使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

我们的团队致力于开发诱导性多能干细胞（iPSC）疗法，用于治疗目前无法治愈的严重皮肤疾病，例如隐性营养不良型大疱性表皮松解症。我们的目标是确定精确的基因编辑结合iPSC向皮肤细胞的分化是否能为这些疾病提供可行的治疗方案。利用CRISPR-Cas9技术对体细胞和iPSC进行基因编辑，正在推动再生医学的发展，为包括遗传性皮肤疾病在内的多种疾病实现个体化治疗。

基因工程目前面临的挑战包括基因编辑工具的脱靶效应。治疗应用需要能够精确修复目标基因而不会改变基因组中其他位点的基因编辑工具。我们的挑战在于证明基因编辑工具不会在目标基因以外引入非预期的编辑。

CIRCLE-seq 协议能够识别出其他类似技术可能遗漏的真实潜在脱靶位点。对这些脱靶位点进行全面分析，可深入了解基因编辑工具的活性，从而提高基因治疗的安全性，包括我们基于诱导多能干细胞（iPSC）的皮肤疾病疗法。将诱导多能干细胞培养五天后，通过离心收集细胞，并将其重悬于 10 毫升 PBS 中。

取6微升细胞悬液与6微升台盼蓝混合，用于细胞计数。计数后，每管分装2次，每管含10的7次方个细胞。在25°C下以300 ×g离心3分钟，弃去上清液。

通过归位控制臂来准备聚焦超声波仪。向储液槽中加入纯化去离子水。在控制台笔记本电脑上，进入 WaterWorks 系统并点击“填充”以开始注水。

将温度调节至4.5摄氏度。将25微克从诱导多能干细胞中分离的基因组DNA转移至微量离心管中。用TE缓冲液将体系补至总体积130微升。

设定条件以将DNA剪切至平均长度为300个碱基对，持续时间为10秒，峰值功率为70，占空比为20%，循环脉冲次数为50。将剪切后的基因组DNA均分为两份，每份65微升。使用1.8倍体积的XP磁珠纯化样品，随后进行磁力架分离。

将上清液转移至新的PCR板中，并使用分光光度计测定DNA含量。最后，在胶带检测仪上上样1微升经片段化处理的基因组DNA。首先，用TE缓冲液将oSQT1288和发夹接头重悬，使其终浓度为100微摩尔。

进行接头退火时，将40微升的oSQT1288、10微升的10X STE缓冲液和50微升的无核酸酶水混合，总体积达到100微升。接头退火完成后，取10微升的5X连接缓冲液、5微升DNA连接酶和5微升退火后的发夹接头混合。用移液器将20微升接头连接主混合液加入每个含有磁珠的洗脱DNA样本中。将样品置于20摄氏度的热循环仪中反应1小时，随后在4摄氏度长期保存。

接下来，将50 µL的PEG/NaCl喷雾溶液转移至接头连接的DNA中。使用XP磁珠和磁力架分离纯化样品。用30 µL pH为8的TE缓冲液洗脱样品，并将上清液转移至新的半裙边PCR板中。

将样品混合，并使用dsDNA BR检测法对DNA进行定量。配制环化主混合液时，将8微升无核酸酶水、10微升10X TD4 DNA连接酶缓冲液和2微升T4 DNA连接酶混合，总体积为20微升。用移液器将20微升环化主混合液加入80微升含500纳克经用户PNK处理的DNA中。

将样品置于PCR仪中，在16摄氏度下孵育16小时。次日，向环化DNA中加入100微升XP磁珠，并按照之前所述方法纯化样品。用38微升TE缓冲液洗脱样品，并将上清液转移至新的半裙边PCR板中。

为了切割纯化的环状基因组DNA，通过混合5微升10X Cas9缓冲液、4.5微升酿脓链球菌Cas9和1.5微升基因组RNA，配制总体积为11微升的体外切割主混合液。将切割主混合液在室温下孵育10分钟，以形成Cas9 gRNA RNP复合物。

将125纳克经质粒安全DNase处理的基因组DNA用无核酸酶水稀释至终体积39微升。然后，向39微升DNA中加入11微升切割主混合液，总体积为50微升。将混合物在37摄氏度的热循环仪中孵育1小时，并无限期维持在4摄氏度。

孵育后，向体外切割的DNA中加入50 µL XP磁珠，并在磁力架上纯化DNA。用42 µL TE缓冲液洗脱纯化的DNA。对于下一代测序数据的分析，需安装Python 2.7版本、Burrows-Wheeler Aligner以及SAMtools。

从指定网站下载参考基因组。定义参考基因组的FASTA文件、分析的输出目录，以及BWA和SAMtools命令的路径。指定目标序列，以及核酸酶切割样本和对照样本的去复用后FASTQ文件的路径。

使用以下命令执行基于标准参考的分析。在执行完整流程时，应在为每个特定步骤指定的独立输出文件夹中查找各步骤的输出结果。