Name: 使用细胞增殖染色鉴定斑马鱼 T 细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静止细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学习使用细胞增殖染色技术鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静止细胞，该方法可分离休眠白血病干细胞用于药物筛选和转录组分析，为靶向治疗提供新策略。

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本研究由美国国家癌症研究所（R37CA227656，授予JSB）提供资助。本研究还得到了肯塔基大学马基癌症中心流式细胞术与免疫监测共享资源（P30CA177558）的支持。

在本实验方案中，我们使用先前在CG1品系中构建的GFP标记的斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞，这些细胞可直接注射到同基因型的CG1斑马鱼受体中15。简言之，通过将rag2:Myc和rag2:GFP质粒DNA显微注射至单细胞期的CG1斑马鱼胚胎中以诱导白血病。注射后3周起，利用荧光显微镜监测动物白血病的发生情况。通过流式细胞分选（FACS）分离GFP阳性的白血病细胞，并将其连续移植到CG1斑马鱼受体中，以获得具有较高白血病干细胞（LSC）频率的克隆。该完整实验方案的详细信息由Blackburn等人15描述。
此外，可通过DNA显微注射斑马鱼胚胎来产生原发性rag2:Myc来源的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）17。将rag2:Myc与一种由rag2启动子驱动的荧光报告基因（如GFP）共同进行DNA显微注射，可导致B细胞、T细胞以及混合型急性淋巴细胞白血病（ALL）的发生18。本实验方案中所使用的白血病克隆此前已确认为T-ALL15。所有涉及斑马鱼的实验操作均经肯塔基大学机构动物照护与使用委员会审查并批准（方案编号：2019-3399）。
1. 斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病细胞的传代培养 体内
<ol>
	<li>在37 °C水浴中轻轻振荡，解冻一管含有1 mL冷冻保存的GFP标记斑马鱼T-ALL细胞的冻存管，直至完全解冻。解冻后立即置于冰上。</li>
	<li>用移液器将管内液体缓慢加入含4 mL鱼培养基（0.9x PBS + 5% FBS）的15 mL锥形管中，以稀释冻存液。</li>
	<li>在4 °C下以2,500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于0.5 mL鱼培养基中，并保持在冰上。</li>
	<li>计数细胞，并根据需要将其稀释至100,000个细胞/5 µL。</li>
	<li>在培养皿中向25 mL鱼系统水中加入200 µL 4 mg/mL麻醉剂（MS-222），以麻醉成年CG1斑马鱼。将CG1鱼腹部朝上固定，使用Hamilton微量注射器向腹腔（IP）注射5–6 µL细胞悬液。将鱼放回养殖缸中，并在恢复正常游动行为后重新接入循环系统。 
	注意：本实验方案中所述的移植研究使用60天龄或以上的成年斑马鱼。</li>
	<li>每周使用荧光显微镜监测一次白血病细胞的生长情况。详见下文第2节中的筛选操作步骤。</li>
</ol>
2. 收集荧光标记的白血病细胞
<ol>
	<li>移植后约21至28天，通过添加麻醉成年CG1斑马鱼 200 µL 在培养皿中，向25 mL鱼类系统水中加入4-5滴4 mg/mL的麻醉剂。</li>
	<li>通过使用落射荧光显微镜并采用适当的滤光片检测GFP荧光，观察CG1斑马鱼中GFP标记的白血病细胞所占百分比，以评估其白血病负荷。当GFP阳性白血病细胞已扩散至全身时，即可进行收获。 &gt;70% 的动物。</li>
	<li>通过在含有9 mL鱼系统水的培养皿中加入1 mL浓度为4 mg/mL的麻醉剂来处死动物。等待所有生命体征完全停止；例如，观察鱼鳃盖运动是否停止（约5分钟）。</li>
	<li>将斑马鱼转移至新的培养皿中，并加入1 mL鱼体培养基，以作为细胞的缓冲液。使用新的剃刀刀片，先将斑马鱼断头，再用同一把刀片研磨组织。通过移液器反复吹打，使较大的细胞团块分散。</li>
