Name: 农田土壤中常规微塑料的分离和鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 学习从农田土壤中提取微塑料的标准化方法，包括密度浮选、杂质消解和聚合物鉴定技术。该方案具有成本效益高、操作简便的特点，为土壤微塑料分析提供了可靠的科学基础。

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本项目得到中国鄂尔多斯市科技重大专项［ZD20232320］、英国研究与创新署全球挑战研究基金（GCRF）以及自然环境研究理事会项目的支持； &#34;农业微塑料是否会削弱经济欠发达国家的粮食安全与可持续发展？&#34; 在资助号[NE/V005871/1]下由资助；国家自然科学基金委员会资助号[42277097]；中国农业大学高层次团队项目、中国农业大学教授工作站与山西省忻州市疾病预防控制中心及忻州市基础研究计划[20230515]&#160;中国国家自然科学基金委员会国际合作与交流项目资助 [NSFC-UNEP: 32261143459]。

注意：以下溶液需在提取过程开始前于室温下配制：1）饱和 NaCl 溶液（5.7 M）——将 1 kg NaCl 溶解于 3 L 去离子 H2O 中；2）4 M NaOH——将 480 g NaOH 溶解于 3 L 去离子 H2O 中；3）尼罗红（100 µg mL-1）——将 10 mg 尼罗红溶解于 100 mL 适当的溶剂中（如甲醇、丙酮）。
1. 土壤采样与制备
<ol>
	<li>在研究区域内采用五点采样法，以&#34;W&#34;形方式采集具有代表性的土壤样品（图1）。使用30 cm不锈钢土壤钻进行采样操作。将采集的样品收集并储存在非塑料容器中，例如铝箔。 
	注意：土壤样品可根据需要分层采集并储存于不同深度（例如0–10 cm、10–20 cm和20–30 cm）。为尽量减少塑料污染，应避免使用塑料采样工具和储存容器。建议使用铝箔等非塑料容器进行样品的采集与储存。这些样品可混合为一个复合样品，也可作为独立的重复样品保存。</li>
	<li>将土壤在室温下避光干燥。
	<ol>
		<li>若具备土壤干燥仪，可利用其同时处理多个土壤样品，因各独立腔室内的过滤装置可最大限度降低交叉污染风险。</li>
		<li>否则，将烘箱设定为40 ᵒC，干燥土壤至少24小时，直至完全干燥。</li>
		<li>使用2–5 mm金属筛对干燥后的土壤进行研磨和过筛，去除可见的植物残体、石块及其他惰性物质。 
		注意：可用铝箔松散覆盖土壤，以减少烘箱或干燥仪内的空气污染。若后续需进行大颗粒塑料分析，应使用金属镊子从土壤中拣出可见的塑料碎屑（&#62; 5 mm），并将其置于无塑料的储存容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用精确至小数点后两位的天平，称取5.0 g ± 0.05 g土壤样品，置于无塑料的称量纸或铝箔上。不同样品应使用新的称量纸，以避免交叉污染。样品可储存在无塑料容器中（例如玻璃小瓶）。</li>
</ol>
2. 密度浮选
<ol>
	<li>将5.0 g干燥土壤样品转移至一个洁净的600 mL玻璃烧杯（烧杯A）中。确保所有储存容器和烧杯均准确标记。</li>
	<li>向烧杯A中加入230 mL饱和NaCl溶液。将烧杯A置于磁力搅拌器上，并加入一个玻璃磁力搅拌子。以260 rpm的速度搅拌30分钟，直至溶液完全均质化。</li>
	<li>待溶液完全均质后，从液体中取出磁力搅拌子，并用饱和NaCl溶液冲洗，以防止塑料颗粒被带出溶液。将烧杯放置在平坦表面，避免阳光直射，静置过夜，直至完成充分的密度分离。 
	注意：在执行整个操作过程中，必须用铝箔完全覆盖，以避免空气中的塑料污染物进入。</li>
</ol>
3. 杂质消化
<ol>
	<li>当烧杯 A 中的内容物完全分层后，小心地将上清液转移至一个新的洁净 600 mL 玻璃烧杯（烧杯 B）中。用饱和 NaCl 溶液小心冲洗烧杯 A 的内壁，将冲洗后的上清液也转移至烧杯 B。重复此操作 2–3 次。 
	注意：建议上清液总体积为 200 mL。确保在下一步中保持上清液总体积一致，同时维持消化液浓度相同。</li>
	<li>向烧杯 B 中的样品加入 4 M NaOH 溶液，定容至 500 mL。将烧杯 B 置于磁力搅拌器上，加入玻璃磁力搅拌子，在 260 rpm 条件下搅拌 30 分钟，直至溶液完全均质化。在此过程中，用铝箔覆盖烧杯，以尽量减少空气中的污染。</li>
	<li>待溶液完全均质化后，从溶液中取出磁力搅拌子，并用饱和 NaCl 溶液冲洗，以去除附着的颗粒物。将烧杯 B 置于平坦表面，避免阳光直射，静置过夜，直至完成充分的密度分层和有机物消化。 
