Name: 了解携带植物样激酶亚型等位基因的突变疟疾寄生虫中补偿途径的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 了解携带植物样激酶亚型等位基因的疟疾寄生虫中补偿途径的发展机制。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，探索双重激酶抑制策略以规避抗药性问题。

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我们感谢贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学生命科学学院中央仪器设施提供的支持和设备。同时衷心感谢生物技术部门（BT/PR28256/MED/29/1313/2018）向AB提供的经费支持。我们感谢Jose-Juan Lopez-Rubio提供pL6eGFP和pUF1质粒。资助机构在本研究的准备及发表决策过程中未发挥任何作用。MS是科学与工业研究理事会JRF-SRF奖学金的获得者。

Identifying Kinases Rewiring in Malaria Parasite: A Chemical Genetics Approach

作者无利益冲突。

一种含有功能低下等位基因的突变转基因寄生虫的构建 cdpk1 基于 体外 使用重组酶进行激酶活性数据分析。最好尽可能构建多种具有不同看门人残基的突变型重组蛋白。由于 恶性疟原虫 基因组富含AT，因此在其中表达重组蛋白时 E. coli 可能需要进行密码子优化。这将有助于全面评估看门人残基替换对突变激酶活性的影响。选择导致转磷酸化潜能降低的看门人残基替换，用于构建等位基因置换转基因寄生虫。同时，应将完全消除激酶转磷酸化活性的看门人残基替换作为阴性对照。在构建等位基因置换寄生虫时，另一个重要考虑因素是：在引入测试突变和阴性对照突变的同时，还需引入一个同义突变。构建包含同义突变的寄生虫 cdpk1 位点可作为重要的内参对照，以排除引入测试突变时可能产生的技术误差。此外，携带同义突变的转基因寄生虫可作为所有比较研究的对照，替代野生型（WT）寄生虫。
我们已采用双质粒系统来生成看门人突变寄生虫32,35。然而，通过使用单质粒系统替代双质粒系统，可提高在目标位点引入SNP的效率41。在单质粒系统中，CRISPR-Cas9介导基因编辑所需的所有关键元件均被整合到单个质粒中，而非两个质粒中。该单质粒编码Cas9内切酶，转录由tracrRNA和向导RNA组成的sgRNA，并包含一段同源臂，用于修复Cas9内切酶在目标位点引入的双链断裂。在双质粒系统中，寄生虫需同时转染两个质粒。由于在双质粒系统中同时获得两个质粒的寄生虫数量较单质粒系统更低，因此双质粒系统的CRISPR介导基因编辑效率低于单质粒系统。另一种可选策略是采用自杀-拯救策略42&#160;，其中同源臂以线性片段形式或不含药物筛选标记的质粒（拯救质粒）提供，而Cas9内切酶和编码向导RNA的sgRNA则由含有药物筛选盒的质粒（自杀质粒）提供。由于不含药物筛选盒的线性片段或质粒在寄生虫复制过程中更易丢失，因此Cas9内切酶在目标位点引入的双链断裂必须迅速利用仅在有限时间内存在的同源臂进行修复。该策略相较于双质粒系统具有一些优势，包括更高的效率，且无需将同源臂亚克隆至另一质粒中。此外，也可考虑其他CRISPR-Cas9基因编辑变体用于在目标位点引入SNP43。
我们手动选择了在cdpk1位点引入T145M替换的引导区域。可使用多种免费的在线软件（如Chopchop44、CRISPOR45、CCTop46、Cas-OFFinder47）来选择在目标位点引入双链断裂的合适引导序列。这些软件除了提供每条引导序列的效率外，还提供脱靶和特异性评分，有助于提高CRISPR-Cas9介导的基因编辑实验的成功率。
目前有多种可用于疟原虫转染的方法。我们通常使用环状体阶段的疟原虫进行转染实验48,49，但也有研究成功采用预先将质粒导入红细胞（RBCs）的方法进行疟原虫转染50。该方法通过电穿孔技术，在特定参数条件下将质粒转染至红细胞中，随后利用这些红细胞感染纯化的晚期阶段疟原虫。疟原虫侵入已预先加载质粒的红细胞，并在其生长过程中通过尚不明确的机制摄取质粒DNA50。另一种可用于疟原虫转染的方法则需要使用高度成熟的纯化裂殖体阶段疟原虫，直接与质粒进行转染。该方法所使用的转染仪器为4D-nucleofector51。不同研究团队在选择转染方法时会根据可用资源和成功率而有所不同。建议先测试上述三种方法中哪一种适用于特定实验团队，并在后续转染实验中采用该方法。也可连续应用两种方法以进一步提高转染效率。例如，首先使用环状体阶段疟原虫进行第一轮转染，随后加入预先加载质粒的新鲜红细胞。
