Name: 生成和共培养小鼠原代小胶质细胞和皮质神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习建立小鼠原代小胶质细胞与皮质神经元的共培养系统，用于研究神经炎症中的细胞相互作用。该方法支持长达三周的长期观察，有助于深入理解中枢神经系统中神经保护与退行性变的机制。

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JP 感谢加拿大自然科学与工程研究理事会以及萨斯喀彻温大学医学院提供的资金支持。YD 感谢萨斯喀彻温大学医学院启动基金、加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（RGPIN-2023-03659）、MS Canada 催化剂基金（1019973）、萨斯喀彻温健康研究基金会成立基金（6368）以及加拿大脑基金会加拿大脑研究未来领导者基金的支持。图 1A、图 2A 和 图 3A 使用 BioRender.com 制作。

本研究中使用的所有动物均经萨斯喀彻温大学动物护理委员会（UACC）和加拿大动物护理委员会（CCAC）批准进行饲养和操作。出生后0-2天的CD1雄性和雌性小鼠&#160;胚胎期天数&#160;本研究使用了来自怀孕 CD1 小鼠的 16-18 天（E16-18）胚胎。所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 原代小胶质细胞培养
注意：必须合理安排混合胶质细胞与神经元培养的时间，以确保在神经元接种至96孔板后2天内，小胶质细胞已成熟并可进行收获。
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>将完全胶质细胞培养基提前预热，该培养基包含高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），并添加 10% 热灭活胎牛血清、50 U/mL 青霉素/链霉素、2.92 mg/mL L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1× 非必需氨基酸和 20 mM HEPES，置于 37 °C 水浴中预热。</li>
		<li>向每个 T-75 培养瓶中加入 5 mL 浓度为 10 µg/mL 的多聚-L-鸟氨酸（PO）氢溴酸盐溶液。轻轻旋转培养瓶，确保 PO 完全覆盖瓶底。在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育至少 1 小时。 
		注意：此包被步骤是促进细胞在 T-75 培养瓶表面黏附所必需的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>P0-P2 新生小鼠脑组织的分离 
	注意：所有解剖器械均需灭菌，并保持试剂无菌。整个操作过程中须严格遵守无菌技术。
	<ol>
		<li>开始解剖前，用 70% 乙醇或消毒喷雾喷洒操作台面。设置好解剖显微镜，并将培养皿置于显微镜下。向培养皿中加入 20 mL Leibovitz L-15 培养基。当不使用显微镜时，应盖上培养皿盖子以减少污染。</li>
		<li>铺几层纸巾，并用 70% 乙醇彻底喷洒。将解剖器械（解剖剪、一对显微镊和组织镊）用 70% 乙醇充分喷洒后，放置在纸巾上备用。</li>
		<li>将出生后 0–2 天的小鼠置于纸巾上，并用 70% 乙醇彻底喷洒小鼠体表。使用解剖剪将小鼠断头（遵循机构批准的操作规程）。</li>
		<li>轻轻固定头部，从颈部至鼻部沿中线切开颅骨。用组织镊将颅骨向两侧剥离，暴露脑组织。</li>
		<li>使用组织镊，将镊子插入脑组织下方，轻柔地将脑组织整体取出。立即将脑组织放入&#160;含有 20 mL Leibovitz L-15 培养基的培养皿中。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用显微镊小心去除脑干和脑膜。将处理后的脑组织收集至一个含有 5 mL Leibovitz L-15 培养基的 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织解离、接种及混合胶质细胞培养的维持 
	注意：后续所有步骤均需在生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>使用无菌一次性手术刀片将脑组织切成约 1 mm2 大小的组织块。小心地将切碎的脑组织转移至一个新的无菌 50 mL 离心管中。</li>