	注意：在整个操作过程中，必须用铝箔完全覆盖，以防止空气中的塑料污染物进入溶液。消化时间取决于有机物的种类和数量。如有需要，可延长消化时间，以确保有机物完全消化。成功消化后，上清液应呈现清澈状态，烧杯中无可见漂浮的有机物。</li>
</ol>
4. 用尼罗红溶液染色
<ol>
	<li>当 B 烧杯中的内容物完全分离后，小心地将上清液转移至一个新的洁净 600 mL 玻璃烧杯（C 烧杯）中。用去离子水冲洗 B 烧杯的内壁，以确保颗粒最大程度转移。
	<ol>
		<li>如果 C 烧杯中的体积小于 500 mL，则用去离子水定容至 500 mL，以统一溶液体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向 C 烧杯中加入 Nile Red 溶液，使其最终最大浓度达到 0.5 M。用玻璃棒搅拌溶液直至完全均一，然后用铝箔覆盖烧杯，避光孵育 30 分钟。</li>
</ol>
5. 真空过滤
<ol>
	<li>按以下顺序设置真空过滤装置：玻璃漏斗、金属夹、真空过滤底座、收集烧杯、连接软管、水分捕集器和真空泵。使用金属镊子小心地从储存容器中取出一张新的滤膜（0.2 µm 孔径，47 mm 直径），并将滤膜居中、平整地放置在真空过滤底座顶部。 
	注意：通过将真空过滤底座与玻璃漏斗对齐，并用金属夹固定，以确保连接牢固。</li>
	<li>启动真空过滤，缓慢将C烧杯中的液体倒入玻璃漏斗中。用去离子水多次冲洗C烧杯，以最大程度回收颗粒。样品过滤完成后，用去离子水冲洗玻璃漏斗内壁，以确保颗粒损失最小化。 
	注意：在过滤过程中，用铝箔覆盖玻璃漏斗，以减少空气污染。如果样品中颗粒数量较多且过滤速度下降，可对同一样品使用多张滤膜。这将确保颗粒在滤膜上均匀分布，并最大限度降低颗粒聚集和重叠的风险，便于后续定量分析。</li>
	<li>过滤完成后，使用镊子小心地从多孔板上取下滤膜，并将每张滤膜放入单独的玻璃培养皿中。在盖上培养皿并用铝箔包裹前，让滤膜完全干燥。将其储存在干燥、避光的地方，直至进一步分析。</li>
</ol>
6. 通过荧光显微镜对微粒（MPs）进行颗粒定量
<ol>
	<li>如果后续需要确定膜上荧光颗粒的精确位置以进行聚合物鉴定（例如使用傅里叶变换红外光谱法 FTIR），请参考以下步骤：
	<ol>
		<li>使用黑色凝胶笔轻轻在滤膜上标记起始位置，并沿 &#34;Z&#34; 形路径标记10个点（图2）。使用镊子将膜小心地放置在显微镜载物台的玻璃载片上，确保样品表面平整。</li>
		<li>按以下顺序启动荧光仪器：主机、荧光光源、显示器和荧光显微镜。打开仪器并将光源亮度调节旋钮调至最大亮度。使用明场（BF）和荧光（FL）切换按钮分别采集明场和荧光图像。</li>
		<li>使用样品观察与记录软件（例如 DP2-BSW），在明场（BF）模式下拍摄明场图像。将旋钮切换至荧光（FL）位置，在暗室中使用荧光滤光片拍摄图像。确保视野观察顺序从1到10依次进行。确保荧光图像（FL）与明场图像（BL）在同一位置拍摄。 
		注意：应在过滤后24–48小时内完成荧光显微分析，以保证颗粒荧光信号的最佳状态。确保荧光图像（FL）与明场图像（BL）在同一位置拍摄（图3）。所有膜样品必须使用相同的放大倍数和仪器设置进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用激光诱导击穿红外显微成像技术（LDIR）进行聚合物鉴定，请执行以下显微镜操作步骤：
	<ol>
		<li>按如下方式设置显微系统：相机、滤光片、放大倍数、显微镜载物台和计算机。根据样品及背景荧光情况，选择最适合所需激发波长和发射波长的滤光模式（例如分别为470 nm和495 nm）。</li>
		<li>使用无尘纸擦拭滤膜支架，然后将膜固定在支架中，并滑入显微镜载物台。对整个膜进行目视扫描，确保颗粒分布均匀。</li>
		<li>确保相机已连接，且显微镜放大倍数适用于所有样品类型，并在同一组样品中保持一致。在开始分析前，使用卷尺测量并确定相机所捕获区域的实际尺寸（单位：mm）。 
		注意：若颗粒分布均匀，应通过在膜上选择足够数量的采样点，分析至少占总膜面积10%的区域。使用相机对每个采样点拍摄图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）或激光直接红外光谱（LDIR）进行微塑料聚合物鉴定
<ol>
	<li>若使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）鉴定聚合物颗粒，请参考以下步骤。
	<ol>
		<li>开启FTIR光谱仪及用于样品观察和记录的相应软件。在测量每个样品前清洁探头。</li>