	<li>将细胞通过一个 40 µm 将细胞通过细胞筛滤入50 mL锥形管中，以获得单细胞悬液。将细胞置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 细胞增殖染料（CellTrace Far Red）染色浓度及斑马鱼细胞活力的优化
注意：本实验方案中，由于肿瘤细胞带有GFP标记，我们使用了远红细胞增殖染料（CellTrace Far Red）以避免光谱重叠，该染料后文简称为CT-FR。
<ol>
	<li>使用前，根据制造商的建议，用适当体积的DMSO配制1 mM的荧光染料溶液。准备1 mM、0.5 mM、0.1 mM和0.01 mM的工作液；根据需要在鱼培养基中稀释，用于染色后检测细胞活力。</li>
	<li>计数细胞，并将1 × 106个细胞收集至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以2,500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL 0.9x PBS中。</li>
	<li>将细胞悬液均分为四份，每份250 µL，分别用于CT-FR处理。</li>
	<li>向每管中加入250 µL 0.9x PBS，使总体积达到500 µL，每管约含250,000个细胞。</li>
	<li>向上述四管中分别加入所需量的上述工作液，使最终浓度分别为1 µM、0.5 µM、0.1 µM和0.05 µM。在37 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>在室温下以2,500 × g离心5分钟收集细胞。弃去上清液，用500 µL鱼培养基洗涤细胞以去除过量染料。</li>
	<li>再次离心收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于25 µL鱼培养基中。取1 µL细胞悬液与等体积50%台盼蓝按1:10稀释后进行细胞计数。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞活力；活细胞不摄取台盼蓝，在显微镜下呈明亮状态，而死细胞摄取染料后呈暗色。首先在相应的荧光通道下观察以识别肿瘤细胞，然后切换至明场通道评估细胞活力。</li>
	<li>选择能够实现有效染色且保持高细胞活力（>90%台盼蓝阴性细胞）的染料浓度。 
	注意：在本实验测试的斑马鱼T-ALL细胞中，采用1 µM浓度可实现有效染色，且细胞活力>90%。</li>
</ol>
4. 扩增CT-FR染色的T-ALL斑马鱼细胞 体内
<ol>
	<li>使用第3节中优化的CT-FR浓度对斑马鱼细胞进行染色。保留部分肿瘤细胞不染色，用于生成GFP标记的T-ALL肿瘤，作为流式细胞分选（FACS）过程中的GFP阳性对照。将染色和未染色的细胞均稀释至50,000个细胞/5 µL，用于移植。</li>
	<li>在培养皿中，将200 µL的4 mg/mL麻醉剂加入25 mL斑马鱼养殖用水中，以麻醉成年CG1斑马鱼。</li>
	<li>按照第1节所述方法，将5 µL细胞悬液注射至斑马鱼腹腔（IP腔），对染色和未染色细胞均进行注射。每组注射5-6条斑马鱼，以弥补注射后可能发生的死亡情况。</li>
	<li>每周在镇静状态下通过荧光显微镜检查动物两次，观察白血病的发展情况。 
	注意：大约10-14天后，白血病细胞应占据鱼体约30-40%的区域。应在此时间范围内计划进行肿瘤收获及后续分选。等待肿瘤扩大至更大体积可能导致荧光染料信号稀释，难以检测。应根据所选肿瘤模型优化肿瘤收获的时间点。此外，建议增加肿瘤监测频率，以确保准确捕获目标肿瘤大小。</li>
</ol>
5. 准备对CT-FR染色的斑马鱼T-ALL细胞进行分选
<ol>
	<li>准备细胞分选所需的对照样本：无染色对照（未染色、非转基因、单细胞悬液，来自野生型斑马鱼）、GFP标记的T-ALL细胞，以及新近染色的CT-FR野生型（WT）斑马鱼细胞（用于设定远红荧光信号的最大阈值）。</li>
	<li>准备未染色对照和CT-FR染色对照
	<ol>
		<li>通过在含有9 mL养殖水的培养皿中加入1 mL浓度为4 mg/mL的麻醉剂，处死一只未移植的CG1品系野生型（WT）斑马鱼，以收集其细胞。</li>