		<li>向脑组织中加入终浓度为 0.25% 的胰蛋白酶，于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。每 2–3 分钟轻轻倒置离心管混合一次，以促进组织解离。</li>
		<li>从 5% CO2 培养箱中取出含有 5 mL PO 的 T-75 培养瓶，转移至生物安全柜中。弃去 PO 溶液，并用无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养瓶 3 次。务必充分冲洗，因为残留的 PO 对细胞具有毒性。</li>
		<li>将消化完成的组织从 37 °C 水浴中取出，转移至生物安全柜中。加入 5 mL 完全胶质细胞培养基以中和胰蛋白酶活性。使用 10 mL 移液器轻柔混匀组织悬液。</li>
		<li>将无菌 70 µm 尼龙网细胞筛置于无菌 50 mL 圆锥形离心管上，并通过加入约 5 mL L-15 培养基润湿滤网。小心地将细胞悬液倾倒过筛。取下无菌 1 mL 注射器的活塞，用活塞在滤网上研磨组织，以去除组织团块，获得均一的单细胞悬液。</li>
		<li>定期向 70 µm 尼龙网上加入约 5 mL Leibovitz L-15 培养基，并继续用 1 mL 注射器活塞在滤网上研磨组织。当滤网上几乎无可见组织残留时，弃去滤网，将细胞悬液暂存备用。</li>
		<li>通过轻柔吹打混匀细胞悬液。向每个培养瓶中加入等体积的细胞悬液（每份含 1–2 个脑组织）和胶质细胞培养基，使终体积为 15 mL。</li>
		<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育过夜。次日，用无菌 1× PBS 洗涤培养瓶两次，以去除未贴壁的细胞和碎片。</li>
		<li>向培养瓶中加入 15 mL 新鲜的完全胶质细胞培养基，于 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养。3 天后，更换一半培养基（加入 10 mL 新鲜胶质细胞培养基，并补充 40 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子（MCSF））。 
		注意：此后每隔 3 天，均以 10 mL 含 40 ng/mL MCSF 的新鲜胶质细胞培养基更换一半原有培养基。微胶质细胞收获前，培养物维持培养 8–10 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 原代神经元培养
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>从 B-27 Plus 神经元培养系统中取出 B-27 Plus 补充剂并解冻。将来自 B-27 Plus 神经元培养系统的 Neurobasal Plus 培养基、1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS）和热灭活胎牛血清（FBS）在 37 °C 水浴中预热。</li>
		<li>用 5 mL 浓度为 10 µg/mL 的多聚鸟氨酸（PO）包被 T-25 培养瓶，并在 37 °C 下孵育至少 1 小时。准备解剖所需的器械和耗材。 
		注意：此包被步骤有助于细胞在 T-25 培养瓶上的黏附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>E16–E18 小鼠胚胎的脑组织分离 
	注意：所有解剖工具均需灭菌，并保持试剂无菌。整个操作过程中应严格遵守无菌技术。
	<ol>
		<li>开始解剖前，使用 70% 乙醇或消毒喷雾对操作台面进行喷洒消毒。设置好解剖显微镜，并将培养皿置于显微镜下。向培养皿中加入 20 mL 的 1× HBSS。当不使用显微镜时，请盖上培养皿盖子以减少污染。</li>
		<li>铺上几层纸巾，并用 70% 乙醇彻底喷洒纸巾。将解剖工具（弹簧剪、一对显微镊和组织镊）用 70% 乙醇充分喷洒后，放置在纸巾上备用。</li>
		<li>使用异氟烷对妊娠第 16–18 天的怀孕小鼠进行麻醉，并通过颈椎脱位法处死小鼠（遵循机构批准的操作规程）。</li>
		<li>将小鼠仰卧放置在浸有 70% 乙醇的纸巾上。用 70% 乙醇对腹部区域进行消毒。用组织镊提起下腹部皮肤，使用解剖剪从该点向肋骨下缘做 V 形切口。</li>
		<li>用组织镊夹住含有胚胎的子宫角，轻柔地将胚胎从腹腔中取出。短暂地用 70% 乙醇对含有胚胎的子宫角进行消毒。</li>
