Name: 体内研究 通过牙龈接种表达荧光素酶的轴丝无毛体对 婴儿利什曼原虫感染的仓鼠进行成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 了解通过牙龈静脉注射婴儿利什曼原虫感染金黄仓鼠的标准化方法，利用生物发光成像实时追踪感染进程，比较无鞭毛体与前鞭毛体的感染效果，为临床前药物测试建立稳定可重复的感染模型。

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南马托格罗索州教育、科学与技术发展支持基金会 - FUNDECT。PPSUS/Decit-MS/CNPq/SES 为本研究提供了资金支持。感谢 Monique Ribeiro de Lima 在接种途径方面提供的建议。本项目是在编号为 N 的合作协议框架下开展的o 258/2017号协议，由FIOCRUZ与里约热内卢联邦大学（UFRJ）签署。&#160;研究团队衷心感谢来自科学普及中心（IOC）的视频制作人Ricardo Baptista Schmidt和Genilton José Vieira在拍摄实验方案和进行访谈过程中提供的宝贵支持与帮助。

涉及仓鼠的实验方案遵循了奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所（Instituto Oswaldo Cruz/IOC）动物研究伦理委员会的指南（批准号：CEUA/IOC L-015/2022）。
1. 将萤火虫荧光素酶基因克隆至Leishmania表达质粒
<ol>
	<li>用BglII（10 U/μL）和NotI（10 U/μL）限制性内切酶消化质粒pLEXSY-hyg2。先用BglII进行消化：向50 μL质粒（含9 μg DNA）、30 μL限制性酶缓冲液、3 μL牛血清白蛋白（BSA）、3 μL BglII中加入无核酸酶水，至终体积为300 μL。37 °C孵育3小时。</li>
	<li>用BamHI（10 U/μL）和NotI消化TOPOII/LUC质粒，以释放含有Kozak序列（Kozak-LUC）的萤火虫荧光素酶开放阅读框，该片段已克隆至TOPOII载体中16。先用BamHI消化：将100 μL质粒（含8.5 μg DNA）与30 μL限制性酶缓冲液、3 μL BSA、3 μL BamHI混合，并用无核酸酶水补足至终体积300 μL。37 °C孵育3小时。</li>
	<li>使用硅胶膜对每种质粒进行纯化，并用50 μL水洗脱两次，最终体积为100 μL。</li>
	<li>用NotI对先前线性化的pLEXSY-hyg2和TOPOII/LUC质粒进行双酶切。将从硅胶膜洗脱的100 μL DNA与15 μL缓冲液D、2 μL NotI及无核酸酶水混合，终体积为150 μL。37 °C孵育1小时。</li>
	<li>在1%琼脂糖凝胶中通过电泳分离双酶切后的载体（pLEXSY-hyg2）和插入片段Kozak-LUC，并进行凝胶纯化，电泳使用Tris-乙酸EDTA（TAE）缓冲液。用手术刀切下约8 kb和1.6 kb的条带。称量凝胶块，按1体积凝胶加入3体积缓冲液，50 °C孵育至凝胶完全溶解，转移至硅胶膜，用20 μL水洗涤并洗脱DNA两次，最终体积为40 μL。</li>
	<li>使用T4 DNA连接酶连接双酶切后的载体（pLEXSY-hyg2）和插入片段Kozak-LUC：取2 μL载体和插入片段（浓度均为55 ng/μL），摩尔比为1:5；加入5 μL连接缓冲液、1 μL T4 DNA连接酶（1 U/mL），终体积为10 μL。16 °C过夜孵育。</li>
	<li>向10 μL连接反应产物中加入40 μL无核酸酶水，用10倍体积的丁醇沉淀DNA。在微量离心机中以最高速度离心10分钟，用70%乙醇洗涤沉淀，再次以最高速度离心10分钟，将沉淀在室温下晾干，最后加入4 μL水溶解。</li>
	<li>取4 μL连接反应产物与电转感受态细菌JM109（40 μL）混合，转移至电击杯（d = 0.2 cm）中，置于冰上。在2,500 V、200 Ω、25 μF条件下进行电穿孔，电击后立即将电击杯放回冰上，加入1 mL LB培养基。迅速将混合物转移至15 mL锥形管中，37 °C、100 rpm振荡孵育60分钟。</li>
	<li>将上述混合物涂布于两块LB琼脂/氨苄青霉素（100 µg/mL）平板上：一块涂布200 μL，另一块涂布全部电转细菌。将转化后的菌液在2,000 × g离心10分钟浓缩，沉淀重悬于100 μL LB培养基中，将全部体积/沉淀涂布于平板。30 °C孵育24–30小时，等待克隆生长。</li>
	<li>用牙签挑选单克隆，转移至含有5 mL LB/氨苄青霉素（100 µg/mL）培养基的50 mL锥形管中。30 °C、100 rpm振荡培养20–24小时，使小量提取培养物充分生长。</li>
	<li>使用质粒小提试剂盒纯化质粒，并用30 μL水洗脱DNA。通过BamHI酶切筛选含有pLESXY-LUC-hyg2构建体的阳性克隆。</li>
	<li>取10 μL小提质粒DNA，加入2 μL限制性酶缓冲液、0.2 μL BSA、1 μL BamHI，并用无核酸酶水补足至终体积20 μL。37 °C孵育1小时。阳性克隆在1%琼脂糖凝胶电泳中预期产生大小为3,450和6,290个碱基对的片段。</li>
	<li>准备大量培养物以大规模纯化构建体pLESXY-LUC-hyg2。取1 L锥形瓶，加入250 mL LB培养基（含氨苄青霉素），再加入1 mL已转染的小提质粒JM109菌液，30 °C、200 rpm振荡培养18–20小时。</li>
</ol>
2. 表达荧光素酶的 Leishmania infantum 的制备与筛选
<ol>
	<li>用 SwaI 完全酶切质粒 pLESXY-LUC-hyg2，以释放Leishmania整合盒。在 100 μL 的终体积中加入 40 μL 质粒（50 μg）、10 μL 快速消化缓冲液、4 μL SwaI 和无核酸酶水。在 30 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>用乙醇沉淀，用 70% 乙醇洗涤一次，加入 50 µL 水重悬，并置于冰上保存。</li>
	<li>在指数生长期，将Leishmania MHOM/BR/1974/PP75 前鞭毛体在 Schneider 培养基中以 1,000 × g 离心 10 分钟。用脑心浸液（BHI）培养基洗涤沉淀物，并以 1,000 × g 再次离心 10 分钟。将沉淀物重悬于 BHI 培养基中，浓度为 108 个前鞭毛体/mL。</li>
	<li>在冰上，将L. infantum 前鞭毛体（500 μL）与 pLESXY-LUC-hyg2 整合盒（50 µg）混合于电穿孔比色皿（d = 0.4 cm）中。施加两个 1,500 V/25 微法、间隔 10 秒的电脉冲。脉冲结束后，继续在冰上放置 10 分钟。</li>
	<li>将转染后的前鞭毛体转移至含有补充 20% 胎牛血清（FCS）的 Schneider 培养基的培养瓶中，在 26 °C 下培养。24 小时后加入潮霉素——初始浓度为 50 µg/mL，48 小时后增至 100 µg/mL，1 周后增至 150 µg/mL。</li>
	<li>通过有限稀释法，在含 20% FCS 和 150 µg/mL 潮霉素的 Schneider 培养基的 96 孔板中对 L. infantum-Luc 转染前鞭毛体进行克隆。在 26 °C 下孵育以促进克隆生长。</li>
