Name: 完整 果蝇 幼虫中的激光细胞消融揭示了突触竞争 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 了解完整果蝇幼虫中的激光细胞消融技术，用于研究神经回路组装过程中的突触竞争机制。该方法利用光遗传学精确调控神经元活动，揭示神经元竞争对神经系统发育的影响。

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在FAU Stiles-Nicholson脑科学研究所高级细胞成像中心的双光子显微镜上进行了实验。我们感谢朱庇特生命科学倡议提供的资金支持。

所有用于本方案的动物均为该物种 黑腹果蝇. 该物种的使用不存在伦理问题，开展本研究无需获得伦理审批。相关细节如下 果蝇 研究中使用的物种、试剂和设备均列于下文 材料表.
1. 繁殖 果蝇 并选择正确的幼虫阶段
<ol>
	<li>选择一种Gal4驱动品系，使其在待消融的细胞中表达，并将其与UAS-GFP报告品系进行重组或杂交。将果蝇饲养于标准果蝇培养基中，25 °C条件下培养。 
	注意：对于巨纤维（GF）消融，使用R91H05-Gal4或A307-Gal4与UAS-GFP重组；TTMn消融则采用ShakB(lethal)-GAL4与UAS-GFP重组（见材料表）。</li>
	<li>挑选已开始从培养基中钻出并沿培养管壁爬行的幼虫。此类幼虫处于游走期，是进行GF细胞消融的理想阶段。 
	注意：消融可在任何幼虫阶段进行。末龄幼虫阶段对巨纤维系统（GFS）发育操作尤为重要，因为此阶段GF细胞体在脑中易于识别，而GF轴突尚未与靶细胞建立连接。</li>
</ol>
2. 准备3龄幼虫
注意：幼虫麻醉采用与 Burra 等人类似的方法9。为缩短操作时间，每次仅处理一只幼虫。短暂接触麻醉剂有助于提高实验动物的存活率10。
<ol>
	<li>准备一个带紧密盖子的玻璃培养皿。在培养皿中放入一个棉球，在通风橱内加入约3-5 ml乙醚（危险、易燃液体，需穿实验服、戴手套和护目镜）。用盖子盖好培养皿。</li>
	<li>收集单个 3rd 来自果蝇培养瓶的龄期幼虫。在第3龄rd 幼虫期，幼虫离开食物培养基并沿食物管壁向上爬行11.
	<ol>
		<li>确保幼虫仍在活动，尚未开始化蛹。身体静止且出现缩短现象的幼虫已开始化蛹，不适合用于消融实验。使用小号画笔轻轻挑取幼虫。 
		注意：3rd 幼虫阶段始于孵化后72小时（产卵后）的第二次蜕皮，持续至120小时蛹壳形成，适用于在指定条件下培养的果蝇 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一条幼虫转移至一个小型敞口容器中，将容器放入盛有乙醚的玻璃培养皿内，并紧密盖上皿盖。打开玻璃培养皿时，应将其置于通风罩或排风罩下方，以防止乙醚蒸气逸出。
	<ol>
		<li>每隔30秒，将带有幼虫的盖子从培养皿中取出，在解剖显微镜下检查幼虫的活动能力。幼虫通常在1分钟内被完全固定。当口钩停止抽动时，幼虫即可用于制片。若幼虫在3分钟后仍未完全固定，应予以弃用。 
		注意：可将微型离心管倒置的管盖顶部（管盖已从管体移除）用作容器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于消融的幼虫载玻片制备
<ol>
	<li>将麻醉后的幼虫置于玻璃载玻片上。用一滴昆虫生理盐水浸没幼虫，以冲洗掉可能附着在幼虫体表的食物残渣。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用纸巾吸去大部分生理盐水。将幼虫背面向上放置用于巨纤维（GF）消融，或腹面向上放置用于胸突运动神经元（TTMn）消融。缓慢将玻璃盖玻片压在幼虫上。从盖玻片边缘加入生理盐水，使载玻片与盖玻片之间的空隙充满液体。</li>
	<li>进行巨纤维（GF）消融时，在解剖显微镜的高倍镜下检查脑部位置。确保脑组织平展且可通过体壁清晰观察。通常脑部会被脂肪组织覆盖，导致无法观察和进行细胞消融。
	<ol>
		<li>若脑部被脂肪组织覆盖，可用镊子轻轻按压盖玻片，并左右移动盖玻片以移开脂肪组织。若无法通过此方法清除脑部覆盖的脂肪组织，则应更换另一只幼虫。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 定位靶细胞
注意：本研究使用的多光子系统安装在直立显微镜上。使用系统专用软件控制图像采集和激光刺激参数。该系统配备落射荧光光源，用于定位样品。物镜为水浸式物镜，放大倍数为25倍，工作距离长达2 mm，数值孔径（NA）为1.10。
<ol>
	<li>将样品置于多光子显微镜的载物台上，使用GFP滤光片在落射荧光模式下定位样品。对于GF消融，可在脑部识别细胞体，如图1A、C、D所示。对于TTMn消融，可从腹侧在腹神经索（VNC）中识别出由四个细胞组成的细胞簇，如图1A、B所示。聚焦完成后，将细胞置于视野中央，并切换至双光子模式。</li>
</ol>
