子 mRNA 转录本37。这些不同种类核酸的扩散时间尺度差异极大，使得在化学计量比下实现均匀包封变得具有挑战性。当混合效率降低时，均匀包封的问题会更加突出。同样，靶向肝外细胞可能需要引入强结合且扩散缓慢的稳定剂（例如带有靶向配体的大分子量嵌段共聚物）。在纳米颗粒组装前，可将高达 14 kDa 的靶向配体偶联至嵌段共聚物上，从而利用 CIJ 混合实现其在纳米颗粒中的均匀掺入38。CIJ 湍流混合器是制造由不同扩散性组分构成的 LNP 的有效工具。
尽管对撞射流（CIJ）湍流混合器在制备脂质纳米颗粒（LNP）方面相较于其他混合器具有多项优势，但需注意每种几何结构所伴随的局限性。双射流CIJ混合器要求两股进料流（乙醇相和水相）的动量相等（在10%-30%范围内），才能在腔室内实现均匀的湍流微混合。由于出流中溶剂与反溶剂的比例为50:50，这限制了沉淀发生区域混合腔内的过饱和程度29。四射流MIVM混合器解决了这一缺点，因其可利用四股动量不等的射流，在混合腔内实现更高的过饱和条件。此外，这两种混合器的总处理量通常仅为毫克级别，使其在高通量筛选多种不同LNP配方时并非理想选择。对于简单的LNP配方，初步筛选可优先采用微流控或微量移液策略在微克尺度上进行，待确定若干候选配方后，再转移至受限对撞射流技术进行放大。同时，混合器中的死体积也必须予以充分考虑。在双射流CIJ混合器中，滞留体积为50–100 µL。在计算工艺回收率时，这部分物料必须从淬灭浴中收集的产物量中扣除。虽然在大规模操作中这些损失可忽略不计，但在总反应体积仅为5 mL的情况下，此类损失可达10%，如本研究所示。对撞射流湍流混合器是实现GMP级LNP生产的重要工具，这一点已由两种获得FDA批准的新冠疫苗所证实。

基于mRNA的治疗手段在多种疾病的治疗和预防方面具有巨大潜力，包括传染病、遗传性疾病和癌症1。与能够被动扩散穿过细胞膜的小分子药物不同，核酸必须被包裹以实现细胞内递送2。包裹不仅为mRNA提供结构和稳定性，还能通过内吞途径促进其细胞内递送，并防止其被细胞内外的核酸酶等成分降解3。目前已开发出多种材料和纳米载体用于mRNA的包裹与递送，包括无机纳米颗粒、聚合物、脂质以及类脂材料1。其中，脂质纳米颗粒（LNPs）已成为基于mRNA治疗手段中最突出的递送平台4。
LNPs 由四种脂质成分组成：可电离脂质、胆固醇、两性离子脂质和 PEG-脂质稳定剂5适合用于mRNA递送的可电离脂质，其脂质疏水性与叔胺基团的解离常数（pKa）之间需保持精确的平衡。6可电离脂质的pKa值通常在6.0至6.7之间，例如KC-2（DLin-KC2-DMA）、MC-3（DLin-MC3-DMA）和ALC-03157这一对可电离脂质的pKa限制，既能实现核酸聚合物以疏水性脂质盐形式的包封，也可实现细胞内的递送 &#34;内体逃逸&#34; 过程。LNPs 通过（多种）内吞途径进入靶细胞，这些途径均涉及内体的酸化，pH 值从 7.4 降至约 58可电离脂质的pKa值确保脂质纳米颗粒（LNPs）在生理条件下表面近乎中性，但在酸性内体环境中变为阳离子。9这种pH响应性能够选择性地破坏内体膜，释放包封的核酸聚合物，同时保持细胞活力，这与转染系统（如Lipofectamine）中使用的永久性阳离子脂质不同。胆固醇是LNP结构中的疏水性间质分子，可提高脂质流动性。两性离子脂质发挥结构作用，在LNP表面形成双层结构。聚乙二醇-脂质（PEG-脂质）是一种胶体稳定剂，通过在LNP表面引入聚合物空间稳定层，增强LNP的稳定性，防止LNP聚集。这在pH变化期间尤为重要，因为pH变化会再生可电离脂质的游离碱形式，使其行为类似于疏水性油相，而PEG-脂质的存在有助于维持LNP的稳定。Onpattro（patisiran）配方（以下简称LNP配方）常作为LNP配方设计的起点，其中包含可电离脂质MC3、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）和PEG2000-DMG，溶于乙醇后与RNA的水溶液混合制备10.