		<li>将斑马鱼转移至新的培养皿中，加入1 mL鱼类培养基作为细胞缓冲液。使用新的剃须刀片先切除头部，再用同一刀片研磨组织；通过移液器反复吹打以分散大的细胞团块。</li>
		<li>将细胞悬液经40 µm细胞滤网过滤至50 mL锥形管中，以获得单细胞悬液。操作过程中保持细胞置于冰上。</li>
		<li>对于CT-FR染色对照，取250,000个WT细胞转移至微量离心管中，在室温下以2,500 × g离心5分钟形成细胞沉淀。弃去上清液，加入500 µL含1% FBS的0.9x PBS+缓冲液。</li>
		<li>加入0.5 µL的1 mM CT-FR染料原液，使终浓度为1 µM。使用1,000 µL移液器轻柔吹打混匀。在37 °C避光孵育20分钟。</li>
		<li>去除上清液，并用500 µL鱼类培养基洗涤细胞一次，以去除未结合的多余染料。</li>
		<li>再次以离心法收集细胞，弃去上清液后将细胞重悬于500 µL含1% FBS的0.9x PBS+缓冲液中，并经35 µm滤帽过滤至FACS管中。保持样本在冰上待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备供体板 
	注：供体板为96孔V型底板，用于接收来自移植斑马鱼的CT-FR染色T-ALL细胞的分选。每孔预先加入5,000个未染色的WT CG1细胞，溶于50 µL鱼类培养基中，作为载体细胞，有助于后续步骤中分选细胞的沉淀。
	<ol>
		<li>计数500,000个WT CG1细胞，并转移至15 mL锥形管中。</li>
		<li>加入5 mL鱼类培养基，将细胞浓度调整为100个/µL。</li>
		<li>向96孔板的每一孔中加入50 µL细胞悬液。每加完一行后需混匀原细胞悬液管，以维持细胞均匀悬浮。分装完成后将板置于4 °C保存，直至进行分选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备移植鱼样本
	<ol>
		<li>选择T-ALL肿瘤负荷为30–40%的移植鱼。分别收集移植了CT-FR染色细胞和未染色GFP肿瘤细胞的鱼类样本。</li>
		<li>按照第2节所述方法收获细胞。 
		注：由于能保留染料的细胞预期丰度较低，应对CT-FR GFP样本准备分选大量细胞。</li>
		<li>将细胞调整至适合分选的浓度（约3–5 × 106 个细胞/mL），溶于含1% FBS的0.9x PBS+缓冲液中，并经35 µm滤帽过滤至FACS管中。加入DAPI（1 mg/mL）至1:1,000稀释终浓度，作为活细胞排除死细胞的染料。保持样本在冰上。</li>
		<li>对于未染色的GFP肿瘤细胞，取250,000个细胞转移至微量离心管中，在室温下以2,500 × g离心5分钟收集细胞。弃去鱼类培养基，加入500 µL PBS缓冲液，并经35 µm滤帽过滤至FACS管中。保持样本在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 分选
注意：除分选过程中使用外，所有离心管和供体板应全程置于冰上。
<ol>
	<li>在设置分选参数和门控时，首先应用前向散射光和侧向散射光门控，根据细胞大小识别目标细胞并排除细胞碎片。接着，使用前向散射光高度（FSC-H）与前向散射光面积（FSC-A）的关系排除重复细胞，仅保留单细胞。最后，利用无染色对照和单色对照绘制象限，以鉴定GFP阳性及CT-FR阳性细胞群。 
	注意：由于CT-FR对照染色后未经历细胞分裂且为新鲜染色，其荧光强度预期显著高于待分选样本；而CT-FR GFP样本中的细胞在CT-FR阳性门控中通常位于较低荧光强度区域。</li>
	<li>将需移植至每条鱼的细胞数量分选至供体板的一个孔中。 
	注意：本实验采用极限稀释分析法，用于估算CT-FR高表达组与CT-FR低表达组中白血病干细胞（LSC）的频率。该分析设置了25个细胞接种剂量，移植至3只动物；以及10个细胞接种剂量，移植至10只动物。典型的基于斑马鱼rag2:Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）模型的极限稀释分析通常包含较高细胞数量组（如500或1,000个细胞），因为该模型中LSC频率约为每数百个细胞中含1个LSC。然而，本实验采用的是Blackburn等人先前报道的T-ALL克隆之一15，所用样本中LSC频率约为每数十个细胞中含1个LSC；我们预测在接种25个细胞的组别中可检测到白血病发生。在针对您自身疾病模型优化该实验时，应谨慎选择高细胞数量组，以确保肿瘤成功植入。</li>