5. 设置消融参数
<ol>
	<li>调整激光设置和检测器增益，使用伽伐尼扫描镜观察表达 GFP 的细胞。870 nm 的波长最适用于观察 GFP 信号。将细胞置于视野中央。</li>
	<li>使用圆形兴趣区域（ROI）定义消融区域。确保 ROI 覆盖细胞表面的大部分区域（图 1E、G）。</li>
	<li>在软件中设置消融程序。设置一帧图像采集，随后进行刺激，再进行另一帧图像采集。</li>
	<li>将刺激激光功率从较低值开始设置（10%–20%），然后运行刺激程序。成功的消融可在细胞胞体中心的 ROI 位置观察到一个清晰的圆形区域，并且 ROI 周围荧光增强（图 1F）。
	<ol>
		<li>如果消融未成功，仅导致细胞漂白（图 1H），则每次将激光功率增加 5% 或循环次数增加 1 次，然后重新运行程序。本方案所用系统的激光功率范围为 10% 至 40%。 
		​注意：消融所需的激光功率设置在很大程度上取决于细胞在组织中的深度以及其他因素（如角质层折叠情况）。若细胞明亮且清晰可见，则所需激光功率处于该范围的较低端。不同系统因激光器型号和使用年限不同，其所需激光功率也会有所差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="果蝇神经系统中的GFP表达；荧光显微镜揭示神经结构；图示面板。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在完整生物体中鉴定用于激光消融的神经元 果蝇 L3期幼虫 (A) 脑内巨大纤维（GF）胞体位置及腹神经索（VNC）内包含胸-转节肌运动神经元（TTMn）的运动神经元簇的示意图。BshakB（致死型）-Gal4 驱动 GFP 在幼虫腹神经索中表达的最大强度投影。虚线表示中线。圆圈标示包含TTMn并作为激光消融靶点的神经元簇。比例尺： 50 µm. (C) 在 A307-Gal4 驱动下表达 GFP 的幼虫大脑部分投射图。圆圈指示的是靶向激光消融的 GF 胞体。比例尺： 50 µm. (D) R91H05-Gal4 驱动 UAS-GFP 的脑部最大强度投影。两个GF（圆圈）均可通过位置、形状和大小进行识别。比例尺： 50 µm. (E) GF胞体激光消融前的放大视图。品红色圆圈指示激光消融的目标区域。比例尺： 10 µm. (F) 激光局部照射并成功消融后，GF 胞体的放大视图。比例尺： 10 µm. (G) GF胞体激光消融前的放大视图。品红色圆圈指示激光消融的目标区域。比例尺： 10 µm. (H) GF胞体在局部激光照射后未成功消融（漂白）的放大视图。比例尺： 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
6. 回收幼虫
<ol>
	<li>成功消融细胞后，取下盖玻片，用画笔轻轻将幼虫从载玻片上拾起，放入食物管中。幼虫将在30分钟内重新开始爬行。 
	注意：缩短操作时间可提高动物的存活率。熟练后，实验可在不到10分钟内完成。</li>
	<li>在标准条件下继续培养幼虫，直至其从蛹壳中羽化。</li>
</ol>
7. 在成年果蝇中测试GFS的功能性
注意：以下步骤在Allan和Godenschwege12以及Augustin等13的研究中已有详细说明。
<ol>
	<li>在羽化后2-5天对成年果蝇进行测试。用CO2麻醉果蝇，并通过将足插入牙科蜡中将其固定。将翅膀展开至90°角，并用蜡固定。通过将喙插入蜡中固定头部。</li>
	<li>将刺激电极插入两只眼睛，接地电极插入腹部，并将玻璃记录电极插入两侧的跳跃肌肉（TTMs）。</li>
	<li>使用单次刺激激活GF神经回路，以测量两侧肌肉的反应潜伏期。分别使用100 Hz和200 Hz的刺激串激活该回路，以测量两侧肌肉的跟随频率能力。</li>
</ol>
8. 巨大纤维系统的解剖与标记，用于共聚焦成像
注意：果蝇中枢神经系统解剖和染料注射步骤详见 Boerner 和 Godenschwege14。
<ol>
	<li>用镊子轻轻将果蝇从牙科蜡上取下，并在解剖显微镜下转移至铺有硅胶弹性体的培养皿中。</li>
	<li>用剪刀去除果蝇的足、翅和喙，并用昆虫针将果蝇背面向上固定在弹性体涂层上。</li>
	<li>从腹部中段开始，沿中线向头颈部方向做一侧切口，贯穿整个胸部并延伸至颈部，使胸部与头部相连。用昆虫针将果蝇展开，去除体内的器官和腺体，注意不要损伤神经系统。 
	注意：此时可向巨纤维（GF）轴突注射染料，以标记巨纤维及其电耦合的神经元13。</li>
	<li>去除头部的头壳，暴露脑组织。</li>
</ol>
9. 神经系统的免疫组织化学
<ol>
	<li>中枢神经系统解剖后，在室温下用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）固定果蝇45分钟，随后在室温下用PBS清洗20分钟，共清洗3次。</li>
	<li>在含3%牛血清白蛋白（BSA）和0.5%去污剂的PBS溶液中，于室温下封闭样本1小时。</li>
