用于研究香烟烟雾提取物刺激下小鼠气道上皮细胞分化及多组学变化的体外模型

本研究的目的是建立并表征一种利用气道上皮细胞的体外模型，以研究长期暴露于香烟烟雾提取物（CSE）的影响。我们旨在阐明气道上皮细胞在长期香烟烟雾暴露下的细胞应答机制，这一过程与慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发病机制密切相关。近年来，认识到COPD中复杂的上皮细胞与免疫细胞相互作用，被认为是该领域研究的关键进展之一。

我们建立了一种新型的体外模型，可模拟气道上皮细胞长期暴露于香烟烟雾提取物（CSE）的环境。我们的研究结果为探索慢性香烟烟雾暴露对气道上皮细胞的长期影响及其在慢性阻塞性肺疾病（COPD）进展中的作用开辟了新的途径。未来，我们实验室将致力于深入研究调控上皮细胞分化的具体通路，以及各类上皮细胞异质性在COPD治疗反应中的作用。

首先，在生物安全柜的工作台上准备好新配制的扩增培养基、经滤膜除菌的蛋白酶和抗生素溶液，以及已灭菌的外科手术器械。将大鼠尾胶原加入100毫米培养皿和24毫米Transwell小室中。将培养皿在紫外灯下敞口放置过夜，以进行灭菌。

将安乐死的小鼠浸入75%乙醇中进行消毒，但不要浸没鼻部和口腔。使用手术剪和镊子，从小鼠下颌开始沿腹部剪开并暴露腹腔。

使用另一套手术剪和镊子，分开两侧的甲状腺并去除气管、周围肌肉组织与食管之间的连接。接着，小心切开胸部，并用镊子深入胸腔。取出整个肺，并找到气管的末端。

从甲状软骨到气管支气管分叉处切取气管，并将其置于含有四种抗生素的预冷扩增培养基中。将试管轻轻振荡，以尽可能冲洗掉气管表面的血液，然后将其放置于冰上。随后，将气管转移至含有四种抗生素的预冷磷酸盐缓冲液（PBS）中。

使用手术剪和镊子清除气管表面的血块和其他组织，并将其剪成一平方厘米大小。将气管组织置于蛋白酶溶液中，37°C 条件下孵育。40 分钟后，轻轻摇动离心管数次，使用 40 微米细胞筛去除残留组织。

用5毫升扩增培养基在滤筛上冲洗切碎的气管组织。将气管悬液在4°C下以400×g离心5分钟，然后将沉淀重悬于8毫升扩增培养基中。

使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞。将P0代细胞悬液接种于预先包被大鼠尾胶原的100毫米培养皿中。在37°C、5% CO₂条件下培养细胞。

当小鼠气管上皮细胞形成具有鹅卵石样外观的完整单层时，用三毫升预温的 PBS 轻轻冲洗细胞。向培养皿中加入三毫升无动物成分的酶解离溶液，在 37 摄氏度下孵育五分钟。轻轻吹打以悬浮细胞，并将细胞悬液转移至三毫升无动物成分的酶抑制溶液中。

将细胞悬液在4°C下以400g离心5分钟。用1毫升扩增培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝和血细胞计数板对活细胞进行计数。

将P1代细胞悬液接种于预先包被大鼠尾胶原的100毫米培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。当原代小鼠气道上皮细胞达到80%融合度时，将细胞接种至包被大鼠尾胶原的玻璃盖片上。

然后加入多聚甲醛固定细胞，固定12小时。用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟，随后在PBS中加入3%牛血清白蛋白和0.1%Triton X-100，室温孵育1小时。将抗全角蛋白抗体以1:500的稀释度加入载玻片，并在4摄氏度下孵育过夜。

第二天，将此载玻片用 PBS 溶液洗涤三次，每次五分钟，随后在避光条件下加入二抗（按1:1,000稀释），孵育两小时。用 PBS 洗涤载玻片后，加入 DPI（按1:1,000稀释），孵育15分钟。最后用 PBS 洗涤载玻片一次，每次五分钟。

在荧光显微镜下观察载玻片，将表达模式与阳性对照和阴性对照进行比较。消化后离心，用适量扩增培养基重悬P2期细胞。用移液器将一毫升细胞悬液加入transwell聚碳酸酯膜插入物的上室中。

向Transwell的基底室中加入1.5毫升增殖培养基。将细胞在37摄氏度下孵育，直至达到汇合状态。使用以下组分配制50毫升完全分化培养基。

将一支香烟通入12.5毫升分化培养基中起泡处理，然后经0.22微米孔径滤膜过滤，以制备香烟烟雾提取物（CSE）。为确保不同实验之间以及不同批次CSE的标准化，需使用分光光度计在320纳米波长处测定其吸光度。

接下来，从Transwell的顶端和基底室中移除扩增培养基。加入含有适当浓度CSE的分化培养基，以刺激原代小鼠气道上皮细胞，持续培养28天。在培养期间，每周用PBS清洗顶端室两次，并用新鲜配制的含CSE的分化培养基更换基底室中的培养基。原代小鼠气道上皮细胞在气液界面成功分化，历时28天。

通过免疫荧光法检测纤毛标志物乙酰化α-微管蛋白和杯状细胞标志物黏蛋白5AC，证实了纤毛细胞和杯状细胞的存在。在24小时不同CSE浓度下的细胞活力检测结果显示，当浓度高于6%时，上皮细胞数量下降。长期刺激下的细胞活性显示，在2%、4%和6% CSE浓度下均无明显细胞死亡，但跨膜电阻和脱落细胞数量发生了变化。

此外，当小鼠气道上皮细胞培养物长期暴露于香烟烟雾提取物（CSE）时，观察到分化细胞和纤毛细胞总体减少。