	<li>分选完成后，将样品板置于冰上，直至准备进行移植。 
	注意：分选过程可能对细胞造成应激，影响细胞活力。在正式开展极限稀释实验前，曾进行预实验以评估分选影响。将分选后的细胞移植并监测白血病发展情况，以判断分选是否对细胞活力产生不利影响。或者，也可在移植前通过台盼蓝染色并在显微镜下观察分选后细胞，评估其活力状态。</li>
</ol>
7. 以极限稀释法移植分选细胞并追踪肿瘤发生
<ol>
	<li>使用台式大容量离心机在 4 °C 条件下以 2,500 × g 离心收集细胞。</li>
	<li>小心从每个孔中移除 45 µL 上清液，每孔保留 5 µL 液体，并注意避免触碰孔底的细胞沉淀。</li>
	<li>用 20 µL 移液器重悬细胞。先重悬 2–3 个孔的细胞，然后使用 Hamilton 微量注射器将各孔中的细胞悬液通过腹腔移植（IP transplant）注入所需数量的 CG1 斑马鱼体内。接着立即重悬下一组孔中的细胞，以防止细胞重新沉降。</li>
	<li>对斑马鱼每周在麻醉状态下进行一次荧光显微镜检查，观察 T-ALL 发展情况，持续至少 6 周。</li>
</ol>
8. 白血病干细胞频率的测定
<ol>
	<li>记录移植后6周时每种细胞剂量和处理组中GFP信号阳性的动物数量，将任何强度GFP信号的动物视为阳性。当GFP信号占据显著白血病负荷时，视为动物具有显著白血病负担 &gt;50% 的身体。</li>
	<li>使用基于网络的 ELDA（极限稀释分析）统计软件（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）19 用于计算每个细胞群体中LSCs的频率。 
	注意：工作流程的示意图如下所示 图1.</li>
</ol>
<img alt="斑马鱼T-ALL细胞扩增、染色、分选；流式细胞术、极限稀释实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：利用细胞示踪染料分离斑马鱼T-ALL模型中静息细胞的工作流程。 对斑马鱼T-ALL细胞进行细胞增殖染料染色，移植至CG1斑马鱼（上图），并根据细胞对增殖染料的保留情况对细胞进行分选（中图）的示意图。收集的细胞用于极限稀释实验，以确定白血病干细胞（LSCs）的频率（下图）。缩写：T-ALL = T细胞急性淋巴细胞白血病；LSCs = 白血病干细胞；CT-FR = CellTrace Far Red；FITC = 异硫氰酸荧光素；PE = 藻红蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

Estimating LSC Frequency in Zebrafish T-ALL Using Cell Proliferation Dye Sorting

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<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+engrafted+human+cancer+and+therapy+responses+in+immunodeficient+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

已知肝窦内皮细胞对传统的抗增殖化疗具有耐药性，针对这些细胞开发靶向治疗策略在降低复发率和改善患者预后方面具有重要意义20既往研究描述了使用荧光细胞增殖染料鉴定T-ALL PDX模型中与耐药性和干性相关的一小群静息细胞13在本研究中，我们描述了使用一种类似的细胞增殖染料来分辨T-ALL斑马鱼模型中分裂缓慢或处于静息状态的细胞。我们利用该工具发现，具有最高染料滞留能力的细胞中富含白血病干细胞（LSCs）。将此类研究拓展至斑马鱼模型具有诸多优势。斑马鱼繁殖力强，每对交配个体每周可产生数百个子代，这为需要大量动物个体的移植实验和极限稀释分析提供了有力支持。15,17,21此外，斑马鱼非常便于 体内 成像，通过简单的荧光显微镜实现对阳性动物的快速筛选16因此，该方案可作为进一步研究斑马鱼T-ALL模型中静息细胞的基础。