		<li>每次从独立的胎膜中取出一个胚胎。使用弹簧剪从颈部后方至鼻部沿中线在颅骨顶部做切口。然后将颅骨从切口处掀开以暴露脑组织。用组织镊轻轻取出脑组织，并将其转移至含有 15 mL 1× HBSS 的 10 cm 培养皿中。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用一对显微镊小心去除脑干以及大脑皮层两侧的脑膜。将大脑皮层组织转移至含有 10 mL 1× HBSS 的 50 mL 圆锥形离心管中，并置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织解离及皮层神经元的细胞培养接种 
	注意：后续所有步骤均应在生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>使用无菌一次性手术刀片在 50 mL 圆锥形离心管中将脑组织切成约 1 mm2 大小的组织块。将切碎的脑组织转移至一个新的无菌 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>向管中加入胰蛋白酶，使其终浓度为 0.25%。将离心管浸入 35–38 °C 的热水浴中 15 分钟，并每隔 2–3 分钟轻轻混匀一次，以使组织均匀化。</li>
		<li>将离心管从热水浴中取出。用移液器轻轻吹打组织悬液，进一步解离细胞，然后向匀浆液中加入 0.5 mL 热灭活 FBS 以中和胰蛋白酶活性。避免产生气泡，以尽量减少对神经元细胞的毒性。</li>
		<li>将无菌的 70 µm 尼龙网细胞筛置于无菌的 50 mL 圆锥形离心管上，并通过加入约 5 mL Neurobasal 培养基润湿滤网。将细胞悬液通过 70 µm 尼龙网细胞筛过滤。使用 1 mL 注射器活塞轻轻研磨组织使其通过细胞筛。在持续研磨过程中，定期加入约 5 mL 的 1× HBSS 以冲洗细胞筛。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。在此期间，将 B-27 Plus 补充剂用 Neurobasal Plus 培养基稀释至 1× 终浓度，作为完全 Neurobasal 培养基使用。</li>
		<li>弃去 T-25 培养瓶中的 PO 溶液，并用 5 mL 1× PBS 洗涤培养瓶三次。</li>
		<li>小心倾去上清液，用 2–3 mL 完全 Neurobasal 培养基轻轻吹打重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板和台盼蓝染色测定细胞浓度和总细胞数。每个胚胎可获得最多约 1.0 × 107 个细胞。</li>
		<li>将细胞以每瓶约 2.0 × 107 个细胞的密度接种至 PO 包被的 T-25 培养瓶中，每瓶加入 5 mL 完全 Neurobasal 培养基。将细胞培养物置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。</li>
		<li>每 2–3 天进行一次半量换液，即从培养瓶中更换 2.5 mL 培养基为新配制的完全 Neurobasal 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原代神经元与小胶质细胞的共培养
注意：所有后续步骤均须在无菌生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在96孔板中接种神经元
	<ol>
		<li>每孔加入100 µL浓度为10 µg/mL的PO，于37 °C孵育至少1小时，使PO包被孔板。接种细胞前用1×PBS洗涤孔板3次，最后一次洗涤后吸除残留液体。</li>
		<li>在T-25培养瓶中培养的神经元于培养2–5天后用于共培养。将培养基更换为5 mL含0.25%胰蛋白酶和1 mg/mL DNase I的1×Versene溶液，以使神经元从培养瓶上脱落。将培养瓶放入培养箱中消化5–6分钟，每2–3分钟轻轻摇晃一次，以促进细胞脱落。</li>
		<li>将培养瓶从培养箱中取出，在显微镜下观察细胞是否已脱落。加入0.5 mL热灭活的FBS以中和胰蛋白酶和DNase I。将细胞转移至15 mL锥形管中。用5 mL完全神经基础培养基洗涤培养瓶一次，以最大程度回收神经元。将所有细胞收集至同一15 mL锥形管中。</li>
		<li>在4 °C条件下，以300 × g离心细胞悬液5分钟。弃去上清液，轻柔地将细胞沉淀重悬于2–3 mL完全神经基础培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，并加入完全神经基础培养基，使最终细胞浓度为7.5 × 105个神经元/mL。向每个已包被PO的96孔板孔中加入100 µL细胞悬液，使每孔含有7.5 × 104个神经元。每瓶预计可获得500–600万个神经元。</li>