	<li>使用微孔板检测仪通过生物发光信号（相对发光单位，RLU）筛选克隆，以选择遗传均一且高表达的L. infantum-Luc 克隆。</li>
	<li>简而言之，将 106 个前鞭毛体与 100 μL 底物 D-荧光素（300 µg/mL）在白色 96 孔板中混合，底物缓冲液组成为：25 mM HEPES（pH 7.8）、15 mM MgCl2、4 mM EGTA、1 mM DTT、1 μg/mL BSA、2.5 mM ATP、0.1% Triton X-100 和 300 μM 辅酶 A，立即在微孔板检测仪中测定发光值。</li>
</ol>
3. 通过PCR评估基因组整合至18S rRNA（ssu）核糖体 位点
<ol>
	<li>从表达荧光素酶和野生型的前鞭毛体中纯化基因组DNA（108）。在 1,000 × g 在15 mL圆底试管中，以1,000 ×g离心10分钟，加入磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀，用血球计数板计数后，再次以1,000 ×g离心10分钟。用裂解缓冲液重悬沉淀：100 mM NaCl、10 mM Tris、25 mM EDTA、0.5% SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K，调整至密度为108/mL。在 56 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>使用等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v）和等体积氯仿各进行一轮DNA纯化。每次抽提后，将水相转移至新管，并在2,000 × g 10 分钟。</li>
	<li>用两倍体积的乙醇沉淀 DNA，并在 5,000 × g，10 分钟，4 °C。加入 1 mL 70% 乙醇，转移至微量离心管，于 15,000 × g 5 分钟。</li>
	<li>用70%乙醇进行第二次洗涤。离心后，弃去上清液，并将沉淀物在实验台上干燥。</li>
	<li>将基因组DNA用50–100 µL超纯水在65 °C水浴中重悬30分钟，定量DNA后于-20 °C保存。</li>
	<li>进行诊断性PCR以评估pLEXSY表达盒在基因组中的整合情况 利什曼原虫 基因组扩增：配制以下PCR反应体系：10 μL PCR缓冲液，0.2 mM dNTP，1 U DNA聚合酶，1 μg基因组DNA，0.5 μM上下游引物各1种，无核酸酶水补至终体积50 μL。
	<ol>
		<li>选择在 pLEXSY 载体中杂交的引物 利什曼原虫 基因组：(1) aprt 反向引物 A1715 5'-TATTCGTTGTCAGATGGCGCAC-3'，与 utr1 (aprt) 区域杂交；(2) ssu 正向引物 F3001 5'-GATCTGGTTGATTCTGCCAGTAG-3'，位于 利什曼原虫 染色体18S rRNA（ssu）位点. </li>
		<li>使用以下扩增程序：94 °C 变性 2 分钟，1 个循环；30 个扩增循环（94 °C 30 秒，60 °C 30 秒，72 °C 1 分钟）；最后在 72 °C 延伸 10 分钟。预期 PCR 产物大小为 1.1 Kb。</li>
		<li>使用第二组引物：（1）潮霉素抗性基因上游引物 A3804 5'-CCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCG-3'，以及（2）ssu 下游引物 F3002 5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3'，分别与 pLEXSY 载体中的抗性标记和 18S rRNA（ssu）位点互补结合 利什曼原虫 基因组。使用与步骤3.6.2中所述相同的PCR程序，但退火温度改为53 °C（而非60 °C）。预期扩增产物为1.8 kb（hyg - 3`ssu）。</li>
		<li>通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以检测是否已整合至核糖体18S rRNA基因座 L. infantum 基因组</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. L. infantum- 无鞭毛前体虫和无菌型无鞭毛体的前鞭毛体分化
<ol>
	<li>培养 L. infantum-LucMHOM/BR/1974/PP75，该菌株在补充25 mg/L血红素和20%胎牛血清（FCS）的BHI培养基中持续表达荧光素酶。 
	注意：已从稳定转染子的培养基中去除潮霉素。</li>
	<li>获得后循环前鞭毛体 L. infantum-Luc，种子 106/mL 前鞭毛体于 75 cm² 培养瓶中2 烧瓶中加入20 mL添加20% FCS的BHI培养基，置于26 oC，并保持水平位置培养4天，或略微倾斜直至进入生长稳定期。连续培养6-8天后，锥虫培养物中前循环型前鞭毛体数量增加；将前鞭毛体在1,000 × g 4℃下10分钟 oC.</li>
	<li>用20 mL低糖DMEM重悬前鞭毛体沉淀，使用血细胞计数板进行计数，然后在1,000 × g 4℃下10分钟 oC.</li>
	<li>将DMEM低糖培养基加入沉淀，重悬至3-5 × 107 每毫升密度的前鞭毛体。将5 mL前鞭毛体加入10 mL经DMEM稀释的Ficoll垫液中，体积比为2:1（v/v）。将梯度液在100 × g 4℃下孵育15分钟 oC，松开刹车并缓慢加速。</li>
	<li>在Ficoll垫层上方的界面处收集后循环前鞭毛体，使用血球计数板计数，并在1,000 × g条件下离心 g 4℃下孵育10分钟 oC. 用PBS洗涤沉淀以去除残留的Ficoll，使用血细胞计数板进行计数，并在1,000 × g 4℃下10分钟 oC.</li>
	<li>将沉淀重悬于PBS中，至浓度为2 × 109/mL。接种前将前鞭毛体置于冰上保存。</li>
	<li>前鞭毛体的分化 L. infantum-将Luc转染至无菌的无鞭毛体 体外 在无菌培养的前鞭毛体改良培养基中（MAA）17.</li>
	<li>通过向含有Earle盐和谷氨酰胺的Medium 199中添加以下成分来制备MAA：9.55 g/L的Medium 199（含Earle盐和谷氨酰胺）、0.5%胰蛋白胨-酪蛋白胨、3 mM L-半胱氨酸、15 mM D-葡萄糖、4 mM NaHCO₃3，0.33 mM Na2HPO4，25 mM HEPES，调至终pH为6.5，并添加20%胎牛血清（FCS）。</li>
	<li>在中等大小的培养瓶（75 cm²）中开始培养2) 加入9 mL MAA培养基和1 mL处于生长稳定期的前鞭毛体（7th 天），2-3 × 107 每毫升含前鞭毛体。在32 °C下孵育24–48小时，以诱导无鞭毛体分化。</li>
	<li>每周进行两到三次传代培养，持续培养无菌生长的无鞭毛体，直至其密度达到 2-3 × 107/mL</li>
	<li>扩大无菌无鞭毛体培养以用于仓鼠感染。准备150 cm²培养瓶2 含有高密度无鞭毛体的培养瓶（5 × 106/mL）加入20 mL含20% FCS的MAA培养基中。</li>
	<li>24 小时后，以 1,000 × g 4℃下10分钟 oC，用相同体积的PBS洗涤，使用血细胞计数板计数，并在1,000 × g 4℃下10分钟 oC. 加入 PBS 以配制 10 的接种物8 50 μL 中的无鞭毛体</li>
</ol>
5. 动物
<ol>