本文描述了使用先前在CG1斑马鱼中构建的、具有高频率白血病干细胞（LSCs）的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）克隆的方法15，因此只需将冻存细胞复苏并扩增后即可使用。或者，也可通过向斑马鱼胚胎显微注射rag2:Myc驱动的DNA构建T-ALL模型，筛选发生T-ALL的个体，并从前述方法所述的阳性斑马鱼中收获白血病细胞17。使用同源性斑马鱼模型在此类研究中具有多种优势。由于动物个体间基因型完全相同，移植的细胞可在宿主体内稳定植入，无需适应新的微环境，从而能够准确估算LSC频率15,17,22。
作为使用同系动物的替代方案，本方案也可采用经过化学或辐射介导的免疫消融处理的野生型斑马鱼品系。若使用免疫消融动物，需注意优化极限稀释实验条件，因为在异基因移植中可能需要更多细胞才能实现成功的植入。此外，由于免疫系统在21天后可能开始恢复，观察周期可能需要相应缩短。17该方案也可拓展用于人类细胞的异种移植。相较于小鼠模型，斑马鱼已成为一种高效且经济的癌症异种移植研究模型。16. 成年免疫缺陷 prkdc−/−il2rga−/− 斑马鱼已在37°C下成功移植人类细胞并维持长达60天23在此模型中，染色细胞不会增殖并发生分裂 体内 如本文所述，可对人类细胞进行染色并使其分裂 体外 然后分选并移植到一个 prkdc−/−il2rga−/− 斑马鱼用于 体内 研究。在使用斑马鱼作为异种移植模型时，需考虑若干局限性。例如，斑马鱼必须经过适应才能在37 °C下存活。此外，由于斑马鱼缺乏某些器官（如肺和乳腺），某些癌症可能无法进行原位移植。16.
综上所述，在斑马鱼T-ALL模型中使用细胞增殖染料为研究静息状态的白血病干细胞（LSCs）及其在疾病发生和治疗耐药中的作用提供了有前景的途径。利用CG1品系斑马鱼成本低、遗传背景均一等优势，本实验方案为深入理解T-ALL中LSC的生物学特性提供了一个可靠的平台。斑马鱼模型可与小鼠模型和PDX模型相互补充，有助于开发更优化、更具靶向性的治疗策略，最终改善T-ALL患者的预后。

成体干细胞负责特定器官中已分化细胞类型的再生，通常主要处于静息、不分裂的状态1,2。例如，维持血液系统的造血干细胞（HSCs）大部分时间保持静息状态，仅有极小部分进入细胞周期，进行自我更新或分化以产生成熟的血细胞成分3。类似地，在癌症中，存在一类稀少的细胞亚群，称为肿瘤干细胞（CSCs），具有自我更新能力，并负责恶性肿瘤的长期维持4。肿瘤干细胞在体内（in vivo）通常处于静息或缓慢增殖状态，这种特性可能使其逃避抗增殖类癌症治疗5，逃避免疫系统的清除6，降低氧化应激，并增强其DNA修复通路7。即使治疗后残留极少量的肿瘤干细胞，也可能重新填充肿瘤，导致患者复发8。因此，深入理解细胞静息机制，对于发现肿瘤干细胞的潜在弱点以及开发新的靶向治疗策略具有重要意义。
细胞增殖染料（如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料及其衍生物）常用于追踪细胞分裂频率9。该染料可穿透细胞膜，进入细胞后被细胞内酯酶激活，生成荧光产物。生成的荧光化合物通过琥珀酰亚胺基团与细胞内蛋白质的氨基官能团之间形成的共价酰胺键而保留在细胞内10。每次细胞分裂时，荧光化合物均等地分配到两个子细胞中，导致荧光信号稀释一倍。通过流式细胞术分析，该染料可检测多达10次细胞分裂11。
该方法此前已被用于富集CSC群体 体外 通过鉴定对染料具有高保留能力的慢周期细胞群体11,12在T-ALL中，CFSE已被用于追踪肿瘤生长 体内 在小鼠的患者来源异种移植模型中，细胞标记并移植三周后，流式细胞术分析显示存在少量仍保留CFSE荧光的细胞群体。该细胞群体具有干性特征、治疗抵抗性，并且与患者中导致复发的细胞高度相似13因此，该染料为研究T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中白血病干细胞（LSC）表型提供了一种有用的工具。
本研究的目的是拓展细胞增殖染料在静息状态研究中的应用 体内 使用斑马鱼T-ALL模型。特别是 rag2:Myc-驱动型斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型14 由于与小鼠模型和人类疾病相比，LSCs 的频率较高，因此为自我更新的研究提供了极佳的平台15此外，斑马鱼可用于大规模的移植研究，其饲养和维护成本远低于小鼠模型。16斑马鱼也非常适用于活体成像研究，因为使用普通的荧光显微镜即可观察荧光标记的肿瘤细胞，从而评估肿瘤发育的速度。16.