		<li>将神经元在96孔板中培养过夜。次日向每孔加入100 µL完全神经基础培养基。 
		&#8203;注意：当神经元表现出适当的神经突生长（约在96孔板接种后第3–4天），即可用于与小胶质细胞共培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小胶质细胞的分离及与神经元的共培养
	<ol>
		<li>在混合胶质细胞培养8–10天期间，使用10 mL移液器以胶质细胞培养基轻柔冲洗每个T-75培养瓶，收集小胶质细胞，并将细胞与培养基转移至无菌50 mL锥形管中。再用10 mL新鲜胶质细胞培养基洗涤培养瓶一次，以进一步脱离附着的小胶质细胞并收集培养基。每瓶预计可获得7.5 × 105个小胶质细胞。</li>
		<li>向每个培养瓶中加入20 mL新鲜胶质细胞培养基，并补充20 ng/mL MCSF。若维持混合胶质细胞培养，可再收获一次或两次小胶质细胞。</li>
		<li>在4 °C条件下，以300 × g离心收集的细胞5分钟。小心弃去上清液，轻柔地将细胞沉淀重悬于2 mL完全神经基础培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板和台盼蓝对细胞进行计数。加入完全神经基础培养基，使最终细胞浓度为2.5 × 105个细胞/mL。</li>
		<li>从96孔神经元培养板中移除每孔100 µL神经基础培养基，加入100 µL浓度为2.5 × 105个细胞/mL的细胞悬液，使每孔接种2.5 × 104个小胶质细胞至含7.5 × 104个神经元的孔中。将共培养体系在37 °C、5% CO2培养箱中培养过夜，使小胶质细胞贴附。此后，该共培养体系可用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

 Primary Microglia and Neuron Co-Culture Protocol for CNS Interaction Studies

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种分离和培养小鼠原代神经元及原代小胶质细胞的实验方案，随后可用于建立小胶质细胞-神经元共培养体系，以研究小胶质细胞与神经元之间的相互作用如何调控其细胞健康与功能。这一相对简单且易于实施的方法可为深入了解中枢神经系统中小胶质细胞与神经元相互作用的机制及其功能结果提供关键信息。
为了获得最佳的共培养效果，本方案中有几个关键环节需要特别注意。在进行脑组织分离时（步骤 1.2.6 和 2.2.7），必须在收集组织前彻底清除附着在胚胎期和出生后脑组织表面的脑膜。与其他神经胶质细胞实验方案类似，若脑膜去除不完全，可能导致培养物被内皮细胞或血液来源的细胞污染40,41,42。此外，在原代神经元培养过程中（步骤 2.3.7 和 3.1.4），接种神经元至培养瓶或 96 孔板前，必须制备单细胞悬液并避免细胞团块的形成。神经元聚集体在培养中无法正常贴壁，会导致神经元过度应激和大量细胞死亡。同时，在尝试将神经元从 T-25 培养瓶中解离时，长时间的胰蛋白酶处理可能引起非预期的细胞死亡（步骤 3.1.2）。为减轻这一问题，可在从胚胎脑组织解离后，直接将神经元以目标细胞密度接种至 96 孔板（步骤 2.3.7）。此外，本方案中选择 3:1 的神经元:小胶质细胞比例，以部分模拟神经炎症过程中中枢神经系统微环境中可能升高的小胶质细胞数量。&#160;当然，共培养体系中细胞的比例也可根据具体实验需求进行调整。此外，若需评估更为成熟的神经元状态，可延长共培养所用神经元的培养时间点。
值得注意的是，在将神经元从T-25培养瓶解离至96孔板时，单独使用胰蛋白酶可能导致解离不完全，从而在96孔板中形成细胞团块，而非单层细胞培养物（图2D）。为解决此问题，可使用含1 mg/mL DNase I的1× Versene溶液将神经元从T-25培养瓶中解离。其他导致神经元聚集和存活率降低的因素包括：细胞悬液吹打不充分、使用热灭活胎牛血清对胰蛋白酶中和不充分、离心过度或细胞沉淀形成时间过长。因此，确保组织充分解离并获得单细胞悬液，对于建立健康的小胶质细胞与神经元共培养体系至关重要。
本方案旨在重现小胶质细胞-神经元相互作用 体外 以更好地理解它们在中枢神经系统中相互作用的功能重要性。尽管已开发出其他类型的共培养系统，例如将不同细胞群体分别培养在不同表面上，以实现对两种细胞群体的独立处理43,44，这种混合培养系统可实现小胶质细胞与神经元之间的直接且紧密接触。此外，若通过每3天进行半量换液的方式妥善维持，该混合培养系统可保持健康状态达12天以上（图 3F可延长至3周，从而支持对神经元-小胶质细胞相互作用的长期研究45.