		<li>通过实时屏幕录像识别待监测的颗粒。通过调节摇杆调整位置和清晰度，将操作平台移至中心，并采集当前空气背景光谱。 
		注意：目标颗粒应同时对应明场（BF）和荧光（FL）图像。</li>
		<li>在每个颗粒上测量3–5个固定点，获得400–4,000 cm-1红外波数范围内的光谱。在结果页面保存原始数据，获取光谱，并与标准谱库中的塑料光谱进行比对，确认样品的匹配质量指数（图4）。 
		注意：本研究中，由于微塑料（MPs）尺寸较小，且难以在整个滤膜上进行准确定量，因此从每个样品中选取5–7个代表性颗粒进行FTIR分析。为确保分布均匀，按照滤膜上呈&#34;Z形&#34;的模式选取颗粒。但需注意，由于颗粒为随机选取而非对整个滤膜扫描，可能存在一定不确定性。</li>
		<li>当匹配质量指数（HQI）≥ 0.7时，视为有效匹配。图4展示了在添加了0.04% PE-MPs的土壤样品中通过FTIR光谱法鉴定颗粒的一个示例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用激光直接红外成像（LDIR）进行聚合物颗粒鉴定，请遵循以下步骤：
	<ol>
		<li>完成荧光显微镜步骤后，将颗粒重新悬浮以用于LDIR分析。将滤膜放入新的玻璃小瓶中，加入20 mL纯乙醇。 tightly 封闭瓶口，并用石蜡膜包裹瓶盖以防泄漏。</li>
		<li>将样品置于超声水浴中至少超声1小时，直至所有颗粒完全重新悬浮。取出并丢弃玻璃小瓶中的滤膜。 
		注意：确保带有颗粒的一面朝内，即远离瓶壁。超声时间取决于所用滤膜类型；滤膜可能析出颜色，但这不会干扰聚合物的鉴定。</li>
		<li>通过在荧光显微镜下重新分析滤膜，确认颗粒是否成功重新悬浮，并确保颗粒去除率超过&#62; 95%。</li>
		<li>将含有乙醇溶液的玻璃小瓶置于磁力搅拌器上，并向瓶中加入一个小的磁性玻璃搅拌子。将搅拌板温度设为100 °C，低速搅拌以保持颗粒悬浮，使乙醇蒸发至体积小于5 mL。 
		注意：用铝箔轻轻覆盖小瓶口，以尽量减少空气中的污染。可选地，可在氮气流下温和吹干以促进乙醇蒸发。</li>
		<li>将样品转移至一个8 mL的小玻璃小瓶中，使用新的乙醇冲洗20 mL玻璃小瓶，以最大程度回收颗粒。 
		注意：如有需要，可向小玻璃瓶中加入新乙醇，使总体积恰好为5 mL。</li>
		<li>为准备LDIR分析，充分震荡样品，使所有颗粒均匀悬浮于溶液中，迅速吸取10 µL样品滴加到载玻片上，待乙醇完全蒸发。每张载玻片上重复此操作两次，以实现每个样品分析3个重复。</li>
		<li>使用配套软件中的颗粒分析工具，测量设定尺寸范围内每个颗粒的红外光谱，并与内部谱库比对以实现聚合物鉴定。 
		注意：每个颗粒在800–1800 cm-1红外波数范围内自动测量一个点，系统自动将颗粒光谱与已知聚合物及其他有机和无机材料的标准谱库进行匹配。</li>
		<li>当匹配质量指数（HQI）≥ 0.8时，视为有效匹配。图5展示了在添加了0.04% PE-MPs的土壤样品中通过LDIR光谱法鉴定颗粒的一个示例。 
		注意：对于颗粒数量较少的样品，可增加样品体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 使用 ImageJ 对荧光膜图像进行颗粒定量分析
<ol>
	<li>打开 ImageJ32（版本 1.54f）并将图像加载到软件中。调整图像比例，使其与实际图像尺寸对应的测量值一致。使用功能 分析 &#62; 设定比例尺 输入图像的像素和尺寸（mm）值，然后选择 全局 ，以便在当前会话中将这些设置应用于所有图像。</li>
	<li>使用 处理 &#62; 二值化 和 图像 &#62; 类型 &#62; 8 位 功能，将图像转换为二值图像并转为 8 位图像。为设定颗粒分析参数，使用 分析 &#62; 设定测量值 功能，并选择所需参数，例如 面积、形状描述符 和 费雷特直径。勾选 添加至叠加图层，并确定数据输出的小数位数。</li>
	<li>进行颗粒分析时，选择 分析 &#62; 分析颗粒，并设定感兴趣的颗粒尺寸范围。将 圆度 设置为 0–1，取消勾选 像素单位，启用 叠加图层&#160; 显示，并勾选以下选项：显示结果、排除边缘、清除结果、包含孔洞、汇总 和 叠加图层。从结果窗口将结果导出为 .csv 文件。 
	注意：荧光图像的分析仅能提供颗粒数量信息，无法提供聚合物数量信息；因此，需要额外的鉴定步骤，例如采用红外光谱技术。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