	<li>在4–6周龄时获取雄性金黄地鼠&#160;周，并进行为期2周的隔离。确保其年龄为6–8&#160;周龄，在感染时体重为 80–100 g L. infantum MHOM/BR/1974/PP75 
	注意：本方案适用于雄性和雌性仓鼠。然而，由于实验当时的可获得性，本研究仅使用了雄性仓鼠。</li>
	<li>将仓鼠分为五组：第一组，通过腹腔接种无鞭毛体（n = 3）；第二组，通过腹腔接种前鞭毛体（n = 3）；第三组，通过齿龈静脉接种无鞭毛体（n = 2）；第四组，通过齿龈静脉接种前鞭毛体（n = 2）；第五组，未感染仓鼠作为对照组（n = 2）。</li>
	<li>将动物饲养于配备可控通风系统（每小时换气10–15次）、12小时光照/12小时黑暗循环、温度21 ± 2 ℃的通风笼架中 oC 和 40-60% 湿度。提供环境丰富化物品，如纸张、干草、疏水性棉花、纸板卷、高压灭菌水和食物 随意摄取.</li>
</ol>
6. 腹腔注射途径感染
<ol>
	<li>用拇指和食指像镊子一样从靠近头部两侧捏住仓鼠背部的皮肤，其余手指将背部皮肤向后拉伸，尽可能多地提起皮肤，将仓鼠固定在笼子的网格上。</li>
	<li>将腹部右下象限的接种部位与大腿后侧肌肉对齐。</li>
	<li>将动物身体倾斜45º，头部低于腹部，针头以15°至20°角进行接种。</li>
	<li>使用连接1 mL注射器的13 x 0.45 mm针头，接种50 µL含108个无菌培养的无鞭毛体或前鞭毛体的PBS溶液。进针深度应超过针尖斜面0.5 cm。将针头插入腹部后，回抽注射器活塞以确认未刺入血管，然后小心注入液体。</li>
</ol>
7. 通过牙龈接种进行静脉感染
<ol>
	<li>按照第6节所述方法固定仓鼠。使用3 mL注射器（连接13 x 0.45 mm针头）经腹腔注射1.3 mL混合溶液，其中包含10%盐酸氯胺酮200 mg/kg和2%盐酸赛拉嗪10 mg/kg。</li>
	<li>通过夹住足垫间趾根部以确认动物已处于麻醉状态。
	<ol>
		<li>用双手将麻醉后的仓鼠固定于仰卧位，用拇指轻轻下拉下唇，暴露牙龈及龈静脉</li>
		<li>将连接1 mL注射器的较细针头（8 x 0.30 mm）置于下门齿下方，沿两颗牙齿之间的中线以25º角插入下颌唇静脉2–4 mm</li>
		<li>为确认接种物进入静脉且针头已插入下颌唇静脉，回抽血液直至针筒（黄色部分）可见血液</li>
		<li>缓慢而小心地在1分钟内注入50 µL PBS中的接种物（含108个无鞭毛体或前鞭毛体），直至完全注入，以避免接种物和血液从静脉泄漏至体外，并促进其在血液中扩散</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拔针前，用棉签轻压穿刺部位。拔针时保持棉签按压，以促进局部止血，持续轻压1分钟，防止出血和接种物丢失</li>
</ol>
8. 通过心脏穿刺放血实施安乐死
<ol>
	<li>按照第7节所述方法固定动物以进行麻醉。使用连接5 mL注射器的20 × 0.55 mm针头，从剑突下方以45º角并稍向左倾斜插入，进行心脏穿刺。</li>
	<li>抽取1 mL血液。终末采血后，拔出注射器，但保留针头在心脏内。</li>
	<li>若动物仍有呼吸且存在心跳，使用5 mL注射器将5%硫喷妥钠（200 mg/kg）注入已置于心脏内的20 × 0.55 mm针头中。</li>
	<li>5分钟后，使用听诊器确认是否存在呼吸运动和心跳。</li>
</ol>
9. 从器官和组织中提取DNA
<ol>
	<li>安乐死后，采集脾脏、肠系膜淋巴结以及肝脏碎片。</li>
	<li>将组织置于干冰上冷冻，解冻后用两片手术刀片切割。取20 mg剪碎的组织加入600 µL裂解缓冲液中，并加入17.5 µL蛋白酶K（20 mg/mL），55 °C过夜孵育消化。</li>
	<li>以15,000 × g 离心4分钟，去除未裂解的组织碎片。</li>
	<li>加入200 µL蛋白质沉淀液，剧烈混匀20秒，在冰上孵育5分钟，然后以15,000 × g 离心4分钟。</li>
	<li>将上清液转移至另一离心管中，加入600 µL异丙醇，轻轻混匀直至DNA析出。将DNA以15,000 × g 离心2分钟，再用70%乙醇在倾斜摇床上洗涤30分钟，随后离心。</li>
	<li>弃去乙醇，室温下干燥沉淀。加入50–200 µL超纯水，在65 °C下水合DNA 30分钟，定量后将DNA稀释至0.1 μg/mL，于-20 °C保存。</li>
</ol>
10. 通过 PCR 评估组织和器官中的感染
<ol>
	<li>通过常规PCR检测组织和器官基因组DNA中的寄生虫载量：2.5 μL PCR缓冲液，1.5 mM MgSO4，0.2 mM dNTP，1 U DNA聚合酶，300 ng基因组DNA，0.2 μM每种引物，用无核酸酶水补足至25 μL终体积。
	<ol>
		<li>使用L. infantum kDNA18的扩增程序：94 °C变性1个循环，2分钟；39个扩增循环，94 °C 30秒，60 °C 15秒，72 °C 30秒；最后72 °C延伸5分钟。预期PCR产物大小为145 bp。（1）kDNA上游引物（RV1）5´-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3´；（2）kDNA下游引物（RV2）5´-CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3´。</li>
		<li>扩增仓鼠GAPDH，作为PCR的内参对照3：94 °C变性1个循环，2分钟；39个扩增循环，94 °C 30秒，58 °C 15秒，72 °C 30秒；最后72 °C延伸5分钟。（1）仓鼠GAPDH上游引物5´- GGTTGCCAAACCTTATCAGAAATG-3´；（2）仓鼠GAPDH下游引物5´- TTCACCTGTTCCACAGCCTTG -3´。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。</li>
</ol>
11. 仓鼠随访通过 体内 生物发光成像
<ol>
	<li>通过整个动物的生物发光信号来评估感染随时间的进展过程 体内 成像系统，由安装在避光暗室中的冷却电荷耦合相机（CCD）组成。在图像采集期间，通过鼻罩输送麻醉剂以维持动物的麻醉状态。</li>
	<li>在进行生物发光成像前以及诱导麻醉前5分钟，按照第6节操作，对仓鼠腹腔注射D-荧光素（150 mg/kg）。用PBS配制15 mg/mL的D-荧光素钾盐储备液，经滤膜除菌后，于-80℃保存 oC.</li>
	<li>动物注射D-荧光素5分钟后，在富氧诱导室中用2%异氟烷麻醉。再过5分钟，使用CCD相机采集生物发光图像。分别在感染后2小时和24小时、感染后第8天和第22天（dpi），采集仓鼠仰卧位的图像。 
	注意：成像过程中需使用异氟烷-氧气输送装置维持麻醉状态。</li>
	<li>根据生物发光强度，使用以下参数： 曝光时间，30 秒至 5 分钟，像素合并模式为中或大，光圈 f/1 和 视野 D (12.5 厘米).</li>
</ol>
12. 感染动物体内生物发光的定量分析 L. infantum- Luc
<ol>
	<li>使用手动测量工具识别动物头部和身体的兴趣区域（ROI）、大小和面积。量化CCD相机在选定ROI中获取的生物发光信号。</li>
	<li>使用平均背景ROI测量背景信号，并从手动ROI获得的生物发光信号中减去该背景值。</li>
	<li>以辐亮度表示生物发光信号，该单位经时间和面积归一化：光子数·秒-1·厘米-2·球面度-1</li>
</ol>