在本方案中，我们描述了染色的工作流程&#160;用细胞增殖染料标记斑马鱼 T-ALL 细胞，随后进行&#160;体内 在同系CG1斑马鱼中扩增染色细胞。在白血病发生后，我们描述了保留染料的细胞分选过程，并将其用于后续的极限稀释移植实验，以定量分析白血病干细胞（LSC）的自我更新率。该方案可拓展至其他应用，包括 体内 针对静息性LSC的潜在化合物进行药物筛选。此外，所收集的细胞还可用于多种下游分析，如转录组谱型分析、蛋白质组学和代谢组学，从而为T-ALL中静息性LSC的行为提供独特的研究视角。

<table><tbody><tr><td>26 G/2&amp;rdquo; 微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>NA</td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m 滤帽式 FACS 管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>NA</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>CELLTREAT</td><td>229482</td><td>NA</td></tr><tr><td>96 孔带裙边 PCR 板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0800</td><td>NA</td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>Sony Biotechnology</td><td>SY3200</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellTrace 远红外染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34564</td><td>NA</td></tr><tr><td>锥形管</td><td>VWR</td><td>10026-078</td><td>NA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>NA</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Caisson Labs</td><td>22110001</td><td>NA</td></tr><tr><td>落射荧光体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ25</td><td>NA</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td>NA</td></tr><tr><td>鱼类养殖系统用水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>0.03–0.05% 盐度，pH 6.5–8，碳酸氢钠缓冲</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2171</td><td>NA</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Pentaire</td><td>TRS-1</td><td>三卡因甲磺酸盐，一种麻醉剂</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>07-202-011</td><td>NA</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>American Line</td><td>66-0089</td><td>NA</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼t细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining

细胞静息是一种生长停滞或增殖减缓的状态，在正常干细胞和癌症干细胞（CSCs）中均有描述。静息状态可能使癌症干细胞免受抗增殖化疗药物的作用。在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中，静息细胞与治疗耐药性和干性相关。细胞增殖染料是追踪细胞分裂的常用工具。荧光染料共价结合到细胞膜及胞内大分子上的氨基基团，从而实现对标记细胞最多达10次分裂的追踪，可通过流式细胞术分辨。