根据以往文献报道或CDPK家族成员的存在情况，我们仅选择少数基因对CDPK1T145M寄生虫与对照组进行转录分析。然而，为了全面了解携带CDPK1功能低下等位基因的转基因寄生虫中全局转录重编程的情况，可采用RNA-Seq或微阵列等方法。
本研究中采用的方法可应用于疟原虫的其他激酶，以了解药物压力下补偿机制的发展。通过该技术获得的信息可能有助于策略性地部署联合用药，以避免药物耐药性的产生和传播。针对表现出功能互补的两种或多种激酶，是比靶向单一激酶更优的疟疾防控与消除策略。

疟疾是最主要的传染病之一，每年导致数百万人死亡，尤其在5岁以下儿童中尤为严重1。目前尚无临床可用的疟疾疫苗。此外，最致命的人类疟原虫——恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）已对一线药物青蒿素产生耐药性2,3,4,5。迫切需要鉴定新的药物靶点和可快速部署的新型策略，以防止青蒿素耐药性在全球范围内传播。深入了解药物作用机制及补偿通路的分子基础，有助于制定更有效的策略，防止耐药性的产生。
属于钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）家族的蛋白激酶在疟原虫的红细胞内期、有性期和红细胞前期发育的多个阶段均发挥关键作用6。在P. falciparum无性复制过程中，CDPK5在裂殖体成熟后裂殖子释放过程中起着至关重要的作用7。条件性敲除CDPK5会导致裂殖体无法将裂殖子释放入血液，从而导致寄生虫死亡。CDPK5介导的寄生虫逸出分子机制尚未完全阐明，目前认为可能涉及蛋白激酶G（PKG）作为其上游调控因子7,8。CDPK7对环状体阶段寄生虫向滋养体阶段的成熟至关重要9。CDPK4是CDPK家族中另一成员，对疟原虫在蚊体内的有性阶段发育至关重要，参与配子形成过程中的多个步骤，因此对游离、可动的雄性配子的形成具有关键作用10,11,12,13。CDPK1可磷酸化内膜复合物和棒状体的组分14,15。此外，条件性敲除CDPK1会导致参与红细胞侵入的蛋白发生低磷酸化16。研究表明CDPK1可调控侵入过程中顶质体细胞器的释放17。CDPK1还通过磷酸化SERA5蛋白酶协助裂殖子从感染的红细胞中逸出18。磷酸化的CDPK1优先定位于裂殖子的顶端，在此可能与侵入过程所需的其他寄生虫蛋白相互作用19,20。CDPK1还参与雄性和雌性配子的形成，这是疟疾传播及疟原虫在蚊体内进行有性发育的关键步骤21。
化学遗传学方法历史上已被用于鉴定哺乳动物激酶的功能作用22,23。该方法利用在“守门残基”（gatekeeper position）位点用具有不同侧链的氨基酸取代原有残基。守门残基的改变会调节相邻ATP结合口袋的大小，从而改变一类称为“空间位阻激酶抑制剂”（bumped kinase inhibitors, BKIs）的化合物对突变酶的可及性，相较于野生型酶有所不同。将守门位点的大体积残基替换为较小的残基可使BKIs得以进入并结合，而反向替换则使激酶对BKIs产生抗性。在某些情况下，守门残基的替换会导致目标激酶活性下降，从而使该修饰不适用于功能研究24,25。这种守门残基替换对酶活性的负面影响可通过在不耐受的激酶中引入第二位点的抑制性突变来逆转25。化学遗传学方法已被应用于研究顶复门原虫蛋白激酶的功能。含有较小守门残基的野生型CDPK4可被空间位阻激酶抑制剂BKI-1和1294选择性抑制，从而阻断雄性配子形成和卵囊发育11,12。将CDPK4中较小的守门残基替换为体积较大的甲硫氨酸残基后，在鞭毛体出芽（exflagellation）过程中BKIs介导的抑制作用显著降低11。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）的CDPK1是一种与疟原虫亲缘关系密切的顶复门寄生虫蛋白激酶，已被证明参与速殖子对宿主细胞的运动和侵袭过程26,27。研究人员利用野生型TgCDPK1较小的守门口袋结构设计出特异性抑制剂，可在动物模型中减轻疾病致病性28,29。通过使用特异性药理学抑制剂抑制恶性疟原虫（P. falciparum）蛋白激酶G（PKG）的活性，已证实其参与裂殖体晚期发育及配子形成过程30,31。将守门位点的苏氨酸替换为谷氨酰胺（T618Q）后，突变酶对抑制剂的敏感性显著降低，导致配子发生和裂殖子向环状体转化过程恢复正常30,31。