<ol><li>Ruiz-Postigo, J. A., et al. Global leishmaniasis surveillance, 2022: assessing trends over the past 10 years. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuiz-Postigo%2C+JA+%22WHO%2C+Weekly+epidemiological+record+n%C2%B0+40%22">WHO, Weekly epidemiological record n° 40</a>. , (2023).</li>
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作者声明无利益冲突。

在仓鼠中进行血液采集或静脉注射物质是多种科学研究的必要操作。已有多种方法被开发出来，以直接满足不同采集或接种途径的需求，这些途径与研究目标密切相关19。由于仓鼠解剖结构的特点——尾部和四肢较短，因此通常选择经心内途径进行Leishmania的静脉注射。根据所用菌株的不同，心内注射途径已被证明具有优势，例如参考菌株L. infantum MHOM/BR/1974/PP75，其感染过程可持续较长时间（6–9个月）5。然而，该方法可能导致动物出血甚至死亡。因此，我们建立了一种替代性的静脉接种途径，即通过齿龈丛的下颌唇静脉进行感染，该方法对动物造成的伤害更小。实验中使用的动物感染了经过遗传修饰的参考菌株L. infantum MHOM/BR/1974/PP75，该菌株在多次体外培养及小鼠传代后仍能稳定表达萤火虫荧光素酶（图1），这与其他使用相同整合型质粒转染的Leishmania物种报道的情况一致20。
下唇静脉或牙龈静脉是采血以及多次采血的更佳途径10,11。然而，本研究首次证实牙龈静脉可作为在仓鼠体内通过静脉接种Leishmania的可行部位。与通常采用较细的26 G高规格针头以避免溶血的采血操作不同10，该规格针头在Leishmania接种时并不适用，因其易导致静脉穿孔、出血及接种液渗漏。经上颌下唇静脉进行Leishmania感染时，必须使用更细的30 G针头。另一项区别在于静脉穿刺感染时的给药速率，约为1 μL/s；并需确保接种液注入血管——即下唇静脉，而非滞留在黏膜、皮下或真皮层内。由于牙龈血管丛的血流速度较慢，50 μL高浓度的无鞭毛体或前鞭毛体（L. infantum-Luc，2 × 109 个虫体/mL）接种液必须缓慢注射（约1分钟），注射完成后需保持棉签按压1分钟再拔针，以利于接种物在血液中充分扩散（图2）。
为进行感染的长期评估，仓鼠通过腹腔内（IP）或龈内（IG）途径感染 L. infantum-Luc 并通过生物发光成像系统随访至感染后第50天，直至实施安乐死。考虑到参考毒株 PP75 的毒力可能较低 本身 且荧光素酶的过表达也可能影响感染效率并维持长期感染，因此采用较高的接种量（10）8 寄生虫用于感染。在牙龈接种无鞭毛体和前鞭毛体后 L. infantum-通过生物发光成像系统对Luc进行检测，感染后24小时，生物发光信号仅局限于仓鼠的上颌区域。事实上，经腹腔感染无鞭毛体和前鞭毛体的仓鼠 L. infantum-Luc 显示出在整个腹部弥散的生物发光现象（图3，1 dpi）。从感染第一天到第8天，生物发光信号随时间持续减弱th 天，直至第22天nd 感染仓鼠的 dpi L. infantum-Luc，与接种途径无关（表1 和 图4).
然而，当动物组织中的寄生虫负荷较低时，可能低于生物发光成像系统的检测限，但可通过PCR或qPCR检测并定量。已有报道表明，PP75菌株引起的感染确实低于其他菌株5，由于动物的遗传变异性，仅有少数个体表现出明显的临床症状。本研究中，尽管动物数量较少且该菌株毒力较低，但无菌型无鞭毛体在感染后50天（50 dpi）显示出优势，其感染效果优于前鞭毛体，PCR结果证实了这一点图5）。通过牙龈途径感染无鞭毛体8个月后，可通过PCR在肝脏中检测到寄生虫（图5并表现出中度毛发竖立、眼眶紧缩和弓背姿势。
无菌的无鞭毛体可能是比前鞭毛体更优的感染和随访选择21，并且具有易于大规模生产的优点。牙龈接种是可行的，也是静脉注射化合物以及感染Leishmania和其他病原体的更佳途径，不会对下颌接种部位造成损伤或肿胀，也不会影响动物健康。