野外土壤采样策略，包括简单随机采样或系统网格采样等方法，以及采样区域和深度，必须根据具体的研究问题进行定制，并在样品采集前明确定义。一些研究聚焦于0–10 cm的表层土壤34,37，而另一些研究则采集深度为0–40 cm的土壤样品38。由于微塑料（MPs）的尺寸和丰度在不同土壤深度中存在差异，因此有必要统一土壤采样的深度。我们建议将0–30 cm的深度作为农业田地采样的适宜且实用的标准，因为这代表了典型的耕作深度39,40。此外，研究目标、采样方法和采样区域的设计必须能够回应预设的研究问题。另外，在样品采集和运输过程中，应尽一切努力避免塑料制品带来的污染，建议使用铝盒、纸袋或纸板容器等合适的采样容器予以替代。
选择最合适的密度分离和有机消化溶液是本实验方案中的关键步骤，因为它们会影响微塑料（MPs）的提...

据估计，每年有480万至1270万吨的塑料通过陆地来源进入海洋1,2。这些塑料颗粒在紫外线照射、机械磨损和生物降解的作用下逐渐分解成更小的碎片3,4。土壤中的微塑料（MPs）污染（指直径小于5 mm的塑料颗粒）正日益引起关注，尤其是在其对土壤和作物健康潜在影响方面。这一问题主要源于塑料产量的持续增加以及塑料废弃物妥善处置所面临的挑战5,6。
土壤中微塑料（MPs）的累积可归因于多种外部因素。土壤中微塑料的潜在来源复杂多样，包括农用塑料技术的使用（如地膜、灌溉管道、温室薄膜及相关基础设施）7,8,9，以及有机改良剂的施用（如污泥施用、农业堆肥和有机肥料）10。此外，塑料垃圾的不当处置11、食品塑料包装残留物在消化后产生的食物废弃物的分解12、包膜肥料的使用13、橡胶轮胎的磨损14以及大气沉降15也被证实是土壤中微塑料的来源。中国是农业塑料特别是地膜的生产和使用大国，据估计，在大量使用地膜的农田中，微塑料的平均丰度约为 4231 个 kg-1（干土）16。2018年，中国农田土壤（0–10 cm 深度）中微塑料的总量估计在 4.9 × 106 至 1.0 × 107 吨之间，其中农业地膜贡献显著17。在欧洲和北美，农业土壤中施用污泥每年可能分别输入超过 63,000 吨和 44,000 吨微塑料18。德国的一项研究表明，向耕地施用堆肥也会导致每年向耕地输入大量塑料颗粒（&#62;1 mm）。堆肥施用导致每年输入 350 亿至 2.2 万亿个塑料颗粒10。大气微塑料对土壤的贡献仍不明确，尚需进一步量化研究15。例如，中国大气微塑料的年均输入量估计为 7.9 × 104 个 m-2 yr-116。由于土壤中微塑料来源极为广泛，已引起众多研究人员的关注，但由于采样、提取及分析检测方法的多样性，不同研究之间的结果难以整合与比较。
来自多种来源的微塑料（MPs）在环境中的累积对全球土壤构成了潜在威胁16，凸显出开展土壤中微塑料研究的迫切需求。一些研究表明，微塑料对农业土壤的影响包括改变土壤理化性质、阻碍植物和土壤生物的生长发育，以及影响土壤微生物活性19,20。另有研究发现，微塑料可在食物链中较高营养级的生物体内累积21，从而对人类健康构成潜在风险22。为了明确微塑料对土壤环境的影响，首先必须了解其污染现状，包括丰度、聚合物类型鉴定及分布特征。因此，对土壤中微塑料进行准确识别与检测至关重要。
目前，越来越多的研究文章正在探讨土壤中微塑料（MPs）的全球分布情况，在提取和检测方法上观察到显著差异23。在仔细采集样品（以尽量减少微塑料污染）后，微塑料分析的实验流程通常包括三个关键步骤。第一步是密度分离法，广泛用于将微塑料颗粒从土壤基质中分离出来。该过程通常使用蒸馏水（DI水，1.0 g cm-3）、氯化钠（NaCl，1.2 g cm-3）或氯化锌（ZnCl2，1.6 g cm-3）等试剂。第二步是去除微塑料表面有机杂质的方法，包括使用酸性或碱性溶液、其他氧化剂进行清洗，以及酶解法24。对土壤基质中的有机质或附着在微塑料颗粒上的有机物的消解，通常采用30%过氧化氢（H2O2）、65%硝酸（HNO3）或50%氢氧化钠（NaOH）进行25。在完成密度分离和有机质消解之后，需对微塑料样品进行显微观察，以确定颗粒数量。该观察还需结合傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱或其他近红外光谱技术，对聚合物的化学成分进行分析26。
然而，微塑料（MPs）提取与检测过程中的每一步都可能导致对MPs丰度的高估或低估。例如，尽管去离子水（DI水）因成本低廉且无毒害特性而被广泛用作密度分离的试剂，但它可能导致密度较高的MPs颗粒无法被有效提取27。相反，高密度试剂的广泛应用可能受到环境危害和成本增加的限制28。此外，某些用于有机质消解的试剂可能对MPs颗粒造成损伤29。再者，利用光学显微镜、体视显微镜和解剖显微镜进行的视觉分类也存在诸多挑战26,30。MPs颗粒的判定在很大程度上依赖于分析人员的专业经验与操作水平，以及仪器参数的设置。这些发现凸显了在采用不同方法学时实现结果一致性和准确性的困难，从而增加了不同研究之间数据比较的复杂性。
