利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

白血病干细胞是白血病中一种稀有的细胞亚群，负责疾病的长期维持和复发。我们的目标是更深入地表征这些细胞，以寻找靶向并清除它们的方法，从而改善患者的预后。包括白血病干细胞在内的肿瘤干细胞处于静息状态或缓慢增殖状态，这可能使其逃逸抗增殖类抗癌治疗。

理解细胞的静息状态将有助于识别白血病干细胞的潜在弱点，并发现新的靶向治疗策略。通过本方案，我们可以从T细胞急性淋巴细胞白血病的斑马鱼模型中鉴定并分离出处于静息状态的白血病细胞。这些细胞可用于后续应用，例如体内药物筛选、转录组学分析以及蛋白质组学分析。

首先，在37摄氏度水浴中轻轻振荡，解冻含有1毫升冷冻GFP标记的斑马鱼TALL细胞的冻存管。随后，缓慢将管内液体转移至含有4毫升冰上鱼细胞培养基的15毫升锥形管中。在4摄氏度下以2,500 ×g离心5分钟，弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于0.5毫升鱼细胞培养基中。

向含有10微升台盼蓝染料的微量离心管中加入10微升细胞悬液。充分混匀后，取10微升转移至血细胞计数板，于显微镜下计数细胞。接着，将麻醉后的成年CG1斑马鱼腹面朝上固定。

使用 Hamilton 微量注射器，将 5 至 6 微升细胞悬液注入腹腔内。移植后约 21 至 28 天，评估麻醉后的斑马鱼体内 GFP 标记的白血病细胞所占百分比。为收获白血病细胞，将安乐死后的斑马鱼转移至新的培养皿中，并加入 1 毫升鱼类培养基，以作为细胞的缓冲液。

使用剃刀刀片，首先将斑马鱼断头，然后研磨组织。通过移液器反复吹打，以分散较大的细胞团块。将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中，以获得单细胞悬液。

首先，将 10 的 6 次方个荧光标记的斑马鱼 TALL 细胞收集到 1.5 毫升微量离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 2,500 ×g 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 毫升 0.9 倍 PBS 中。取 250 微升细胞悬液加入另一微量离心管中。

然后加入 250 µL 的 0.9 XPBS，使总体积达到 500 µL。加入所需体积的 CTFR 染料储备液，在 37 °C 避光孵育 20 分钟。在室温下以 2,500 ×g 离心 5 分钟。

加入 500 微升鱼培养基以去除多余的染料，再次离心，然后将沉淀重悬于 25 微升鱼培养基中。用台盼蓝对细胞染色，并在显微镜下观察细胞活力。使用优化的 CTFR 浓度对斑马鱼细胞进行染色，同时保留部分肿瘤细胞不染色。

使用 Hamilton 微量注射器，将五微升染色和未染色的细胞悬液注入麻醉后的斑马鱼腹腔内。制备供体板时，将 500,000 个野生型 CG1 斑马鱼细胞转移至 15 毫升锥形管中。加入五毫升鱼类培养基，将细胞储备液稀释至每微升含 100 个细胞。

将50微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中，并将该板置于4摄氏度环境下，直至进行分选。为分选实验的设置准备未染色和单色对照。将对照和样品的细胞悬液通过35微米滤膜帽加入预冷的流式管中，置于冰上。

在 4 摄氏度下，以 2,500 G 离心 96 孔板。小心移除每个孔中的 45 微升上清液，保留 5 微升液体。使用 20 微升移液器重悬细胞，并用 Hamilton 微量注射器将细胞悬液注射到所需数量的 CG1 斑马鱼体内。

在将分选后的细胞移植到CG1斑马鱼中进行极限稀释分析后，CT-FR高表达细胞的白血病干细胞频率是CT-FR低表达细胞的四倍。移植后28天的斑马鱼代表性图像显示，89%的CT-FR高表达斑马鱼发生白血病，而CT-FR低表达组仅为20%。CT-FR高表达斑马鱼发生白血病的潜伏期显著更短。

CT-FR高型斑马鱼的总体生存率显著低于CT-FR低型斑马鱼。