利什曼病被认为是由20多种Leishmania原虫引起的被忽视且再度出现的疾病，流行于拉丁美洲、非洲北部和东部以及亚洲西部和东南亚这四个主要生态流行病学区域的多个国家1。该病可分为皮肤利什曼病（TL）和内脏利什曼病（VL），其中内脏利什曼病若不及时治疗可导致死亡。巴西内脏利什曼病的致病原为Leishmania infantum，目前主要采用五价锑剂或两性霉素B进行治疗。这些药物需静脉给药，具有较高毒性，可引发不良反应，且已出现耐药病例2。
因此，有必要加大对新型化疗药物研发的投入。事实上，临床前试验是发现治疗利什曼病新药的瓶颈，其效果依赖于动物模型、所用菌株、接种途径以及其他后勤、技术和操作因素。金黄地鼠对Viannia亚属和利什曼原虫（Leishmania）亚属的物种具有高度易感性，在既往使用Leishmania braziliensis3,4的研究中发现，其表现出许多与人类疾病相似的临床和免疫病理过程。感染了L. infantum的金黄地鼠也会发展出多数在人类和犬类内脏利什曼病（VL）中典型的免疫病理过程5，例如贫血、白细胞减少、血小板减少以及肝脾肿大。此外，金黄地鼠属于远交系动物，个体反应不一致，能够再现人类临床表现的异质性3。
影响感染结果的另一个方面是L. infantum菌株类型及接种途径。不同L. infantum菌株在遗传背景和对治疗的敏感性方面存在差异2,6,7。某些菌株在前鞭毛体感染后，肝脏和脾脏中的寄生虫负荷较低8，而无鞭毛体可作为提高感染效率的一种尚未充分探索的替代方案。事实上，静脉注射途径更有利于感染，并可增加出现临床症状动物的比例；但目前最常用的仍是腹腔接种。对于L. infantum感染，心内注射是实现静脉感染的常用途径5,8,9。然而，在仓鼠中，牙龈接种可作为静脉注射的一种替代途径，且尚未被描述为感染接种部位。尽管已有报道，牙龈静脉穿刺具有微创性，便于静脉通路建立，并引起较少的局部和全身损伤10。牙龈静脉穿刺最符合提升研究结果质量和适用性的推荐原则，同时有助于保障实验动物的福利11。
使用传统方法对利什曼病（VL）化合物进行临床前评价需要使用更多的动物，并且必须将动物处死以进行组织病理学分析及组织内寄生虫负荷的评估。相比之下，生物发光成像系统可加快临床前研究进程并减少动物使用数量。在同一只动物体内，可对感染组织中的生物发光信号进行连续数周的实时追踪。多项关于该关键技术工具标准化的研究已证实其在感染了Trypanosoma cruzi、Leishmania spp.和Toxoplasma gondii的小鼠模型研究中的应用价值12,13,14,15。然而，生物发光信号的强度可能受组织内寄生虫负荷的影响，在某些情况下体内成像系统可能无法充分检测到信号，此时需通过定量PCR对受累器官进行进一步评估。因此，我们提出建立一种方法，即通过向金黄地鼠的齿龈静脉注射表达荧光素酶的L. infantum，结合生物发光成像系统与PCR技术进行后续监测。

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA标记</td><td>普洛麦格</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>1-丁醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td></td></tr><tr><td>乙酰辅酶A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖，LE，分析级</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>aprt 反向引物 A1715&lt;br/&gt; aprt 反向引物 A1715</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-111</td><td></td></tr><tr><td>BamHI 10 U/mL</td><td>Promega</td><td>R6021</td><td></td></tr><tr><td>BglII 10 U/mL</td><td>Promega</td><td>R6071</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液（BHI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮盐酸盐 10%（Cetamin）</td><td>Syntec</td><td>-</td><td>兽用。麻醉剂。注射液，每瓶10 mL，含10%盐酸氯胺酮。</td></tr><tr><td>葡萄糖，BD 诊断</td><td>Difco</td><td>215530</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>DMEM低糖培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪 Gene Pulser Xcell&amp;nbsp;</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>体外细胞/胚胎生命</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-plaqueTM PLUS&amp;nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙&lt;br/&gt; 1652082</td><td>Bio-Rad</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿，0.4 cm 间隙&lt;br/&gt; 1652081&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Platinum 聚合酶</td><td>Fischer Scientific</td><td>10-966-034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>血红素粉末</td><td>实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>hyg 正向引物 A3804</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-109</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>异弗林</td><td>Cristalia</td><td></td><td>含100 mL和240 mL异氟烷的吸入用溶液，每盒装1瓶</td></tr><tr><td>IVIS Lumina</td><td>Perkin Elmer</td><td>ISO838N4625</td><td></td></tr><tr><td>JM109 感受态细胞</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp;L2005</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>λDNA/HindIII 标记物</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>SM0101</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NotI 10 U/mL</td><td>Promega</td><td>R6431</td><td></td></tr><tr><td>酚/氯仿/异戊醇，25:24:1（v/v），分子生物学级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>质粒 pLEXSY-hyg2&amp;nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>EGE-232</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Promega</td><td>V3021&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN 质粒中量提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR &amp;amp; 凝胶回收试剂盒</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763&lt;br/&gt; Sigma-Al</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax2 微孔板读板仪</td><td>应用生物系统公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssu 正向引物 F3001&lt;br/&gt; 引物 F3001</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-105</td><td></td></tr><tr><td>ssu 反向引物 F3002&lt;br/&gt; ssu 反向引物 F3002</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-104</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo 萤光素酶检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>SwaI 10 U/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER1241</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶 1 U/mL</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>T4快速连接系统</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veritiy 96孔板</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶大豆肉汤（大豆-酪蛋白消化物培养基）</td><td>Difco-BD</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>通风笼架&amp;nbsp;</td><td>Alesco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>厄尔氏&amp;prime;s 盐和 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，粉末&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（盐酸赛拉嗪 2%）</td><td>Syntec</td><td>-</td><td>兽医用途。镇静、镇痛及肌肉松弛。注射液，每瓶10 mL，含2%盐酸赛拉嗪。</td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer&amp;nbsp;</td><td>451245</td><td></td></tr></tbody></table>

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

In Vivo Imaging of Leishmania infantum-infected Hamsters by Gingival Inoculation of Axenic Amastigotes Expressing Luciferase