为确保不同研究之间数据的可靠性和可比性，必须建立土壤中微塑料（MPs）提取与检测的标准化方案。这种标准化不仅将提高微塑料赋存评估的准确性，还将促进对土壤生态系统中微塑料环境影响的更全面、统一的认识。为克服现有提取与检测方法的局限性，所选标准化方法的试剂应易于获取，不破坏微塑料颗粒的完整性或化学组成，并尽可能降低对环境的风险。此外，标准化方法应在回收微塑料和去除土壤基质中有机质方面均表现出高效率。
一种易于遵循的实验方案对于在不同研究环境中广泛采用至关重要。综合考虑微塑料（MPs）的回收率和成本效益，饱和NaCl溶液是大规模土壤样品密度分离的最佳选择。对于有机质的消解，采用NaOH，因为初步分离实验表明，4 M NaOH溶液能有效分解土壤样品中的杂质（如植物残体），同时不会对微塑料造成明显损伤。总体而言，该实验方法使用易得且成本较低的材料，操作复杂度低，并能确保可靠的提取效率。
我们推荐采用中国农业科学院提出的快速且经济的分离方法，用于测定在农田中采集的微塑料（MPs）31。在执行以下所有步骤时，确保所有容器、仪器和玻璃器皿在使用前均用去离子水清洗，以尽量减少污染。同时，务必在样品处理过程中同步进行常规空白实验，以校正采样和提取过程可能引入的污染。

<table><tbody><tr><td>两位小数天平</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准两位小数天平</td></tr><tr><td>40 &amp;deg;C 烘箱</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准大型鼓风烘箱，温度设定为 40 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>8700 LDIR</td><td>Agilent Technologies</td><td>n/a</td><td>用于识别颗粒的 LDIR</td></tr><tr><td>铝制容器</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准铝制食品外带容器</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准重型铝箔</td></tr><tr><td>Axioplan 2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>荧光显微镜用于观察处于荧光状态的微塑料颗粒</td></tr><tr><td>膨润土黏土</td><td>Sigma Aldrich</td><td>285234</td><td>用于回收率测试的膨润土黏土</td></tr><tr><td>BX53</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>荧光显微镜用于观察处于荧光状态的微塑料颗粒</td></tr><tr><td>玻璃烧杯（600 ml）</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准玻璃烧杯</td></tr><tr><td>玻璃瓶（1 l）</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准玻璃瓶</td></tr><tr><td>玻璃磁力搅拌子</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准玻璃包覆磁力搅拌子</td></tr><tr><td>玻璃量筒（500 ml）</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准玻璃量筒</td></tr><tr><td>玻璃移液管（10 ml）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃真空过滤装置</td><td>Pyrex（通过 Sigma Aldrich 购买）</td><td>SLW5809/KIT</td><td>包含 500 ml 漏斗、多孔板和 1 l 收集烧杯的玻璃过滤装置</td></tr><tr><td>LUMOS Alpha II</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td>用于分析可疑微塑料的傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>标准磁力搅拌板</td></tr><tr><td>MCE 