	<li>在含3% BSA和0.3%去污剂的PBS溶液中，加入兔抗GFP抗体（1:500），于4 °C孵育2至3个夜晚。随后在室温下用PBS清洗20分钟，共清洗6次。</li>
	<li>在PBS中加入Alexa 488标记的抗兔二抗，于4 °C孵育过夜。随后在室温下用PBS清洗20分钟，共清洗6次。</li>
	<li>使用递增浓度的乙醇系列（50%、70%、90%、100%乙醇）对样本进行脱水处理，每步10分钟。移除固定针，并切除腹部和飞行肌。将包含神经系统的胸段其余部分转移至载玻片上，用甲基水杨酸酯等封片剂覆盖，加盖盖玻片，并用指甲油封片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜对神经系统成像，以分析巨纤维（GF）末端的解剖结构。</li>
</ol>

Single-Neuron Ablation in Drosophila for Studying Nervous System Adaptation

<ol><li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A+Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Bower, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+branching+has+conserved+needs+for+local+parasympathetic+innervation+but+not+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission.</a> BMC Biol. 12, 92(2014).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+Development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).</li>
<li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binocular+interaction+in+striate+cortex+of+kittens+reared+with+artificial+squint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).</li>
<li>Wiesel, T. N., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+unilateral+and+bilateral+eye+closure+on+cortical+unit+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+giant+fiber+neuron+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+%28GFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+d.+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster.</a> J Vis Exp. (47), e2412(2011).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+preparation+of+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord+for+giant+fiber+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection.</a> J Vis Exp. (52), e3080(2011).</li>
<li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutation+in+shaking-b+eliminates+electrical%2C+but+not+chemical%2C+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%3A+A+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study.</a> J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).</li>