皮肤型利什曼病（ATL）和内脏利什曼病（VL）被世界卫生组织列为被忽视的疾病。若不及时治疗，VL可能致命；目前使用的治疗药物具有毒性，且已出现耐药病例。临床前试验可能成为新药研发的瓶颈，其影响因素包括动物模型的选择、所用菌株以及接种途径。金黄地鼠对Viannia亚属和Leishmania属物种高度易感，能够表现出与人类疾病相似的多种临床及免疫病理过程。
根据仓鼠的解剖结构，由于其尾部和四肢较短，通常选择心内途径进行Leishmania的静脉注射。然而，该方法可能导致出血，最终引发动物死亡。因此，我们建立了一种替代性的静脉接种途径——经牙龈静脉注射，该方法创伤小，易于实现静脉通路，且对动物造成的局部和全身损伤较少。本研究对通过腹腔（IP）或牙龈静脉（IG）途径感染表达荧光素酶（Luc）的Leishmania Infantum的仓鼠进行了随访观察，分别在感染后22天采用生物发光成像系统进行检测，并在感染后50天和8个月时进行PCR检测。
在将L. infantum-Luc的无鞭毛体和前鞭毛体通过牙龈接种后，至少在注射部位持续观察到为期2周的生物发光信号，表明病原体已感染牙龈丛周围的组织。经腹腔接种L. infantum-Luc的仓鼠则如预期所示，生物发光信号广泛分布于整个腹部。然而，通过生物发光成像系统检测发现，感染信号随时间推移逐渐减弱，至第50天时仅能通过PCR检测到。&#160;通过PCR评估，无鞭毛体引起的感染程度高于前鞭毛体。事实上，感染8个月后，通过静脉接种无鞭毛体的动物肝脏中仍可通过PCR检测到寄生虫，这一特征可能与L. infantum MHOM/BR/1974/PP75参考株相关，该菌株感染进程缓慢且寄生虫负荷较低，低于生物发光成像的检测分辨率。因此，相较于前鞭毛体，无鞭毛体可能是更优的感染和追踪模型选择，而牙龈接种途径也可作为Leishmania及其他病原体静脉注射的可行方式。