以往大多数研究均采用化学遗传学方法对靶标激酶进行功能表征11,12,22,23,26,30,31，然而，我们采用该方法旨在理解携带蛋白激酶功能低下等位基因的寄生虫中补偿机制的形成过程。我们先前的研究表明，将CDPK1中的野生型“守门残基”替换为甲硫氨酸（T145M）会导致该突变酶的转磷酸化能力下降约47%32。携带cdpk1功能低下等位基因（cdpk1t145m）的突变寄生虫通过其他CDPK家族成员的转录重编程，已预先适应CDPK1活性的降低。我们认为，该策略可普遍用于阐明携带必需蛋白激酶功能低下等位基因的突变寄生虫中的补偿机制。在抑制靶标激酶的同时，可联合抑制其他部分补偿靶标激酶功能的激酶，以防止针对单个激酶的药物耐药性产生。这可能为疟疾防控提供更有效的策略。

<table><tbody><tr><td>1× 磷酸酶抑制剂混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>抗-GST 抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 HRP 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>离心机（用于细菌细胞沉淀）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>离心机（用于寄生虫沉淀/处理）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (TX-400 转子)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS 感受态细胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5α 感受态细胞</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP 化学发光试剂</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽 Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，游离酸</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>次黄嘌呤</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>In-fusion HD 克隆试剂盒</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP，去磷酸化</td><td>&amp;nbsp;Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 凝胶和 PCR 纯化小量试剂盒</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>对硝基苄基甲磺酸酯（PNBM）</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA 聚合酶</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Qiaprep Spin Miniprep 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL 定点突变试剂盒</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 第一链合成试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>硫代磷酸酯抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