<li>Kennedy, T., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+electrically+coupled+neurons+support+development+of+the+Drosophila+giant+fiber+model+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit.</a> eNeuro. 5 (6), 0346(2018).</li>
<li>Mcfarland, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+arrival+times+and+physical+occupancy+establish+visual+projection+neuron+integration+on+developing+dendrites+in+the+Drosophila+optic+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用双光子显微镜进行细胞消融被证明是一种高效调控果蝇（Drosophila）神经环路发育的方法。由于该方法具有非侵入性，对动物造成的损伤极小。实验数据支持这种针对已知神经环路的细胞特异性操控具有良好的应用价值。
消融成功的关键在于选择最合适的Gal4驱动系。由于巨纤维系统（GFS）已被广泛研究，已有多种特异性的Gal4驱动品系被报道7。大多数Gal4驱动表达范围非常局限，但仍会在许多其他神经元中表达。一个挑战是在完整动物体内可靠地识别靶细胞。对于GFP标记清晰可见的个体，可在较低激光功率下进行消融，通常仅需一次尝试即可完成。而在脑部被脂肪组织覆盖或GFP表达较弱的个体中，靶细胞的清除则需要更高的激光功率，并进行多次激光照射循环。巨纤维（GF）细胞体位于大脑背侧约100 µm深度处。对于靶细胞位置更深的实验，可在幼虫发育早期阶段进行消融，此时神经系统体积较小，可能更为有利。
在实验室先前的实验中，探索了不同的细胞消融方法。利用UAS/Gal4系统驱动毒素表达也可导致特定神经元的缺失。然而，这种方法更难实现单个细胞的精确删除，并避免脱靶效应。另一个难点在于精确控制细胞删除事件的发生时间。激光细胞消融技术能够对靶向位置和删除时间实现精确控制，但在该方法被完善并达到超过80%的成功率（动物存活和成功细胞消融）之前，仍存在一些需要克服的挑战。动物的存活率受到乙醚暴露时间过长以及操作时间过长的负面影响。研究表明，将三龄期 Drosophila 幼虫暴露于乙醚3.5分钟，可实现较高的化蛹存活率（78%）和羽化为成虫的存活率（67%）10。暴露3.5分钟可确保动物在长达8小时内保持不动。而对于激光细胞消融实验，动物只需保持不动30分钟或更短时间。因此，乙醚暴露时间可远低于3.5分钟。在大多数情况下，幼虫在1分钟内即可完全不动。
激光消融实验结果表明，可以清晰地消融GF，并且易于评估对侧邻近GF所受到的影响。消融结果明确且一致。在15次单细胞消融实验中的13次，剩余的GF配对细胞表现出双侧终末结构，而这种结构在对照动物中从未观察到。该双侧对称的终末结构易于识别，异常的对侧分支大小与正常终末相似，并且通过染料偶联连接至对侧的目标运动神经元。该双侧终末与两个目标运动神经元均存在染料偶联，在大多数样本中功能接近野生型，能够驱动正常的同侧目标以及对侧目标运动神经元，其潜伏期和跟随频率均接近对照组数值。
互补实验中，单侧消融目标运动神经元可提供有趣的对比。剩余的运动神经元常表现出反应性树突生长，其突起跨越中线延伸至通常由被删除邻近神经元占据的空间。尽管该树突不如被删除的树突粗大，但其反应与缺失双侧配对的巨纤维（GF）相似。相比之下，现在失去靶标的GF对缺失靶标的反应较微弱，仅在中线处以及沿剩余运动神经元的树突上延伸出少量突起。这种微弱反应与GF在缺失双侧同源GF时的显著反应形成鲜明对比——后者会形成一个巨大的对侧终末，以补充正常终末并构成双侧终末结构。
最近在脑内对GF的突触前输入进行了平行消融实验，其中采用了一种类似类型 &#34;竞争&#34; 突触间隙的结构得以揭示17GF上的视觉输入在VPN投射到GF树突的肾小球区域呈镶嵌分布。删除其中一组VPN（本例中为基因手段）表明，剩余的VPN会接管并支配部分缺失邻居的突触空间，从而对逼近刺激的视觉反应产生生理上的代偿性恢复。当最早到达的传入纤维被删除后，较晚到达的纤维会占据原本未被占用的空间。本研究与现有工作之间最主要的现象学相似性在于，物理占据在决定不同输入之间平衡中的明显作用。两个GF的输出末梢似乎在争夺物理突触空间上相互竞争。

激光消融是研究多种生物神经回路的首选工具。该技术最初在蠕虫和果蝇等模式遗传系统中发展起来，现已广泛应用于动物界，以研究神经系统的结构、功能和发育过程1,2,3。本文采用单个神经元消融技术，探究神经元在果蝇神经回路组装过程中如何相互作用。Drosophila的逃逸系统是常用的回路分析模型，因其包含成年果蝇中最大的神经元和最大的突触，且该回路在过去的几十年中已被深入表征4。本研究的重点是神经元间相互作用在巨纤维回路组装中所起的作用。