尽管共培养系统的相对简便性有利于其推广应用，但该方法的一个关键局限在于二维细胞培养无法充分模拟中枢神经系统（CNS）组织的微环境。事实上，小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的三联培养已被证明可更好地模拟 体内 比小胶质细胞或星形胶质细胞-神经元共培养更可靠地模拟神经炎症反应46,47此外，近期在脑类器官系统中引入小胶质细胞及其他胶质细胞（包括星形胶质细胞和少突胶质细胞）的研究进展，更适用于研究中枢神经系统（CNS）的三维（3D）组织结构及其细胞间相互作用。48类似地，一种包含神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的人源三维三细胞共培养系统被证明在模拟阿尔茨海默病状态方面具有有效性49其他人类小胶质细胞-神经元共培养体系可能更接近神经退行性疾病研究的生理相关性。例如，由人类诱导多能干细胞分化而来的小胶质细胞与运动神经元的共培养50 可能有助于研究肌萎缩侧索硬化等疾病51然而，鉴于从小鼠中获取原代神经元和小胶质细胞相对丰富且成本较低，在96孔板中建立小胶质细胞-神经元共培养体系，可成为研究小胶质细胞与神经元相互作用机制及其功能意义的高通量方法。后续检测可包括：利用活细胞成像实时分析细胞功能变化、RNA测序分析细胞转录组变化、免疫荧光显微镜检测细胞表型变化、质谱分析细胞&#160;以及蛋白质组学变化，或使用酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹法检测共培养上清液中分泌的蛋白质。
由于小胶质细胞在中枢神经系统健康与疾病中发挥重要的介导作用，该共培养体系也可用于研究与疾病相关的分子和化合物对小胶质细胞-神经元双向通讯的影响。在多发性硬化（MS）背景下，活化的小胶质细胞可能发挥破坏性作用，加剧病理进程52,53。例如，它们可分泌促炎性细胞因子和活性氧物质，并促进星形胶质细胞的活化45。本方案可通过在共培养体系中用在MS中升高的炎性细胞因子处理小胶质细胞，并评估神经元健康状况，从而进一步探究小胶质细胞的有害作用。此外，已有研究利用该小胶质细胞-神经元共培养体系，证明了小胶质细胞在应对氧化型磷脂酰胆碱（一种在MS中发现的氧化产物）时对神经元的保护作用54。此外，神经元凋亡在发育过程中通过促进小胶质细胞存活和吞噬作用，重塑其基因表达55。因此，本方案也有助于确定神经元死亡对小胶质细胞表型和功能的影响。
总之，该方案描述了原代小鼠来源神经元和小胶质细胞的制备及其共培养方法 体外在96孔板中建立的小胶质细胞-神经元共培养体系可作为一种高通量方法，用于研究小胶质细胞在中枢神经系统健康与疾病（包括多发性硬化症）状态下与神经元相互作用的机制与功能。

小胶质细胞是驻留于中枢神经系统（CNS）的组织巨噬细胞，参与免疫监视和维持内环境稳态1,2,3。它们起源于卵黄囊的红系-髓系祖细胞，在胚胎发育期间定植于大脑4,5,6&#160;，并通过自我更新（包括增殖和凋亡）在整个生物体生命周期中得以维持7。在稳态条件下，静息状态的小胶质细胞具有分支状形态，并执行组织监视功能8,9,10。
小胶质细胞表达多种细胞表面受体，使其能够快速响应中枢神经系统（CNS）的变化11,12，并在感染或组织损伤12,13,14以及神经退行性疾病9,15（如&#160;多发性硬化症（MS）16,17）过程中促进炎症反应。小胶质细胞还表达多种神经递质和神经肽的受体18,19,20，这表明它们可能也参与神经元活动的响应与调控21,22。事实上，小胶质细胞与神经元之间存在多种形式的双向通讯8,23，包括由膜蛋白介导的直接相互作用，或通过可溶性因子或中间细胞进行的间接相互作用23,24。
例如，神经元分泌的多种神经递质可以调节小胶质细胞的神经保护或炎症活性25,26,27。此外，神经元与小胶质细胞之间的直接相互作用有助于维持小胶质细胞的稳态28。相反，小胶质细胞与神经元的直接相互作用也可塑造神经元环路29，并影响神经元信号传导30,31,32。由于这些相互作用的破坏会导致神经元过度兴奋30以及&#160;小胶质细胞反应性增强33,34，因此失调的小胶质细胞-神经元相互作用&#160;被认为&#160;是导致&#160;神经系统疾病的一个促成因素33,35。事实上，已有研究报道精神疾病23,26和神经退行性疾病中存在小胶质细胞-神经元相互作用的功能障碍33。尽管这些观察结果凸显了小胶质细胞与神经元在中枢神经系统中通讯的重要性，但这些相互作用在健康和疾病状态下调控小胶质细胞及神经元功能的具体机制仍相对不明确。
在中枢神经系统等复杂环境中，多种环境因素均可影响小胶质细胞与神经元之间的相互作用，这限制了对短暂细胞间相互作用的研究能力 体内在此，我们介绍一种 体外 小胶质细胞-神经元共培养系统，可用于研究小胶质细胞与神经元之间的直接细胞相互作用。本方案描述了分别从出生后0-2天的新生小鼠大脑皮层和胚胎期16-18天的小鼠大脑皮层中分离原代小胶质细胞和神经元的方法。随后将神经元与小胶质细胞共同培养于96孔板中，以用于后续高通量实验。我们此前利用该方法证明了小胶质细胞的吞噬作用可保护神经元免受氧化型磷脂酰胆碱介导的细胞死亡37，表明该方法有助于理解小胶质细胞在神经退行性疾病和多发性硬化症背景下的作用。类似地，小胶质细胞-神经元共培养体系也可用于研究小胶质细胞与神经元之间相互作用在其他情境下的影响，例如病毒感染。38 或神经元损伤与修复39总体而言， 体外 小胶质细胞-神经元共培养系统&#160;使研究人员能够在可调控且受控的环境中研究小胶质细胞与神经元的相互作用，从而补充 体内 模型.