一种通过颠覆药物作用效果的机制&#160;疟原虫通过重编程其转录组实现这一效应。对于属于多基因家族的靶基因，该效应更为显著。 恶性疟原虫 属于CDPK家族的蛋白激酶对疟原虫血液阶段的发育至关重要，因此CDPK被认为是开发抗疟化合物的理想靶点。化学遗传学方法在历史上已被用于阐明高等真核生物中蛋白激酶的功能。该方法需要通过遗传操作将“看门人”残基替换为具有不同侧链的另一种氨基酸。看门人位点的氨基酸替换可调节蛋白激酶的活性，并改变其对一类称为“碰撞激酶抑制剂”（bumped kinase inhibitors, BKIs）的化合物的敏感性，从而有助于目标基因的功能鉴定。在此，我们利用化学遗传学方法研究了携带CDPK基因功能低下等位基因的突变寄生虫所演化出的补偿机制。 cdpk1总体而言，我们的方法有助于识别可能被同时靶向的代偿通路，以防止针对单个激酶的药物耐药性产生。

重组野生型CDPK1以N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签融合蛋白的形式表达，并通过GST亲和层析纯化。纯化的CDPK1蛋白通过抗CDPK1抗体和抗GST抗体在Western blot中检测到图1）。利用定点突变技术，将野生型CDPK1中的苏氨酸“门控”残基（T145）分别替换为甲硫氨酸和丝氨酸，从而获得CDPK1T145M和CDPK1T145S突变型重组蛋白（图2). 体外 激酶活性检测用于评估所有重组CDPK1蛋白的激酶活性。采用半合成表位标记方法检测激酶活性。34 通过使用特异性抗体在蛋白质印迹（Western blot）中检测硫代磷酸酯基团（图3). 通过定量分析各自的自磷酸化和转磷酸化条带强度，评估了看门人残基替换对CDPK1自磷酸化活性以及对作为CDPK1外源底物的MBP进行转磷酸化的影响。具有甲硫氨酸看门人残基的CDPK1突变体保留了约53%的转磷酸化活性，而在看门人位置引入丝氨酸则完全消除了底物的转磷酸化能力（图3）。在内源基因中构建了导致看门残基由Thr变为Met（T145M）的SNP。 cdpk1 通过CRISPR-Cas9使用双质粒系统对基因座进行编辑图4 和 图5）。由于丝氨酸看门残基对CDPK1活性具有致死效应，未能成功构建T145S突变株。采用有限稀释法对CDPK1T145M突变株进行亚克隆，并通过Sanger测序验证看门残基的替换，以确认CDPK1T145M突变株的成功构建。利用实时PCR检测了11种不同激酶的转录水平，其中包括7种CDPK家族成员以及4种参与疟原虫裂殖体晚期发育的其他激酶。图6）。将CDPK1T145M突变体与野生型（WT）寄生虫中11种不同激酶的表达水平进行比较，并以看家基因为标准化参照。与野生型寄生虫相比，CDPK1T145M突变体中CDPK家族成员的转录表达发生变化（图6在CDPK1T145M突变体中表达水平升高的转录本可能在补偿CDPK1突变体寄生虫中CDPK1的功能。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg" /> 
图 1：全长重组野生型（WT）PfCDPK1 的表征。 将带有N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的全长WT CDPK1蛋白通过亲和层析纯化，并在10% SDS-PAGE上进行分离。如考马斯亮蓝R-250染色的聚丙烯酰胺凝胶所示，CDPK1迁移至预测的相对分子质量约87 kDa处。将SDS-PAGE上分离的重组蛋白转移至PVDF膜，并使用抗CDPK1和抗GST抗体进行Western blot分析。在SDS-PAGE上对应于全长重组CDPK1的条带可被两种抗体同时检测到，证实了该蛋白的身份。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg" /> 
图2：纯化重组CDPK1看门人突变蛋白的表征。（A）TgCDPK1与PfCDPK1的初级氨基酸序列比对（PlasmoDB登录号：PF3D7_0217500）。PfCDPK1第145位的苏氨酸对应于TgCDPK1中的第128位甘氨酸，即看门人位置（以红色标出）。（B）野生型CDPK1中由三联密码子ACC（黑色圆圈）编码的苏氨酸看门人残基（以红色标出）的示意图表示。通过定点突变将看门人残基替换，从而构建重组突变CDPK1蛋白：在CDPK1T145M中替换为甲硫氨酸（以黄色标出），在CDPK1T145S中替换为丝氨酸（以蓝色标出）。（C）重组野生型及CDPK1突变蛋白的SDS-PAGE图谱。重组野生型及看门人突变蛋白通过GST亲和层析纯化，并在SDS-PAGE上分离。所有重组蛋白的分子量均符合预期，约为87 kDa。M—分子量标记。（D）通过Western blot对重组CDPK1野生型及突变蛋白进行表征。将重组野生型及看门人突变蛋白在SDS-PAGE上分离后转移至PVDF膜进行Western blot检测。使用抗CDPK1抗体和抗GST抗体检测SDS-PAGE上对应于全长重组野生型及突变CDPK1蛋白的条带，确认了所有重组蛋白的身份。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg" /> 