自20世纪60年代Hubel和Wiesel的研究以来，神经科学领域一直关注的一种相互作用是 &#34;突触竞争&#34;5,6在本方案中，采用激光消融技术，通过巨大纤维系统（GFS）中的单细胞消融重新探讨竞争的作用。 果蝇，可能在其中发现这些现象的分子基础。
在发育中的果蝇中消融神经元一直存在多种困难，包括难以观察目标神经元、消融方法的精确性以及样本的存活率。为了解决GFS中的这些问题，采用UAS/Gal4系统7来标记目标神经元，并利用双光子显微镜去除突触前的巨纤维或突触后的跳跃运动神经元（TTMn）。
在本研究中，为了确定邻近的双侧神经元在调节巨纤维系统（GFS）中的突触连接性和突触强度方面所起的作用，在蛹发育阶段开始前选择性地删除了一侧的双侧配对神经元（即突触前巨纤维（GF）或突触后运动神经元）。在此发育阶段，GF轴突的发生尚未完成8。随后检测成虫中突触回路的GF结构与功能，尤其关注剩余GF的输出情况。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 山羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jaxkson ImmunoResearch</td><td>111-545-003</td><td></td></tr><tr><td>抗绿色荧光蛋白，兔源抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11122</td><td>1:500 浓度</td></tr><tr><td>Apo LWD 25x/1.10W 水浸长工作距离物镜</td><td>尼康</td><td>MRD77220</td><td>水浸长工作距离</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>西格玛</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ti:Sapphire Vision II 激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉球</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td></td></tr><tr><td>Dextra, 四甲基罗丹明, 10,000 MW, 赖氨酸可固定 (fluoro-Ruby)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D1817</td><td></td></tr><tr><td>果蝇生理盐水</td><td></td><td></td><td>配方来自 Gu 和 O'Dowd, 2006</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>E134-1</td><td>危险，易燃液体</td></tr><tr><td>果蝇食物 B (布卢明顿配方)</td><td>LabExpress</td><td>7001-NV</td><td></td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>O3695-500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 18x18 #1.5</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>Neurobiotin 示踪剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1120</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R 多光子显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td>安装于直立式 FN1 显微镜支架上</td></tr><tr><td>NIS Elements 高级研究软件</td><td>尼康</td><td></td><td>图像采集与数据分析软件</td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (磷酸盐缓冲盐水)</td><td>赛默飞世尔生物试剂</td><td>BP2944-100</td><td>片剂</td></tr><tr><td>R91H05-Gal4</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>40594</td><td></td></tr><tr><td>shakB(lethal)-GAl4</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>422355000</td><td>去垢剂溶液</td></tr><tr><td>UAS-10xGFP</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>32185</td><td></td></tr></tbody></table>