有多种技术可用于制备包封核酸聚合物的脂质纳米颗粒（LNPs），其中大多数技术依赖于将含有脂质的乙醇溶液与含有目标核酸（siRNA、mRNA 或 DNA）的水相溶液快速混合这一共同原理9,11,12,13,14。在这一范畴内，诸如移液混合和涡旋混合等整体混合方法为LNPs的制备提供了简单策略，无需使用复杂的仪器设备12。然而，整体混合无法实现组分的均一分布，导致LNPs粒径分布不理想，并伴随显著的批间差异15。
实验室通常采用微流控混合技术，通过更精确地控制混合条件来获得可重复的脂质纳米颗粒（LNPs）12,13,16。然而，由于微流控腔室内的尺度小、流速低，微流控装置中固有的层流条件导致溶剂与非溶剂的混合相对较慢17。微小的腔室尺寸严重限制了LNPs在GMP生产中所需的通量和可扩展性，尽管研究人员已通过并联微流控腔室来尝试扩大生产体积15。并联的微流控结构并不能消除在大体积处理过程中脂质吸附到表面的问题——这一问题通常被称为混合装置的&#34;fouling&#34;现象，同时在流动的均一性和稳定性方面也存在问题，使得微流控技术在工业规模生产中的放大面临挑战18,19。制药公司采用湍流撞击射流混合器来生产新冠疫苗mRNA-LNPs，这一点并不令人意外20。
RNA负载型脂质纳米颗粒（LNPs）的制备过程包括将含有RNA载荷的水相缓冲液流与含有四种不同脂质组分的乙醇流进行混合。这些配方采用pH为4.0或更低的酸性缓冲液，当水相和乙醇相混合时，使可电离脂质带正电荷。带正电的可电离脂质与带负电的RNA通过静电相互作用结合，形成疏水性的RNA-脂质盐。包括RNA-脂质盐在内的疏水性脂质物质在混合溶剂中析出，并形成疏水性核。这些核通过两性离子脂质和胆固醇的持续沉淀而生长，直至达到一个临界点，此时足量的聚乙二醇化脂质吸附在LNPs表面，从而阻止进一步生长——即成核与生长机制21,22,23。将水相缓冲液加入脂质溶液中，直至脂质析出并形成LNPs，该过程依赖于两个不同的时间尺度：溶剂-反溶剂混合时间τmix和核生长时间τagg。无量纲的达姆科勒数（Damköhler number）定义为Da = τmix/τagg，用于描述这两个时间尺度之间的相互关系24。在混合较慢的情况下（Da &#62; 1），LNPs的最终粒径受传质控制，并随混合时间变化。相反，在快速混合条件下（Da &#60; 1），流体被分裂为柯尔莫哥洛夫长度尺度的条纹或层状结构，此时LNPs的形成完全由各组分的分子扩散所主导，从而实现均一的LNPs形成动力学。实现后一种情况要求脂质浓度超过某一临界阈值，以建立有利于均匀均相成核的过饱和状态。
据估计，τ聚集 从几十毫秒到几百毫秒不等25在其最基本配置中，两条流路——一条含有乙醇和脂质，另一条含有携带RNA货物的水相缓冲液——被注入一个称为混合室的腔室中 &#34;受限撞击射流&#34; (CIJ) 混合器。在适当流速下运行时，湍流涡旋可在 1.5 毫秒内产生约 1 µm 的溶剂/抗溶剂条纹尺度。流股速度与混合几何结构决定了线性动量向湍流涡旋的转化，从而实现流体混合。该过程通过无量纲数——雷诺数（Re）进行参数化描述，Re 与流速呈线性正比关系。Re 的计算公式为 Re = Σ (ViDi/vi），其中 Vi 每股流体中的流速 vi 是各股流体的运动粘度，Di 是双射流CIJ装置中的流道入口直径26 或4喷嘴MIVM中的腔室直径27注意：某些关于CIJ的参考文献仅使用单一射流直径和速度来定义Re28在微流控装置中，雷诺数（Re）范围为1-100，而在撞击射流（CIJ）装置中，雷诺数可达125,000。在CIJ混合器中，具有相等动量的流股发生碰撞，碰撞时动量耗散形成湍流混合，由于柯尔莫哥洛夫微尺度较小且达姆科勒数较低，从而实现高效的微混合。另一种类型的混合器是 &#34;多入口涡流混合器&#34; （MIVM），其中四股流体被导入一个中央腔室。在此装置中，持续流入受限混合腔室可确保明确定义的混合时间尺度。在这两类混合器中，所有流体单元均会通过高能混合区域。相比之下，简单的混合装置（如T型接头）不包含提供混合区域的腔室，由于入射流体的动量主要被偏转至出口方向，而非用于产生湍流涡旋，导致两股流体的混合程度较低。CIJ和MIVM混合器均可在分批或连续模式下运行，为不同规模的脂质纳米颗粒（LNP）生产提供了灵活性。
本方案描述了如何利用两种受限撞击射流技术——双射流受限撞击射流（2-jet CIJ）和四射流多入口旋流混合器（4-jet MIVM）——制备最优的脂质纳米颗粒（LNP）配方。此前已有研究证实，CIJ和MIVM混合器可用于制备具有疏水性核心材料的纳米颗粒（NPs）。29。有关使用这些混合器形成纳米颗粒（NPs）的更多信息，应参考该文章和视频作为补充资源。本更新重点介绍基于脂质的纳米颗粒（NPs）的形成。文中展示了通过调节微混合条件来调控脂质纳米颗粒（LNPs）尺寸的能力。此外，还展示了撞击式喷射混合（CIJ）技术在形成稳定、单分散性良好且性能提升的脂质纳米颗粒（LNPs）方面的应用价值 体外 与使用低效移液混合制备的脂质纳米颗粒相比，HeLa细胞中的转染效率得到提升。此外，还讨论了每种CIJ混合结构的优缺点，以及这些混合器放大所需的相关条件。