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>07-202-011</td><td>无菌</td></tr><tr><td>1x Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus 神经元培养系统&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>A3653401</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 培养基 (1x)</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>巨噬细胞集落刺激因子&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>微型镊子</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td>经高压灭菌/无菌</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Cytiva</td><td>SH3023801</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液 (100x)</td><td>Gibco</td><td>103780-16</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多聚-L-鸟氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>RWD</td><td>S11008-42</td><td>经高压灭菌/无菌</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Feather</td><td>08-916-5D</td><td>无菌</td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Fisher</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Codman</td><td>30-4218</td><td>经高压灭菌/无菌</td></tr><tr><td>组织剪</td><td>RWD</td><td>S12052-10</td><td>经高压灭菌/无菌</td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Sci&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 (2.5%)</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>宽场免疫荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生成并共培养小鼠原代小胶质细胞与皮层神经元

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻组织巨噬细胞，具有多种支持神经元健康和维持CNS稳态的功能。它们是与CNS疾病活动相关的主要免疫细胞群体，可表现出&#160;可能在多发性硬化症（MS）等慢性神经退行性疾病期间对神经元损伤起作用的活化表型。由于难以解析其复杂性，小胶质细胞在健康和疾病状态下调控神经元功能与存活的具体机制仍知之甚少 体内 小胶质细胞、神经元及其他中枢神经系统环境因素之间的相互作用。因此，该 体外 共培养小胶质细胞和神经元的方法仍是研究小胶质细胞-神经元相互作用的有力工具。本文介绍了一种从小鼠中分离原代小胶质细胞和神经元并进行共培养的实验方案。具体而言，小胶质细胞在培养9-10天后被分离 体外 从出生后0-2天的新生小鼠脑组织匀浆建立的混合胶质细胞培养物中分离。神经元细胞从胚胎期16-18天的小鼠胚胎大脑皮层中分离。4-5天后 体外神经元细胞接种于96孔板中，随后加入小胶质细胞以建立共培养体系。该方案中精确的时间控制至关重要，因为两种细胞均需达到实验所需的成熟状态才能成功建立共培养。总体而言，该共培养体系可用于研究小胶质细胞与神经元之间的相互作用，并可提供多种检测读数，包括免疫荧光显微镜、活细胞成像以及RNA和蛋白质检测。

显示小胶质细胞混合胶质细胞培养关键步骤的流程图如图所示 图1A总体而言，第1天预计细胞稀疏且细胞碎片过多图1B。到第4天时，应观察到细胞数量增加，尤其是出现具有伸长形态的贴壁星形胶质细胞，表明其已生成（图1C)。可观察到少量小胶质细胞位于星形胶质细胞层上方，或呈小圆形细胞悬浮于培养基中。至第8天，星形胶质细胞将形成融合的单层贴壁细胞层，而小胶质细胞则呈现为圆形、明亮的细胞，部分贴附于星形胶质细胞表面或悬浮于培养基中。图 1D若第8天时小胶质细胞密度较低，可在收获前继续培养数天。
神经元培养关键步骤的流程图如图所示 图 2A在健康的培养环境中，神经元将在1-3天内贴壁并形成神经突起。 体外 (图2B）。同样，在将神经元接种到96孔板后，它们最初会呈现圆形，但到第3天，神经元应已贴壁并长出神经突，与邻近的神经元形成连接。图2C）。相反，不健康的神经元培养物中会含有细胞团块和细胞碎片，这可能是由于细胞解离不充分或神经元操作不当所致（图 2D).