滤膜</td><td>津腾公司</td><td>JTMF0441/0442</td><td>白色 MCE 膜，孔径 0.2 &amp;micro;m，直径 50 mm，适用于 FTIR 方法</td></tr><tr><td>尼罗红</td><td>Fisher Scientific</td><td>10464311</td><td>尼罗红粉末，用于使用适当溶剂（如丙酮）配制尼罗红染料储备液</td></tr><tr><td>PCTE 滤膜</td><td>Sterlitech Corporation</td><td>1270060</td><td>黑色 PCTE 膜，不含聚乙烯吡咯烷酮（PVP），孔径 0.2 &amp;micro;m，直径 47 mm，适用于 LDIR 方法</td></tr><tr><td>二氧化硅</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18649</td><td>用于回收率测试的二氧化硅</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>用于密度分离的氯化钠</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>10675692</td><td>用于有机质消解的氢氧化钠</td></tr><tr><td>土壤钻</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>长度 30 cm；直径 2 cm；材质为不锈钢</td></tr><tr><td>超高分子量聚乙烯微塑料粉末</td><td>Sigma Aldrich</td><td>434272</td><td>用于掺入二氧化硅、膨润土黏土和土壤样品以进行回收率测试的聚乙烯微塑料</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Vacuubrand GmBH Co KG</td><td>ME 2C NT</td><td>用于真空过滤的真空泵</td></tr></tbody></table>

农田土壤中常规微塑料的分离与鉴定

Separation and Identification of Conventional Microplastics from Farmland Soils

过去十年中，陆地环境中的微塑料（MPs）污染日益受到关注，越来越多的研究描述了不同土壤系统中微塑料的数量和类型及其对土壤和作物健康的影响。然而，由于目前采用的微塑料提取与分析方法各不相同，限制了研究结果之间的比较，也难以为产业界建议和政策制定提供可靠的科学依据。本文提出了一种标准化操作流程，用于微塑料的采样、分离及化学鉴定方法。&#160;从土壤中提取。该方法成本低廉，材料易于获取，从而提高了操作便利性，并有助于广泛推广。本方案详细说明了使用无塑料器具采集土壤表层0-30 cm样品的方法；通过使用不同固体培养基（如膨润土黏土、二氧化硅和未受污染的土壤）模拟多种土壤类型，并添加相同质量的物质&#160;聚乙烯（PE）微塑料的后续定量；利用饱和氯化钠（NaCl）溶液进行塑料颗粒的密度分离，以及使用4 M氢氧化钠（NaOH）溶液消化上清液中的有机杂质；经尼罗红染色后通过荧光显微镜定量颗粒；以及采用微区&#160;傅里叶变换红外光谱（μ-FTIR）或激光直射红外（LDIR）光谱。上述介质中微塑料的回收率范围为83%–90%。本方案提供了一种高效分析土壤中微塑料的方法，在可行性、适用性和成本效益方面均经过优化。此外，配套视频可对土壤微塑料分析过程进行逐步虚拟指导。本研究致力于标准化土壤微塑料分析方法，增强测量结果的连通性与可比性，为更标准化和科学化的研究奠定基础。

为验证该方法的回收率，选取了三种不同的固体基质（二氧化硅（SD）、膨润土（BT）和土壤）样品，每种设置三个重复。样品分别在添加与不添加0.04% w/w 白色聚乙烯（PE）微塑料（粒径范围40–48 µm）的条件下进行分析。土壤样品采自中国北京海淀区（中国农业大学西校区），土壤类型为棕壤。此外，设置了三个空白对照重复，以排除提取和分析过程中可能引入的任何污染。
BT、SD 和土壤中微塑料的平均回收率分别为 84%、83% 和 90%。平均而言，在 20–500 µm 的设定尺寸范围内，86% 的聚乙烯（PE）颗粒成功被回收。空白样品的干扰以及化学鉴定结果的干扰已被排除。颗粒损失可能源于上清液转移、过滤过程或误判识别。回收率的差异可能受到盐溶液种类、消解溶液类型和反应时间等因素的影响33,34。此外，一项全球性荟萃分析指出，土壤中微塑料提取实验的回收率通常介于 71% 至 93% 之间35。因此，本研究...