稳定表达荧光素酶 L. infantum 
基因改造 L. infantum 使用pLEXSY系列质粒构建，该质粒可整合至基因组中 利什曼原虫 在由RNA聚合酶I驱动转录的18S rRNA（ssu）核糖体基因座中。因此， L. infantum-Luc 克隆株的质粒整合情况在基因组中进行了评估 利什曼原虫， 通过生物发光发射实现稳定表达 体外高表达克隆显示出生物发光 &gt;背景信号的120倍被选为通过PCR评估基因组整合的标准。参见 图1 用于PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，以评估质粒在基因组中的整合情况以及前鞭毛体的生物发光信号（RLU） L. infantum-Luc 克隆。每个 PCR 均获得预期大小的片段；从基因组中扩增出一条约 1.1 kb 的产物（5'ssu - utr1）和一条 1.8 kb 的产物（hyg- 3'ssu） L. infantum- 萤光素酶（Luc）图1A)，证实质粒盒及荧光素酶基因已整合至ssu 位点 的 L. infantum 基因组
通过微量滴定板读数仪检测L. infantum-Luc前鞭毛体中萤火虫荧光素酶的表达水平（以相对发光单位RLU表示），方法如方案第2部分所述。即使在体外连续传代培养以及在BALB/c小鼠体内感染5天后，其生物发光水平仍保持稳定：野生型背景株为569.3 ± 19.5，克隆株L. infantum-Luc为59361.9 ± 2673.3（n = 2）（图1B）。因此，稳定表达萤火虫荧光素酶的L. infantum-Luc克隆株被用于通过龈内或腹腔途径感染仓鼠。
经牙龈静脉静脉接种 
将Leishmania接种至仓鼠血液时，应注意尽量减少静脉穿孔、出血及接种物外漏。因此，需轻柔下拉下唇以暴露牙龈静脉（图2A）；并应使用较小规格的30 G针头，以避免静脉过度穿孔。进针时针尖斜面应朝上，以合适角度刺入静脉（图2B）。为确认针头已进入血管——即下颌唇静脉，需回抽注射器活塞，直至血液被吸入针筒内（图2C）。拔针前，需用棉签轻压穿刺部位，以促进止血（图2D）。
通过生物发光成像进行纵向评估 
腹腔内（IP）或龈内（IG）感染的仓鼠 L. infantum-Luc 的随访持续至第 50 天th dpi，并通过生物发光成像评估至22 dpi（图3）。图像在腹腔感染后2 h采集，感染剂量为108 腹腔中的寄生虫；采用中等合并模式，曝光时间为30秒或1分钟进行成像。生物发光信号为 &gt;在无鞭毛体感染的动物中，腹部信号强度高出65倍（4.6 × 105 ± 3.7 × 105) 高于前鞭毛体感染组（6.8 × 103 ± 3.8 × 103) (表1），表明无鞭毛体已分化 体外 比处于稳定期并在Ficoll垫层中纯化的前循环型前鞭毛体具有更强的生物发光性。
感染后第1天（1 dpi），采集了3分钟曝光时间的生物发光图像（图3）。在前鞭毛体感染的仓鼠中，腹部区域的生物发光信号减少了45%，而在无鞭毛体感染的仓鼠中则减少了70%（图3），这表明无鞭毛体的降解程度高于前鞭毛体（表1 和 图4）。感染后第8天（8 dpi），前鞭毛体感染动物的生物发光信号保持稳定（3.3 × 103 ± 5 × 103）；然而，无鞭毛体感染仓鼠的生物发光信号下降了95%，从1.3 × 105 ± 1.1 × 105 降至 6.7 × 103 ± 7.5 × 103（表1），并达到与前鞭毛体感染仓鼠相似的水平。感染后第22天（3周），采集了5分钟曝光时间并采用大binning模式的生物发光图像（图3）；前鞭毛体和无鞭毛体感染动物的生物发光信号均显著降低（表1 和 图4）。
另一组仓鼠通过牙龈内途径接种L. infantum-Luc（108）的无鞭毛体和前鞭毛体，观察到上颌区域出现生物发光信号（图3）。随访从感染后第1天开始，无鞭毛体感染的仓鼠比前鞭毛体感染的仓鼠表现出更强的生物发光信号和辐射通量（分别为7.3 × 103 ± 4.1 × 103 与 1 × 103 ± 5.7 × 102）。感染后一周（8 dpi），前鞭毛体感染动物的生物发光信号下降了36%，而无鞭毛体感染动物则下降了90%；辐射通量从7.3 × 103 ± 4.1 × 103 变为 7.8 × 102 ± 5.6 × 102（表1）。感染后三周（22 dpi），以5分钟曝光时间和大 binning 模式采集生物发光信号（图3）。前鞭毛体和无鞭毛体感染动物在牙龈感染部位头部的生物发光信号均较低且相似（表1 和 图4），且未观察到感染通过生物发光信号向腹部区域扩散。
通过 PCR 评估组织和器官中的感染 
我们采用常规PCR检测特定器官（如肝脏、脾脏和淋巴结）中的感染情况，这些器官的感染水平可能低于检测限 体内 成像。kDNA 的目标区域具有更高的特异性 L. infantum 感染组织和器官中的DNA扩增，以及仓鼠GAPDH酶基因的PCR作为DNA完整性和PCR反应的对照。仅对那些被成功扩增的样本进行后续分析。 GAPDH 在分析中考虑了这些因素。因此，通过腹腔注射无菌前鞭毛体感染的三只仓鼠中，有两只经PCR检测在组织和器官中显示出感染；其中，动物二（A2）的脾脏和动物三（A3）的肝脏在感染后50天（50 dpi）呈阳性。图 5A）。一只仓鼠通过腹腔注射感染无菌前鞭毛体；动物三（A3）（图5B) 在淋巴结中显示出扩增。在感染后第50天，通过牙龈内接种前鞭毛体或无细胞无鞭毛体的仓鼠未能显示明显的扩增，仅在一只感染前鞭毛体的动物（A1）肝脏中观察到一条条带。图5C值得注意的是，我们有三只动物通过牙龈内途径接种无鞭毛体时，接种物在注射过程中发生轻微泄漏，并维持了8个月。其中三只动物中的两只显示出肝脏明显感染，分别为动物一和动物二。图 5D).
<img alt="凝胶电泳与生物发光图谱；DNA条带及L. infantum荧光素酶表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：通过PCR和生物发光检测评估Leishmania infantum-Luc克隆株。（A）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，用于检测质粒在基因组中的整合情况：第1道 — 1 kb DNA ladders；L. infantum-Luc基因组DNA的PCR产物，第2道 — 5'ssu - utr1（1.1 kb），第3道 — hyg- 3'ssu（1.8 kb）；L. infantum-wt基因组DNA的PCR产物，第4和第5道。（B）L. infantum-Luc克隆株前鞭毛体（106）在微孔板读数仪中测得的生物发光信号（RLU）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示四个阶段的啮齿类动物牙科手术；注射器用于牙齿清洁和检查。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：将Leishmania infantum-Luc 经牙龈静脉注射。（A）将仓鼠置于仰卧位，并向下牵拉下唇。（B）将连接1 mL注射器的较细针头（8 × 0.30 mm）置于下门齿下方，沿两颗牙齿之间的中线以25º角插入下唇动脉静脉，深度为2–4 mm。（C）接种50 µL PBS中的无鞭毛体或前鞭毛体（108）。（D）使用棉签对接种部位施加轻压以止血。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠利什曼原虫感染进展，荧光成像，腹腔注射，龈内注射方法" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：随访由 体内 生物发光成像 每组一只动物的代表性图像：通过腹腔内（上图）或牙龈内（下图）感染利什曼原虫无鞭毛体或前鞭毛体 L. infantum-Luc，分别在感染后第1、8和22天。红色ROI表示腹部和头部的检测区域，分别对应腹腔内或牙龈内感染。数据显示，在感染后第1天，所有动物在腹部或下颌均显示出生物发光信号。信号在第8天后开始下降，至第22天时各组均几乎无法检测到。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="前鞭毛体和无鞭毛体感染发光图；感染后天数（dpi）数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：生物发光图像发光强度的比较分析。 使用手动 ROI 测量工具对感染利什曼原虫的仓鼠腹部或头部进行发光强度定量，单位为光子数·秒-1·cm-2·sr-1。通过从测量 ROI 中减去平均背景 ROI 以消除任何伪信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳结果，564 bp 和 125 bp 处的 DNA 条带，用于基因表达比较的凝胶分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：kDNA 的 PCR 扩增。（A）IP-AMA，通过腹腔途径接种无鞭毛体感染的仓鼠，感染后第 50 天（n = 3）；（B）IP-PRO，通过腹腔途径接种前鞭毛体感染的仓鼠，感染后第 50 天（n = 3）；（C）IG-AMA，通过牙龈内途径接种无鞭毛体感染的仓鼠（n = 2），IG-PRO，通过牙龈内途径接种前鞭毛体感染的仓鼠（n = 2）；（D）IG-AMA，通过牙龈内途径接种无鞭毛体感染的仓鼠，感染后 8 个月（n = 3）。NI，未感染的仓鼠作为阴性对照（n = 2）；C- L. infantum-Luc 的基因组 DNA，PCR 的阳性对照。组织和器官：1- 脾脏，2- 肝脏，3- 淋巴结。mw- 分子量标记，箭头指示较低分子量的条带。A1- 动物一，A2- 动物二，A3- 动物三。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">dpi</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">无鞭毛体 IP</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">前鞭毛体 IP</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">无鞭毛体 IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">前鞭毛体 IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;">均值</td>
			<td style="min-width: 60px;">标准差</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">均值</td>
			<td style="min-width: 60px;">标准差</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">均值</td>
			<td style="min-width: 60px;">标准差</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">均值</td>
			<td style="min-width: 60px;">标准差</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">0</td>
			<td style="min-width: 60px;">4.6 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3.7 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">6.8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3.8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">1</td>
			<td style="min-width: 60px;">1.3 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">1.1 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3.8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5.5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7.3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">4.1 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">1.0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5.7 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">8</td>
			<td style="min-width: 60px;">6.7 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">7.5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3.3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5.0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7.8 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">5.6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">6.4 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">8.2 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">22</td>
			<td style="min-width: 60px;">7.3 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8.5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">9.9 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8.6 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">4.6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">7.5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">5.0 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">1.5 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：生物发光图像比较辐射分析的原始数据。 按组别和给药途径分列的辐射定量平均值，单位为光子·秒-1·厘米-2·球面度-1。缩写：dpi = 感染后天数；SD = 标准差；N = 样本量。

本文通过生物发光成像和PCR技术，对经腹腔（IP）或牙龈内（IG）途径感染L. infantum-Luc的金黄地鼠进行纵向评估。在感染后第1天（1 dpi）、感染后第1周（8 dpi）和感染后第3周（22 dpi）对动物进行评估，并于感染后第50天（50th dpi）和感染后8个月处死动物。