完整组织中的激光细胞消融 果蝇 幼虫揭示突触竞争

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

该方案描述了在完整中枢神经系统（CNS）中利用双光子激光系统进行单个神经元消融的方法 黑腹果蝇 幼虫。利用这种非侵入性方法，可实现对发育中神经系统的细胞特异性操控。通过破坏神经网络中单个神经元的发育，可用于研究神经系统如何补偿突触输入的缺失。在巨大纤维系统中对单个神经元进行特异性消融 果蝇，重点关注两个神经元：突触前的巨纤维（GF）和突触后的胸-转节肌运动神经元（TTMn）。GF与同侧的TTMn形成突触连接，该连接对逃逸反应至关重要。在3龄幼虫中消融其中一个GFrd 在幼虫脑中，当巨纤维（GF）刚开始轴突生长时，永久性地移除该细胞，会导致中枢神经系统（CNS）发育过程中该细胞缺失。剩余的GF对缺失的邻近细胞产生反应，并向对侧TTMn形成异位突触终末。这种非典型的、双侧对称的突触终末通过染料偶联实验被证实可同时支配双侧TTMn，并通过电生理检测证实可同时激活两个运动神经元。综上所述，单个中间神经元的消融揭示了双侧成对神经元之间的突触竞争，这些神经元能够补偿其中一个神经元的缺失，并恢复逃逸环路中的正常反应。

该方法可用于操控果蝇（Drosophila）神经系统中特定神经元网络的发育。本研究的核心问题是突触连接的形成。通过去除突触前的GF神经元或突触后的TTMn神经元，可研究该中枢突触的反应性突触发生过程，以及对突触功能和发育至关重要的分子机制。如实验方案所述，对其中一个GF神经元或一个TTMn神经元进行激光消融，随后分析果蝇在蛹发育阶段结束后成虫中突触的变化情况。
为确保该操作对动物存活无负面影响，同时进行了假手术消融对照实验。在假手术消融中，动物的处理方式与实验组动物相同，但激光脉冲的输出功率设置为0%。在82.4%的情况下，接受假手术消融的动物能够发育为成年果蝇。假手术消融果蝇的巨纤维（GF）能够以低于1 ms的潜伏期作出反应，并对79.3%的刺激实现100 Hz频率的跟随。其巨纤维的解剖结构与未经处理的果蝇无差异。
对于每只实验动物，均通过解剖学方法验证消融效果。在消融了巨纤维（GF）的动物中，对未消融的GF进行染料注射并成像（见下文）。若在颈连合（CvC）中仅观察到一条GF轴突，则认为另一侧GF已成功消融。此外，也可通过脑部消融侧缺乏GFP标记的胞体来确认消融效果（图2A，圆圈所示）。为评估TTMn的消融情况，分析了成年腹神经索（VNC）中的GFP信号，其中TTMn的胞体和树突易于识别。由于一侧TTMn的胞体和树突缺失，其消融情况可被明显识别（图2B，圆圈所示）。
为了检测处理后果蝇中GFS的功能，记录跳跃肌的突触电位12,13，这些肌肉由TTMn支配，被记录下来（图3A）。GFs 与 TTMn 的内侧树突形成混合性电-化学突触15。GF末端无分支，并在突触区域表现出典型的侧向弯曲，与TTMn树突相对图3D, 图4A 箭头所示）。在对照组果蝇中，每个巨纤维（GF）仅支配同侧的运动神经元。通过记录TTM纤维的反应，在1 Hz刺激下分析反应潜伏期，并在100 Hz刺激下分析跟随频率，以评估连接强度（图3B，C）。对照组果蝇的平均反应潜伏期小于1毫秒，且能够对78.1%的刺激跟随100 Hz的刺激频率图3B）。生理记录完成后，解剖标本以暴露中枢神经系统（CNS）和巨纤维（GF），并使用TRITC-葡聚糖与神经生物素的混合物对两者进行染料注射。较大的葡聚糖分子可标记GF轴突及其终末，但不能通过缝隙连接。神经生物素则可穿过GF与TTMn之间的缝隙连接，并在突触后树突中检测到神经生物素信号（图3E，F，箭头所示）。该 Neurobiotin 染料偶联证实了两个神经元之间存在电耦合。在腹神经索（VNC）中许多其他通过缝隙连接与巨纤维（GF）相连的神经元中，也可检测到 Neurobiotin16 (图3E，F).
在L3中消融一个巨纤维（GF）后，进行了相同的生理学和解剖学检测。消融果蝇中大部分剩余GF（15个中的13个）的轴突末端分裂为两个分支：一个位于通常的同侧位置，另一个穿过中线到达与完整GF对侧相对应的同源位置（图3G，箭头）。每个分支均通过染料耦合与一个TTMn树突相连（图3H，I，箭头）。来自TTM的生理记录证实了单个GF与两个TTMn之间存在突触连接，尽管连接强度弱于正常情况。两侧TTM的反应潜伏期均大于1 ms，在100 Hz刺激下的跟随频率分别为：与完整GF同侧的TTMn为37.1%，对侧TTM为28%（图3C）。