最终，增殖速率最高的细胞会表现出较低的染料保留，因为染料在每次细胞分裂后都会被稀释，而处于静息状态或分裂较慢的细胞则会保留最多的染料。利用细胞增殖染料分离静息细胞的方法已在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）小鼠模型中得到优化和描述。作为现有小鼠模型的补充，源自rag2:Myc的斑马鱼T-ALL模型为研究T-ALL中自我更新能力提供了理想平台，这得益于其白血病干细胞（LSCs）的高频率以及斑马鱼在大规模移植实验中的操作便利性。
此处，我们描述了使用细胞增殖染料对斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞进行染色的工作流程，优化了该染料在斑马鱼细胞中的使用浓度，并成功传代了染色后的细胞 体内，以及通过移植动物的活细胞分选收集具有不同染料滞留水平的细胞。鉴于目前尚无明确的T-ALL中白血病干细胞（LSCs）细胞表面标志物，该方法为研究静息细胞提供了功能性手段 体内对于代表性结果，我们描述了高染料滞留细胞和低染料滞留细胞的移植效率及白血病干细胞频率。该方法有助于进一步研究静息细胞的其他特性，包括药物反应、转录谱和形态学特征。

我们采用上述方案对保留了细胞增殖染料CT-FR的细胞进行分选，并将其用于有限稀释分析（LDA），以估算CT-FR高表达和CT-FR低表达群体中白血病干细胞（LSC）的频率。为设定流式细胞术实验的门控参数，我们除使用单色对照外，还设置了无荧光染料（无颜色）对照(图2A)。这些象限用于确定FITC和PE阳性及阴性群体，以建立分选门控。CT-FR单色阳性对照于分选当天制备，通过染色未移植的野生型斑马鱼细胞获得，因此其信号强度预期显著高于样本中传代细胞的信号强度。
在CT-FR染色的GPF T-ALL中(图2B)，位于右上象限、频率较低（0.13%）的细胞被视为CT-FR高表达细胞，并在此象限设置标记为“CT-FR high”的分选门。另在右下象限设置一个分选门，用于收集CT-FR低表达的白血病细胞。由于肿瘤样本中CT-FR高表达细胞丰度较低，因此需分选大量细胞（约2.5 × 106）以获得限制性稀释实验所需的细胞数量。
将分选后的细胞移植到CG1斑马鱼中进行有限稀释分析（LDA）后，对斑马鱼进行了为期6周的监测。CT-FR High细胞群体的白血病干细胞（LSC）频率较CT-FR Low细胞群体高出四倍（p = 0.0134) (图3A). 移植后28天动物的代表性图像如下所示 (图3B)在CT-FR高剂量组中，9只动物中有8只（89%）发生白血病，而CT-FR低剂量组中10只动物中有2只（20%）发生白血病。 (图3A)CT-FR High组动物发生白血病的潜伏期显著缩短（p = 0.0014) (图3C)最后，CT-FR High组动物的总体生存率显著降低（p = 0.0408) (图3D)；在第6周时，CT-FR Low组动物的存活率为70%，而CT-FR High组动物的存活率仅为10%。这些结果表明，在分裂缓慢、处于静息状态的细胞群体中，自我更新的白血病干细胞（LSCs）得到了富集。 rag2:Myc驱动的斑马鱼T-ALL模型以及利用细胞增殖染料分离该细胞群体的方法。
<img alt="经CT-FR染色的T-ALL流式细胞术图，显示PE-Texas Red与FITC荧光分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：使用流式细胞术进行细胞分选。（A）利用新鲜CT-FR染色的WT细胞和GFP标记的T-ALL细胞的FACS图，设定分选CT-FR染色的GFP+ T-ALL细胞的门控。（B）扩增后的CT-FR染色GFP+ T-ALL细胞的代表性示例。右上象限的细胞被视为CT-FR高表达，右下象限的细胞被视为CT-FR低表达。缩写：T-ALL = T细胞急性淋巴细胞白血病；CT-FR = CellTrace Far Red；GFP = green fluorescent protein；FITC = 异硫氰酸荧光素；PE = 藻红蛋白；FACS = 荧光激活细胞分选；WT = 野生型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="白血病研究：数据表、斑马鱼成像、生存曲线；细胞处理比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：高保留细胞增殖染料的细胞中LSC频率显著更高。 (A) 有限稀释实验数据，显示移植两种递增剂量细胞（10 和 25 个细胞）后白血病阳性动物的数量。标明了计算得到的白血病干细胞（LSC）频率及 95% 置信区间p = 0.0134). (B) 移植后28天动物的代表性图像；比例尺 = 10 mm。C) 显著白血病发生的潜伏期，定义为出现显著白血病所需的时间 &gt;50%的动物变为GFP阳性，表明存在显著的白血病负荷。D) 移植10个细胞后动物的生存曲线。缩写：LSCs = 白血病干细胞；CT-FR = CellTrace Far Red。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