<table><tbody><tr><td>18:0 PC（DSPC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365P</td><td>辅助脂质</td></tr><tr><td>21 G × 1-1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>96孔黑色壁黑色底板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96孔白色/透明底板，TC表面</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>ALC-0315</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890900</td><td>可电离脂质</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa 截留分子量，15 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa 截留分子量，4 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo 荧光素酶检测系统</td><td>Promega</td><td>E2620</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA (5 moU)</td><td>TriLink 生物技术公司</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>受限撞击射流混合器</td><td>Holland Applied Technologies，Helix Biotech，Diamond Tool and Die（DTD）</td><td>N/A</td><td>请联系 Holland 或 DTD 以获取定制订单，Helix Biotech 系统为 Nova BT。审阅新混合器验证的相关文本</td></tr><tr><td>D-Lin-MC3-DMA&amp;nbsp;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-112251&amp;nbsp;</td><td>可电离脂质</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，丙酮酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>DMG-PEG 2000</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880151P</td><td>PEG-脂质</td></tr><tr><td>DODMA</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890899P</td><td>可电离脂质</td></tr><tr><td>乙醇 200 证明</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 高透明度锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证，美国</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，游离酸</td><td>IBI Scientific</td><td>IB01130</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT 两组分 1 mL 鲁尔接头</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT 两组分 5 mL（6 mL）鲁尔锁扣</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4050.X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Idex 1648 ETFE 管 &lt;图片 替代文本=&quot;公式 2&quot; 源文本：src=&quot;/files/ftp_upload/67047/67047eq02.jpg&quot; 样式=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;&amp;rdquo; OD 0.093&amp;rdquo; ID</td><td>Idex Health &amp;与科学</td><td>1648</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-678 &amp;frac14;&amp;rdquo;-28 至鲁尔接头</td><td>Idex Health &amp;科学</td><td>P-678</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-940 ETFE管用卡套</td><td>Idex Health &amp;与科学</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头</td><td>Idex Health &amp;与科学</td><td>P-604</td><td>使用带有相应螺纹的 CIJ 或 MIVM 混合器入口进行组装。Idex 部件也可通过 VWR 及许多其他供应商获取。</td></tr><tr><td>混匀仪支架</td><td>霍兰应用技术公司</td><td>N/A</td><td>参见 Markwalter &amp;&&amp;nbsp; Prud'homme 提供设计支持。&lt;sup&gt;26&lt;/sup&gt; 请联系 Holland 购买</td></tr><tr><td>多入口涡旋混合器</td><td>霍兰应用技术公司与钻石模具公司（DTD）</td><td>N/A</td><td>请联系 Holland 或 DTD 以获取定制订单。