美洲皮肤利什曼病（ATL）和内脏利什曼病（VL）被世界卫生组织列为被忽视的疾病。若不及时治疗，VL可能致命。

我们旨在标准化将杜氏利什曼原虫经静脉注射至仓鼠牙龈静脉的方法，以评估其作为替代感染途径的潜力。此外，我们还研究了无鞭毛体是否比前鞭毛体更适合作为感染接种物，并利用生物发光成像系统进行后续监测。活体成像系统是对感染评估方法的改进。可在同一动物体内实时追踪生物发光位点，而其他常用的评估方法包括血液和组织中的寄生虫负荷、组织病理学分析和PCR，这些方法可能需要实施安乐死。牙龈静脉具有微侵入性，与其他静脉感染途径相比，可在不造成局部损伤的情况下实现静脉通路。另一个重要之处在于，无菌型无鞭毛体可在体外获得，而从组织中获取的无鞭毛体则不能。由于静脉穿刺、出血和接种物渗漏，通过牙龈静脉感染利什曼原虫时采用了较细的针头。生物发光成像系统显示，感染信号随时间逐渐减弱，仅能通过PCR检测到，这是参考株的特征，其感染进程缓慢且寄生虫负荷较低。我们已为婴儿利什曼原虫在金黄地鼠中标准化了另一种感染途径。通过向齿龈静脉进行静脉内感染，旨在为临床前试验获得稳定且可重复的感染率。[采访者] 首先，用双手将麻醉后的仓鼠以仰卧位固定。用拇指轻轻下拉下唇，暴露牙龈及齿龈静脉。使用一支1毫升注射器连接较细的针头，将针头置于下门齿下方，沿两颗牙齿之间的中线，呈25度角。将针头插入下唇颌静脉2至4毫米。回抽注射器使血液进入，以确认针头位于下唇颌静脉内。确保血液进入针筒部分。缓慢注入50 µL接种物，其中含有1亿个表达萤光素酶的利什曼原虫无鞭毛体或前鞭毛体，悬浮于PBS中。在拔出针头前，用棉签施加轻压。在保持棉签压力的同时，将针头从血管中取出，以促进止血。用手固定感染了利什曼原虫和萤光素酶标记物的仓鼠。按150 mg/kg剂量，将脱荧光素（deluciferan）经腹腔注射至仓鼠体内。麻醉后5分钟，将动物置于俯卧位，进行CCD相机下的生物发光成像。在感染后2小时和24小时，以及感染后第8天和第22天获取仓鼠的成像图像。根据生物发光信号强度，设定曝光时间在30秒至5分钟之间。选择中等或较大的Bin模式，F值设为1，视野（Field of View）选择D。使用手动测量工具，在动物的头部和身体区域确定感兴趣区域（ROI）。从CCD相机获取所选ROI内的生物发光信号定量值。为测量背景信号，计算平均背景ROI值，并从手动选定ROI获得的生物发光信号中减去该值。生物发光信号以辐射通量密度表示，单位为光子数/秒·平方厘米·球面度（photons/s/cm²/sr）。在经齿龈感染利什曼原虫和萤光素酶标记物的仓鼠上颌区域，感染无鞭毛体的动物在感染后2小时和1天时的生物发光信号高于感染前鞭毛体的动物。至感染后第8天，前鞭毛体感染动物在上颌区域的生物发光信号下降了36%，而无鞭毛体感染动物则下降了90%。在感染后第22天，前鞭毛体和无鞭毛体感染的动物在上颌区域均表现出相似的低水平生物发光信号。经齿龈途径感染无鞭毛体8个月后，可通过PCR在肝脏中检测到寄生虫，且动物表现出中度竖毛、眼眶紧张及弓背姿势。

in-vivo-imaging-leishmania-infantum-infected-hamsters-gingival

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

体内研究 通过牙龈接种表达荧光素酶的轴丝无毛体对 婴儿利什曼原虫感染的仓鼠进行成像

一个 体内 成像系统用于对利什曼原虫（Trypanosomatid原生动物）感染小鼠的感染情况进行定量测量 利什曼原虫这是一种非侵入性且非致死性的方法，可用于在慢性感染过程中检测多种组织内表达荧光素酶的寄生虫。 利什曼原虫...

in vivo 活体成像转基因Leishmania 寄生虫在活体宿主中的分布

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。...

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

通过在背部皮肤进行皮内注射Leishmania前鞭毛体，优化用于皮肤利什曼病的实验性仓鼠模型。该方法在接种、后续观察、病灶特征描述、治疗实施以及临床样本采集过程中均具有优势。动物的运动能力、觅食与饮水行为、嬉戏及社交活动均保持正常。...

仓鼠背部皮肤的皮肤利什曼病：一种用于抗利什曼原虫药物筛选的有效模型

感染THP1细胞的寄生虫拯救与转化实验 体外 与 Leishmania donovani...

一种针对THP1人急性单核细胞白血病细胞系内Leishmania donovani无鞭毛体的抗利什曼原虫药物筛选的寄生虫拯救与转化实验

利用荧光素酶和活体成像系统（IVIS）作为一种新方法，在临床症状出现前识别疾病终点。IVIS使我们能够实时观察脑炎病毒在多天内的侵袭过程，从而为未来研究提供更为精确的疾病模型。该技术还使我们能够比当前常用的动物模型更快地评估抗病毒药物和疫苗的潜在保护作用。通过在多个时间点对同一动物进行连续监测，可减少实验动物使用数量、降低成本，并降低动物的整体发病率，确保疾病研究过程更加人道且更具科学性。...

体内成像系统（IVIS）检测神经侵袭性脑炎病毒

本视频展示了一种用于定量检测寄生虫在骨髓来源巨噬细胞（BMMs）内生长的实验方法。巨噬细胞被运动型和非运动型侵袭期寄生虫感染，...

一种体外定量检测寄生虫在巨噬细胞内生长的实验方法

人巨细胞病毒（HCMV）感染新生儿是导致智力障碍的重要原因，然而病毒引发致病的分子机制仍不甚清楚。为了研究脑部感染的动态过程，我们改进了整体动物 体内...

使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

本文报道了一种利用活体显微成像结合特定图像采集与分析方法，对小鼠肝脏血管系统中单个血管内血流速度进行动态测量与定量的详细实验方法。...

肝脏活体显微成像 利什曼原虫 感染：肝脏血流动力学评估

所有致病性利什曼原虫（Leishmania）物种均在其脊椎动物宿主的巨噬细胞内寄居并增殖。本文介绍一种在体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞中感染利什曼原虫（Leishmania）并精确量化其胞内生长动力学的实验方案。该方法适用于研究影响宿主-病原体相互作用及利什曼原虫（Leishmania）毒力的各个独立因素。...

巨噬细胞内生长的定量分析是一种快速可靠的毒力评估方法 利什曼原虫 寄生虫

此处，我们提供了一套整合的实验方案，用于评估小鼠皮肤感染情况 Leishmania...

体内感染 Leishmania amazonensis 评估小鼠体内寄生虫毒力

本方案详细描述了在Trypanosoma...

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

了解通过牙龈静脉注射婴儿利什曼原虫感染金黄仓鼠的标准化方法，利用生物发光成像实时追踪感染进程，比较无鞭毛体与前鞭毛体的感染效果，为临床前药物测试建立稳定可重复的感染模型。

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

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