本文介绍了一种从土壤中提取微塑料并鉴定其聚合物类型的方法。该方法在操作性、适用性和成本效益方面均经过优化，为标准化土壤中微塑料分析方法奠定了科学基础。

过去十年中，陆地环境中的微塑料（MPs）污染日益受到关注，相关研究不断增多，描述……

本方案描述了土壤中微塑料的常规采样及样品分析方法。该方法包括七个部分：土壤采样与制备、密度浮选、杂质消解、染色、真空过滤、形态学观察以及聚合物鉴定。本文介绍了最后两个步骤的两种不同分析流程，可根据仪器的可用情况独立进行。在稳定区域采用双环五点取样法采集具有代表性的土壤样品。使用30厘米长的不锈钢土壤钻进行采样。将样品收集并置于非塑料容器中，例如铝箔纸。在避光的室温条件下干燥土壤，或使用设定为40摄氏度的烘箱干燥土壤，至少24小时，直至完全干燥。如果有土壤干燥仪，可同时处理多个土壤样品，因其各个腔室内的过滤装置可最大限度降低交叉污染的风险。干燥后，如有必要，研磨土壤。使用洁净的非塑料工具。将干燥的土壤研磨并保存。使用一个2至5毫米的金属筛。使用精度为±0.05克的小型天平，将土壤样品称量后置于无塑料的称量纸或铝箔上。样品可保存在三个容器中，例如玻璃小瓶。将研磨细的干燥土壤样品转移至一个洁净的600毫升玻璃烧杯A中。向烧杯A中加入230毫升饱和氯化钠溶液。确保所有储存容器和烧杯均准确标记。将烧杯A置于磁力搅拌器的玻璃磁力搅拌板上。以每分钟260转的速度搅拌溶液30分钟。完全均质化后，将磁力搅拌器从溶液中取出，并用饱和氯化钠溶液冲洗，以防止塑料颗粒被带出溶液。将烧杯置于无直射阳光的平坦表面上，静置过夜，直至完成充分的密度分离。当A烧杯内的物质完全分层后，小心地将上清液转移至新的玻璃烧杯B中。用饱和氯化钠溶液冲洗A烧杯的内壁。向 B 烧杯中的样品中加入四摩尔氢氧化钠溶液，定容至 500 毫升。在 260 转/分钟的条件下搅拌溶液 30 分钟。然后取出磁力搅拌子，将烧杯置于平坦表面，避免阳光直射，并静置过夜。待烧杯B中的内容物完全分层后，将烧杯B中的上清液转移至新的烧杯C中。用蒸馏水冲洗烧杯b的内壁，以确保颗粒物最大程度地转移。向烧杯C中加入先前配制好的新红染料溶液，使其最终浓度达到0.5摩尔。用玻璃棒搅拌溶液，直至完全混匀。然后用铝箔覆盖烧杯，将溶液在通风橱中静置孵育30分钟。首先，按如下步骤搭建真空过滤系统。玻璃漏斗、金属夹、真空过滤底座、收集烧杯、连接软管、水分捕集器和真空泵。使用镊子小心地从储存容器中取出新的滤膜。将滤膜居中且平整地放置在真空过滤底座的顶部。通过将真空过滤底座与玻璃漏斗对齐，并使用金属夹具固定，确保连接牢固。启动真空过滤装置，缓慢将烧杯C中的液体倒入玻璃漏斗中。用蒸馏水多次冲洗烧杯C，以最大程度回收颗粒物。用铝箔覆盖玻璃漏斗以尽量减少污染。样品过滤后，用蒸馏水冲洗玻璃漏斗内壁，以确保颗粒损失最小。关闭真空泵，用镊子小心地从滤器中取出滤膜。将每张膜分别放入单独的玻璃培养皿中。在关闭培养皿并用铝箔包裹之前，确保膜完全干燥。将其保存在干燥避光处，直至进一步分析。如果后续需要确定荧光颗粒在膜上的精确位置以进行聚合物鉴定（例如，通过使用傅里叶变换红外光谱法 FTIR），请参考以下步骤。使用黑色凝胶笔，在滤膜上沿 T 形方向轻轻标记起始位置，共标记 10 个点。按如下顺序启动荧光仪器：主机、荧光光源、显示器和荧光显微镜。打开仪器，并将光源 LED 调至最大亮度。使用明场、暗场（DF）和荧光（FL）切换按钮，分别采集暗场和荧光图像。使用 DP2-BSW 软件进行样品观察记录，但仅需调整显微镜的分辨率以使屏幕图像更清晰。在明场（BF）位置下拍摄明场图像，然后切换至荧光（FL）位置并使用荧光滤光片在暗室中拍摄荧光图像。确保视野观察顺序从1到10依次进行。明场与荧光图像必须在同一位置拍摄。使用LDIR进行聚合物鉴定时，请按以下步骤操作显微镜。按如下方式设置显微镜系统：相机、滤光片、放大倍数和显微镜载物台，以及计算机。