显示小胶质细胞-神经元共培养方案关键步骤的流程图如图所示 图 3A. 加入 2.5 x 104 小胶质细胞至 7.5 x 104 神经元、呈圆形且较大的小胶质细胞应出现在神经元或神经突起过程的上方或其间图3B）。为了进一步观察小胶质细胞-神经元共培养体系，单独培养或共培养的小胶质细胞和神经元分别用钙离子结合接头分子1（IBA-1，红色）和微管蛋白βIII（TUJ1，绿色）抗体进行标记37 用于免疫荧光显微镜观察（图3C-F).
<img alt="神经细胞培养流程；分离与孵育步骤示意图；显微镜图像，细胞形态学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1原代小胶质细胞培养概述 (A) 混合胶质细胞培养制备关键步骤的流程图。 (B-D) 混合胶质细胞培养第1天的代表性10倍明场显微镜图像（B），第4天（C），以及第8天（D). 比例尺： 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠胚胎神经元培养示意图；第1至3天T-25培养瓶和96孔板的分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：原代神经元培养流程概览。（A）神经元制备关键步骤的流程图。（B）T-25培养瓶中培养的神经元的代表性10倍明场显微镜图像。（C）96孔板中培养的神经元的代表性10倍明场显微镜图像。（D）96孔板中不健康神经元簇的代表性10倍明场显微镜图像。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小胶质细胞分离与培养过程；24小时、48小时显微图像；免疫荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小胶质细胞-神经元共培养示意图。（A）小胶质细胞-神经元共培养关键步骤的流程图。（B）96孔板中小胶质细胞-神经元共培养的代表性10倍明场显微图像。比例尺：100 µm。（C,D）96孔板中单独培养的神经元（C）、单独培养的小胶质细胞（D）、共培养第2天（E）以及共培养第12天（F）的代表性免疫荧光显微图像。小胶质细胞和神经元分别用IBA-1（红色）和tubulin βIII（绿色）标记。细胞核用DAPI（蓝色）染色。免疫荧光图像采用25倍、0.8 NA水浸物镜在宽场荧光显微镜下获取。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种小胶质细胞-神经元共培养体系，该体系由从小鼠胚胎第15-16天分离的原代神经元细胞以及从出生后第1-2天新生小鼠脑组织中获取的原代小胶质细胞建立而成。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻组织巨噬细胞，执行多种支持神经元健康和CNS功能的生理作用……

我们的研究旨在探讨在多发性硬化等疾病状态下神经元与小胶质细胞之间的相互作用。我们力求在体外重现小胶质细胞与神经元的相互作用，以更深入地理解其在中枢神经系统中的功能重要性。我们先前已通过该共培养体系证实，小胶质细胞的吞噬作用可保护神经元免受氧化型磷脂酰胆碱介导的细胞死亡。尽管也使用其他共培养系统，但这种混合培养系统能够实现小胶质细胞与神经元之间的直接且紧密接触。此外，该系统可维持健康状态从12天至长达三周，从而支持对神经元-小胶质细胞相互作用的长期研究。我们的实验方案提供了一种简单且易于实施的方法，用于共培养小胶质细胞和神经元，这些细胞易于操作，并可进一步应用于下游检测，以确定细胞功能的变化。

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