由于消融一个巨纤维（GF）会导致剩余的GF支配两个靶神经元，因此接下来的实验旨在观察当其中一个GF缺乏正常的同侧靶运动神经元时，邻近GF的反应。在本实验中，删除了一个突触后神经元，并评估了剩余TTMn的解剖结构和功能以及GF终末的形态。在成年对照动物中同时观察两个TTMn和GF时，假定的突触接触区域清晰可见（图4A，箭头所示）。每个TTMn的内侧树突均与同侧GF的突触前终末相对。来自两侧TTMn树突的小突起与中线相接触（图4C；插图）。使用Neurobiotin进行染料偶联时，在两个TTMn中均明显可见染料信号（图4D，箭头所示）。
当消融一个TTMn时，剩余TTMn的内侧树突形态发生变化。在这些样本中，内侧树突延伸出一条长而粗的分支，跨越中线（图4I,K；黄色箭头）。此外，还向前延伸出较细的投射，朝向两个GF终末（图4E,G；黄色箭头尖端）。位于TTMn同侧的GF表现出其典型的解剖结构，其终末沿TTMn树突投射。
缺乏靶向运动神经元的“孤立”GF（巨纤维）的反应是本研究的主要关注点。在大多数情况下（61.5%的动物），孤立的GF表现出分叉的终末，其中一个终末位于同侧，另一个终末则穿过中线，投射至对侧TTMn树突方向（图4J，箭头）。这些交叉的GF分支总是比在互补实验中邻近GF被消融时观察到的分支更细小（图3F）。同侧终末与跨越中线延伸的TTMn分支形成接触（图4I，黄色箭头）。在23%的标本中，孤立的GF穿过中线（图4F，箭头），并沿其中一条TTMn前侧分支走行（图4E，黄色箭头头），且与残留的TTMn存在染料偶联（图4H，箭头头）。
在TTMn消融果蝇中还观察到另外两种表型（图4M）。在13只果蝇中的1只，两条GF均形成了正常的弯曲，并停留在神经系统的同侧。在另一种情况下，孤立法兰克氏纤维（orphaned GF）表现出无弯曲表型，即孤立法兰克氏纤维未形成终末分支，并在通常发生弯曲的区域之前停止生长。对于这四种表型，保留完整TTMn一侧的TTM记录结果与野生型（WT）生理特征相当，反应潜伏期低于1毫秒，在100%或接近100%刺激强度下可跟随100 Hz的刺激频率。移除一个靶细胞后，两条GF可共享剩余的靶向TTMn。在大多数情况下，两条GF均会与剩余的TTMn建立连接。通常，孤立法兰克氏纤维会表现出双侧终末分支。在对照果蝇中，GF从不跨越中线；然而，在约85%的TTMn消融果蝇中，其中一条GF会跨越中线以接触对侧的TTMn。单个TTMn被两条GF支配并不会对突触功能产生负面影响。
值得注意的是，邻近的巨纤维（GF）缺失所产生的影响大于目标运动神经元缺失的影响。在对侧GF缺失的情况下形成的双侧终末结构，比目标神经元移除时发生的变化更为庞大且功能上更加显著。
<img alt="荧光显微镜，果蝇脑和腹神经索，A307:GFP，shakB::GFP，神经通路示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：成年中枢神经系统中成功消融的示例。（A）幼虫期巨纤维（GF）消融后成年果蝇脑的最大强度投影图像。GFP（绿色）由A307-GAL4驱动表达。圆圈标示了被消融的GF缺失区域。箭头指示脑另一侧仍存在的、表达GFP的GF。GF内填充了TRITC-葡聚糖（红色），其轴突向后投射至腹神经索（VNC）。比例尺：20 µm。（B）在三龄幼虫期消融了一个TTMn后，成年腹神经索（VNC）的最大强度投影图像。剩余的TTMn（箭头）在shakB(lethal)驱动下表达GFP。圆圈标示了缺失TTMn的区域。比例尺：20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理数据、染料灌注和显微镜结果的神经消融实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：幼虫期消融一条巨纤维（GF）会导致另一条未消融GF的突触前末梢出现双侧分支。（A）用于检测成年个体巨纤维系统（GFS）结构与功能的实验装置示意图。记录电极用于测量完整动物脑部受到刺激后，胸-转节肌运动神经元（TTMn）在胸-转节肌（TTM）上的反应潜伏期和跟随频率。在解剖神经系统后，将染料注入颈部连接处（CvC）的GF轴突中。（B,C）TTM反应潜伏期和100 Hz刺激下的跟随频率的代表性记录（n表示每种情况下记录的TTM数量，图中显示平均潜伏期和跟随频率）。（B）具有两条完整GF的对照组动物表现出低于1 ms的TTM潜伏期，且在100 Hz刺激下跟随频率接近100%。（C）消融后仅存的一条GF支配双侧TTMn。两条TTMn的潜伏期均长于对照组，在100 Hz刺激下的跟随频率显著降低。（D–I）染料填充GF的共聚焦图像堆栈的最大强度投影。TRITC-葡聚糖（D,G,F,I，红色）和神经生物素（E,H,F,I，灰色）共同注射。神经生物素可通过GF与TTMn之间的缝隙连接，标记突触后神经元。虚线表示中线。（D）对照组动物典型的GF解剖结构，显示末端弯曲。（E,F）神经生物素标记了多个与GF电耦合的突触后神经元。箭头指示跨突触标记的TTMn树突。（G）消融后，剩余的GF生长出额外的终末分支（箭头），跨越中线以支配对侧TTMn。