用无尘纸包裹滤膜夹持器，然后将滤膜固定在夹持器中，并滑入显微镜载物台。确保相机已连接，且显微镜放大倍数适合样品类型，并保证同一批次所有样品的放大倍数一致。为量化记录图像中的颗粒，请遵循文稿中提供的逐步说明。如果使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）来鉴定聚合物颗粒，请参考以下步骤。开启FTIR光谱仪LUMOS及相应的软件模块，例如用于观察和记录。用液氮填充以启动机器。在对每个样品进行镜检前清洁探针。通过实时屏幕记录识别用于监测的颗粒。通过调节摇杆来调整位置和清晰度。将操作平台移至中心位置，采集当前的空气背景光谱。在目标片段上测量三到五个固定点，然后根据这些固定点的位置定位探头。在结果页面上保存原始数据。解析光谱，并将该光谱与标准谱库中的塑料光谱进行比对，以确定样品的耐热质量指数。若使用LDIR进行聚合物颗粒鉴定，请遵循以下步骤。将滤膜放入一个新的20毫升玻璃小瓶中。加入20毫升纯乙醇。盖紧瓶盖，并用帕拉膜包裹瓶盖以防止泄漏。将样品置于超声波水浴中处理至少一小时，直至所有颗粒完全重悬。膜可能析出颜色，但这不会干扰聚合物的鉴定。取出膜并弃去。将装有乙醇溶液的玻璃小瓶置于磁力搅拌器上，并向小瓶中加入一个小型磁力玻璃搅拌子。将温度设置为100摄氏度，并以低速搅拌，使颗粒保持悬浮状态，直至乙醇蒸发至少于5毫升。为准备LDIR分析样品，缓慢振荡样品，直至所有颗粒在溶液中均匀悬浮，然后迅速取10微升样品滴加到载玻片上，让乙醇自然蒸发。每个样本在每张载玻片上需重复此步骤两次，共分析三个重复样本。将LDIR载玻片插入仪器，并在连接的软件中输入样本名称。随后，仪器将启动自动扫描。所得分析结果提供了有关单个颗粒化学组成、样品中不同聚合物的分布以及颗粒尺寸的详细数据。后续数据处理详见方案第8节，例如使用ImageJ软件，以及论文结果部分的计算方法。为验证该方法的回收率范围，选取了三种不同的固体基质样品——二氧化硅（SD）、膨润土（BT）和土壤，每种样品均设置三个重复进行分析。假设所有微塑料颗粒均为均匀的球体。这意味着每五克干燥固体样品中包含超过 48,740 个颗粒。基于 Image J 软件，可查看单个样品中颗粒数量的信息，并利用以下三个公式计算微塑料的最终回收率。以下是本实验的一些结果。首先是不同固体基质中微塑料的回收率。BT、SD和土壤的平均回收率分别为84%、83%和90%。空白样品的干扰及化学鉴定因素已被消除。平均而言，86%的PE颗粒成功被回收。下方为这些样品的聚合物类型分析结果。结果表明，除聚乙烯外，还检测到了酚醛树脂、聚氯乙烯、聚酰胺和聚丙烯。该结果可能源于上清液转移、过滤过程中的微量样品残留或错误鉴定。这些污染可能来自过滤装置、实验室设备、大气沉降或蒸馏水。使用不同的聚合物鉴定方法拍摄了一些图片。这两张图片均基于傅里叶变换红外光谱（FTIR）方法，拍摄于膜样品的同一区域，分别在日光和荧光灯下进行。在图A中呈透明状而在图B中发出绿色荧光的颗粒，被认为很可能是塑料物质。这是一个典型示例，展示了待检测颗粒的光谱与标准光谱图之间的比较。该PE颗粒的光谱与谱库中最接近的光谱匹配，匹配质量为98%。此图像采用LDIR方法拍摄。真实图案和分布如图A所示，同时还显示了单个颗粒的化学成分等详细信息。匹配质量以及颗粒大小如图B所示。陆地环境中的微塑料污染是一个在过去十年中受到越来越多关注的科学课题。然而，仅在最近才开始对土壤系统中的微塑料进行定量分析，且针对土壤中微塑料的检测方法尚未标准化。本方案描述了微塑料颗粒的采样、分离及化学鉴定方法。为了提高操作便利性和广泛适用性，该方法成本低廉且材料易于获取。本方案具有作为指导框架的潜力，提出了一种适用于多种土壤类型的综合方法，可确保微塑料的准确定量与分析。

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