细胞静息是一种生长停滞或增殖减缓的状态，在正常干细胞和癌症干细胞（CSCs）中均有描述。静息状态可能保护……

白血病干细胞是白血病中一种稀有的细胞亚群，负责疾病的长期维持和复发。我们的目标是更深入地表征这些细胞，以寻找靶向并清除它们的方法，从而改善患者的预后。包括白血病干细胞在内的肿瘤干细胞处于静息状态或缓慢增殖状态，这可能使其逃逸抗增殖类抗癌治疗。理解细胞的静息状态将有助于识别白血病干细胞的潜在弱点，并发现新的靶向治疗策略。通过本方案，我们可以从T细胞急性淋巴细胞白血病的斑马鱼模型中鉴定并分离出处于静息状态的白血病细胞。这些细胞可用于后续应用，例如体内药物筛选、转录组学分析以及蛋白质组学分析。首先，在37摄氏度水浴中轻轻振荡，解冻含有1毫升冷冻GFP标记的斑马鱼TALL细胞的冻存管。随后，缓慢将管内液体转移至含有4毫升冰上鱼细胞培养基的15毫升锥形管中。在4摄氏度下以2,500 ×g离心5分钟，弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于0.5毫升鱼细胞培养基中。向含有10微升台盼蓝染料的微量离心管中加入10微升细胞悬液。充分混匀后，取10微升转移至血细胞计数板，于显微镜下计数细胞。接着，将麻醉后的成年CG1斑马鱼腹面朝上固定。使用 Hamilton 微量注射器，将 5 至 6 微升细胞悬液注入腹腔内。移植后约 21 至 28 天，评估麻醉后的斑马鱼体内 GFP 标记的白血病细胞所占百分比。为收获白血病细胞，将安乐死后的斑马鱼转移至新的培养皿中，并加入 1 毫升鱼类培养基，以作为细胞的缓冲液。使用剃刀刀片，首先将斑马鱼断头，然后研磨组织。通过移液器反复吹打，以分散较大的细胞团块。将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中，以获得单细胞悬液。首先，将 10 的 6 次方个荧光标记的斑马鱼 TALL 细胞收集到 1.5 毫升微量离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 2,500 ×g 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 毫升 0.9 倍 PBS 中。取 250 微升细胞悬液加入另一微量离心管中。然后加入 250 µL 的 0.9 XPBS，使总体积达到 500 µL。加入所需体积的 CTFR 染料储备液，在 37 °C 避光孵育 20 分钟。在室温下以 2,500 ×g 离心 5 分钟。加入 500 微升鱼培养基以去除多余的染料，再次离心，然后将沉淀重悬于 25 微升鱼培养基中。用台盼蓝对细胞染色，并在显微镜下观察细胞活力。使用优化的 CTFR 浓度对斑马鱼细胞进行染色，同时保留部分肿瘤细胞不染色。使用 Hamilton 微量注射器，将五微升染色和未染色的细胞悬液注入麻醉后的斑马鱼腹腔内。制备供体板时，将 500,000 个野生型 CG1 斑马鱼细胞转移至 15 毫升锥形管中。加入五毫升鱼类培养基，将细胞储备液稀释至每微升含 100 个细胞。将50微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中，并将该板置于4摄氏度环境下，直至进行分选。为分选实验的设置准备未染色和单色对照。将对照和样品的细胞悬液通过35微米滤膜帽加入预冷的流式管中，置于冰上。在 4 摄氏度下，以 2,500 G 离心 96 孔板。小心移除每个孔中的 45 微升上清液，保留 5 微升液体。使用 20 微升移液器重悬细胞，并用 Hamilton 微量注射器将细胞悬液注射到所需数量的 CG1 斑马鱼体内。在将分选后的细胞移植到CG1斑马鱼中进行极限稀释分析后，CT-FR高表达细胞的白血病干细胞频率是CT-FR低表达细胞的四倍。移植后28天的斑马鱼代表性图像显示，89%的CT-FR高表达斑马鱼发生白血病，而CT-FR低表达组仅为20%。CT-FR高表达斑马鱼发生白血病的潜伏期显著更短。CT-FR高型斑马鱼的总体生存率显著低于CT-FR低型斑马鱼。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

使用细胞增殖染色鉴定斑马鱼 T 细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静止细胞 

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