审阅新混合器验证的相关文本</td></tr><tr><td>O形圈（MIVM）</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>订购大量耗材部件。若使用其他来源的溶剂，请确保溶剂兼容性。</td></tr><tr><td>出口卡套 - CIJ</td><td>Idex Health &amp;与科学</td><td>P-200</td><td>使用出口接头组装（大端与管路平齐）</td></tr><tr><td>出口接头 - CIJ</td><td>Idex Health &amp;与科学</td><td>P-205</td><td>使用卡套和管路连接CIJ腔室出口</td></tr><tr><td>出口接头 - MIVM</td><td>Idex Health &amp;与科学</td><td>P-942</td><td>与套圈组合</td></tr><tr><td>出口管 - CIJ</td><td>Idex Health &amp;与科学</td><td>1517</td><td>使用管子切割器以获得整齐的切口。确保多余的管子不会伸入混合室中</td></tr><tr><td>出口管 - MIVM</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>与套圈内径匹配。</td></tr><tr><td>PBS - 磷酸盐缓冲液（10倍浓度），pH 7.4，无RN酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PHD 2000 可编程注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 塑料两件式注射器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>塞子接头</td><td>Idex Health &amp;科学</td><td>P-309</td><td>在CIJ混合器侧面组装（密封钻孔的进入点）</td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen RNA 定量检测试剂盒、RiboGreen RNA 试剂、RediPlate 96 RiboGreen RNA 定量微孔板试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen 公司</td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY 表面去污剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>DWK生命科学</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>SGE 气密型注射器，鲁尔锁扣，100 mL</td><td>SGE</td><td>100MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>SGE 气密型注射器，鲁尔锁扣，50 mL</td><td>SGE</td><td>50MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析盒，20 K 道尔顿截留分子量</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>66012</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>32319-500G-R</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器</td><td>Genesse Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>水，无内毒素</td><td>优质生物材料</td><td>118-325-131</td><td>无RNA酶和DNA酶</td></tr><tr><td>酵母RNA（10 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM7118</td><td></td></tr></tbody></table>

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

脂质纳米颗粒（LNPs）作为治疗性递送载体已展现出巨大的潜力，这一点已通过两种获批并全球使用的新型冠状病毒（COVID-19）信使RNA（mRNA）疫苗得到证实。在小规模制备中，LNPs通常采用微流控技术制备；然而，这些设备的局限性限制了其在大规模生产中的应用。目前，COVID-19疫苗的大规模生产采用的是受限对射射流（CIJ）湍流混合器。CIJ技术能够在实验室规模上实现制备，并确保其可线性放大至生产规模。CIJ混合的关键原理在于：混合长度和时间尺度由混合腔内的湍流强度决定，且纳米颗粒的形成远离器壁，从而避免了表面沉积和结垢问题。本研究展示了使用两种不同结构的受限对射射流混合器技术制备LNPs的过程：双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（MIVM）。文中讨论了每种混合结构的优缺点。在这两种结构中，LNPs通过有机溶剂流（通常为含有可电离脂质、辅助脂质和稳定化PEG-脂质的乙醇溶液）与水相抗溶剂流（含RNA或DNA的缓冲水溶液）的快速混合而形成。本文提供了CIJ和MIVM混合器的操作参数，以制备具有可控粒径、zeta电位、稳定性及转染效率的可重复性LNPs。同时，也对比展示了采用低效混合方式（如移液混合）与CIJ混合所制备的LNPs之间的差异。