（H,I）两个TTMn（箭头）均通过染料耦合至同一条GF。比例尺：20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="突触连接的神经成像分析；显示GFP荧光和神经生物素检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4。幼虫期消融一个胸-转节肌运动神经元（TTMn）会导致两个巨纤维（GF）均支配剩余的TTMn。（A-L）在shakB(lethal)-Gal4调控下用GFP（绿色）标记TTMn，并用TRITC-葡聚糖（品红色）和神经生物素（红色）染料填充GF，获得的共聚焦图像堆栈的最大强度投影图。虚线表示神经系统的中线。（A-D）双侧TTMn均完整的对照样本。GF在接近中线时形成典型的终末弯曲以接触TTMn（A,B），且每个GF仅接触一个TTMn。TTMn的树突在中线处相遇（C）。每个GF与其对应的TTMn之间存在染料偶联（D，白色箭头）。（E-H）左侧TTMn被消融。剩余TTMn的内侧树突跨过中线延伸（G，黄色箭头）。失去原有靶细胞的GF在突触区域穿过中线（白色箭头），并与对侧TTMn的树突形成连接（E,F）。GF与剩余的TTMn之间存在染料偶联（H，箭头）。（I-L）另一类GF表型示例，其中左侧TTMn被消融。剩余TTMn的内侧树突跨过中线延伸（I 和 K，黄色箭头）。左侧失去靶细胞的GF形成双侧终末分支：一支跨至对侧，另一支保留在同侧（J，箭头），并与TTMn相连。比例尺：20 µm。（M）TTMn消融动物中观察到的四种不同GF表型的示意图。n表示每类动物的数量。给出的是完整侧TTMn对应的TTM反应潜伏期和100 Hz跟随频率（FF）的平均值±标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案展示了在完整的Drosophila幼虫中对单个神经元进行激光细胞消融的技术。该方法可用于研究在发育中的神经系统中降低神经元之间竞争所产生的影响。

该方案描述了在完整的黑腹果蝇幼虫中枢神经系统（CNS）中，利用双光子激光系统进行单个神经元消融的方法。

我们正致力于理解发育过程中神经环路组装的潜在机制，并利用果蝇等简单的神经系统来研究这一问题。其中一种机制是突触竞争在环路组装中的作用，而本文正是聚焦于这一问题。神经科学领域中一项令人兴奋的新兴技术被称为光遗传学。它利用光敏感离子通道，通过光脉冲开启或关闭神经元。这些新方法使我们能够以新的方式控制神经回路，并将突变的回路与行为联系起来。在活体动物中消融单个神经元，使我们能够阐明竞争在简单神经回路组装过程中的作用。现在我们可以筛选出介导这一普遍现象的分子机制。我们证明了这两个巨大神经元之间为与靶向运动神经元形成突触连接而存在的竞争性相互作用。这一结果在动物界广泛存在，尤其在脊椎动物视觉系统中表现明显，该现象最初正是在该系统中被发现的。这为在遗传学上易于操作的生物（如果蝇）中研究调控这种竞争的分子奠定了基础。我们将利用光遗传学这一新方法，加深对介导逃避行为的神经环路的理解。同时，我们也将利用对神经环路的认识，进一步阐明这些新型光遗传学工具的作用机制。首先，取一个带紧密盖子的玻璃培养皿。将一个棉球放入培养皿中。在通风橱下，向棉球中加入3至5毫升乙醚。立即用盖子盖上培养皿。使用画笔从果蝇培养瓶中挑取黑腹果蝇的三龄幼虫。将一条幼虫转移至一个小的开口容器中。将容器放入盛有乙醚的玻璃培养皿中，并立即紧密盖好。每30秒使用解剖显微镜检查幼虫的活动性。将麻醉后的幼虫转移至玻璃载玻片上。将幼虫浸入一滴昆虫生理盐水中。在解剖显微镜下，用纸巾吸去大部分生理盐水。进行巨纤维消融时，将幼虫背侧朝上放置；进行TTMn消融时，则腹侧朝上放置。然后缓慢将玻璃盖玻片盖在幼虫上。从盖玻片边缘加入生理盐水，以填充载玻片与盖玻片之间的空隙。进行巨纤维消融时，使用解剖显微镜在高倍放大下检查脑部的位置。确保脑组织平放，并可通过角质层清晰观察。若脑组织被脂肪组织覆盖，可用镊子轻轻按压盖玻片，并左右移动盖玻片以移开脂肪组织。将样本置于多光子显微镜载物台上。使用 GFP 滤光片在落射荧光模式下定位样本。对于巨大纤维的消融，需聚焦于目标细胞，然后切换至双光子模式。将激光设置为870纳米，并调节探测器增益，通过检流计扫描器观察表达GFP的细胞。使用圆形兴趣区域定义消融范围。接下来，在软件中设置消融程序。为此，依次设置一个刺激采集帧，随后再设置另一个采集帧。将刺激激光功率从较低值开始，运行刺激程序。如果消融未成功，仅漂白了细胞，则每次将激光功率增加5%或增加循环次数一次，然后再次运行该程序。重复此操作直至观察到细胞消融成功。成功消融细胞后，移去盖玻片。用毛笔轻轻从载玻片上拾取幼虫。然后将幼虫转移至食物管中。在巨纤维消融样本中，通过消融侧脑部缺少GFP标记的胞体来确认消融效果。对于TTMn消融的幼虫，由于一侧缺少胞体和树突，因此TTMn的缺失易于识别。

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