本文演示了一种使用限域撞击射流（CIJ）混合器技术合成脂质纳米颗粒（LNPs）的详细方案，其中包括双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（µMIVM）。CIJ混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而制备出单一分散的LNPs。

脂质纳米颗粒（LNPs）已展现出作为治疗性递送载体的巨大潜力，这一点已在多种获批并全球广泛应用的药物中得到证实。

我们的研究重点是通过在受限几何空间中溶剂与非溶剂流的湍流混合来理解纳米颗粒的形成过程。受限条件下的湍流混合能够在连续流动条件下实现脂质纳米颗粒的可重复制备，其规模范围从实验室级别的每分钟数百微升到工业级别的每分钟数十升。脂质纳米颗粒通常采用微流控装置或移液器混合方法制备。这些微流控装置在类似毛细管的通道中混合乙醇溶剂和水相抗溶剂液流。然而，由于通道尺寸小且流速低，雷诺数较低，导致产生层流混合。而移液混合则是通过将溶剂液流直接注入抗溶剂浴中来生成脂质纳米颗粒（LNPs）。目前制备脂质纳米颗粒的方法存在可扩展性差和重复性不佳的问题。例如，移液器混合法由于依赖非封闭的手动混合，其操作本身具有较大的变异性。虽然微流控装置在一定程度上解决了这些问题，但其运行流速极低，且由于脂质RNA在通道壁上的沉积，容易发生污染和堵塞。这些问题凸显了在从实验室到临床规模的各个阶段，都需要具备可重复且高通量的技术。本方案展示了通过跨不同批次规模的湍流混合，实现脂质纳米颗粒可重复且可放大的制备方法。研究人员可先在小规模上自信地开展LNP制剂的筛选或优化，再制备更大批次的材料用于后续试验。湍流混合可确保纳米颗粒的一致性，且不受批次大小的影响。受限几何结构的湍流混合器解决了现有脂质纳米颗粒制备技术的主要问题。利用湍流条件可实现更快的分子尺度混合，从而能够将不同大小的寡核苷酸整合到LNP核心中。CIJ混合器还可消除脂质在混合器壁上沉积所引起的污染问题。在相同雷诺数下的湍流具有自相似的柯尔莫哥洛夫尺度涡流，从而实现一致的混合效果。受限撞击射流混合器将两个高雷诺数的流体流在较大的混合腔室内对向引导，以实现混合。每个射流的线性动量在形成微米级湍流涡旋的过程中被耗散，从而导致溶剂与反溶剂流的快速且均匀混合。开始制备脂质纳米颗粒时，用乙醇填充两支5毫升注射器，并将每支注射器固定到受限撞击射流（或称CIJ）混合器的入口端口。快速推动注射器活塞，将混合器流出的液体作为废液收集。从CIJ中移除乙醇冲洗用的注射器。通过进样适配器吹入干燥的氮气流，以干燥CIJ的内部通道。在1.5毫升微量离心管中混合脂质储备溶液，并用乙醇稀释。将100毫摩尔/升 pH 4的乙酸盐缓冲液母液稀释至10毫摩尔/升，总体积为4毫升。为制备抗溶剂流，将RNA与乙酸盐缓冲液在1.5毫升离心管中混合。在1毫升注射器中准备500微升溶液。将注射器倒置，排出水相反溶剂流中的任何空气。同样，用一个一毫升的注射器收集500微升脂质溶液。然后，将注射器倒置，排出乙醇溶剂流中的空气。将洁净的CIJ混合器置于淬灭浴小瓶上方。将两支注射器连接至CIJ混合器的进样口。快速推动两支注射器，使溶剂与反溶剂流混合，并在淬灭浴中收集脂质纳米颗粒。将CIJ混合器从淬灭浴中取出，此时注射器仍连接在上面。将CIJ混合器置于废液容器上方，取下注射器，使残留的滞留体积液体流入废液容器中。随后，盖上装有脂质纳米颗粒分散液的淬灭浴瓶，并轻轻摇晃小瓶。多入口涡流混合器将流体沿切线方向注入混合腔，形成在旋转涡流中层状排列的流层。混合腔内的高雷诺数可产生微米尺度的湍流涡旋，这些涡旋迅速混合各层流层，其原理类似于连续流动撞击混合器（CIJ混合器）内部的湍流涡旋。开始组装微型多入口涡流混合器（MIVM）时，需在工作平台上准备好所需的底部接收器、混合结构圆盘、顶部圆盘、O型圈以及扳手。将O形圈嵌入混匀圆盘的凹槽中。将混匀圆盘上的孔与顶盘上的定位销对齐，轻轻压合，确保O形圈不脱落。将已配合好的混匀圆盘、O形圈与顶盘组件松松地拧入底部接收器中。然后，使用扳手将顶部圆盘拧紧到底部接收器中。将出口管路接头插入并拧紧到底部接收器中，以完成MIVM的组装。将组装好的MIVM安装到混合支架上，使出口管路从支撑板中穿出。接下来，按所需配比配制溶剂和反溶剂溶液。将30毫升溶液装入气密式注射器中。将注射器和管路倒置，排出其中的任何空气。在末端安装带有鲁尔接头的聚四氟乙烯管。将注射器安装到注射泵中，并将其连接至MIVM上的混合器入口。将100毫摩尔/升pH 4的乙酸盐缓冲液原液稀释至10毫摩尔/升，总体积为320毫升。在注射泵上，将体积流速设置为 20 毫升每分钟。启动注射泵，使前 10 秒的流出液流入废液烧杯中。10 秒后，将 MIVM 流出液收集至淬灭浴中。现在，取下并盖紧装有脂质纳米颗粒分散液的淬灭浴。每次实验之间，通过冲洗至少两倍于出口管路体积的液体来清洁MIVM。将混合器从支架上取下时，保持注射器连接，将其置于废液容器上方。取下注射器，使残留液体流入容器中。然后将混合器组件倒置，使用扳手将其拆开。用乙醇冲洗出口管路和混合结构，并用气流或氮气吹干各部件。然后，用去离子水冲洗O形圈，并用吸水纸吸干。使用空气流或氮气流干燥表面之前，先用乙醇彻底冲洗顶部圆盘和注射器。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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