图3：CDPK1 中的看门人氨基酸替换导致突变酶激酶活性降低。（A） CDPK1蛋白激酶活性检测的半合成表位标记策略示意图。图中仅展示转磷酸化活性。在ATP存在条件下，CDPK1蛋白对一种外源性底物（S，实心绿色方块）进行硫代磷酸化。&#947;S（实心黄色三角形），可转移的末端硫代磷酸基团来源）。通过p-硝基苄基甲磺酸酯（PNBM）处理，硫代磷酸化残基发生烷基化，形成硫代磷酸酯，随后用特异性识别烷基化硫代磷酸加合物的抗体进行检测。B) 体外 使用半合成表位标记方法进行激酶活性检测，以评估看门人残基替换对重组CDPK1突变蛋白自磷酸化及转磷酸化能力的影响。所有重组蛋白均表现出钙依赖性激酶活性。CDPK1的自磷酸化以及对髓鞘碱性蛋白（MBP，一种外源性底物）的转磷酸化仅在氯化钙（CaCl₂）存在时明显发生。2+），而在存在EGTA（一种特异性的Ca²⁺螯合剂）的情况下未检测到磷酸化2+ 离子。看门人突变体的自磷酸化活性降低，而CDPK1T145S中MBP的转磷酸化完全被消除。CDPK1T145M保留了转磷酸化能力（约53%），与先前报道一致。32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg" /> 
图4：在看门人位点引入单核苷酸多态性的质粒构建 cdpk1 利用 CRISPR-Cas9 编辑基因位点。 一段对应于432至451 bp的20个核苷酸的引导序列被克隆至pL6eGFP质粒的BtgZI限制性酶切位点，以构建pL6CK1G。一段包含目标单核苷酸多态性（SNP）（T145M或T145S，绿色显示对应密码子）以及屏蔽突变（红色显示）的同源臂（421 bp）被克隆至pL6CK1G中AflII与SpeI限制性内切酶位点之间，用于构建pL6CK1G。T145M 和 pL6CK1GT145M，分别。屏蔽突变可防止在完成所需编辑后对已修饰位点进行再次切割。由第二个质粒pUF1编码的Cas9内切酶在来自pL6CK1G表达的向导RNA的协助下，靶向cdpk1位点内的目标位点。T145M/S 质粒。Cas9在PAM序列5'侧的靶位点引入双链断裂。该双链断裂通过pL6CK1G中的同源臂进行修复。T145M/S 质粒 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg" /> 
图5示意图 P. falciparum 使用CRISPR质粒转染以引入看门人突变（T145M） cdpk1 位点 i) 异步 P. falciparum 培养物经山梨醇处理以获得同步化的环状期疟原虫。ii) 将同步化的环状期疟原虫与pL6CK1G一同加入电穿孔比色皿中T145M/S 以及重悬于缓冲液中的pUF1质粒。iii) 将寄生虫在310伏电压下进行电穿孔。 950 &#181;F，以及无限电阻。iv) 转染后，将寄生虫转移至含有新鲜完全RPMI培养基（cRPMI）的T25培养瓶中，培养48小时。48小时后，将转染的寄生虫转移至添加药物WR99210和DSM267的cRPMI中，并在T75培养瓶中扩增。v) 第14天，制备玻片并用吉姆萨染色剂染色。vi) 随后在光学显微镜下观察血涂片，评估红细胞内寄生虫的存在情况。vii) 观察到寄生虫后，继续在含药物的条件下培养使其生长。随后对寄生虫进行处理，提取模板用于PCR扩增及DNA测序，以验证目标基因的预期修饰 cdpk1 位点。viii) 验证后，通过在96孔板中进行有限稀释法获得单克隆转基因寄生虫。ix) 来自阳性孔的单克隆转基因寄生虫被转移至T25培养瓶并使其生长。x) 通过PCR进一步验证单克隆转基因寄生虫，并通过DNA测序及色谱图分析确认看门人位点存在预期的SNP。该图改编自32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg" /> 
图6：通过实时PCR（RT-PCR）进行靶基因转录分析步骤的示意图。 i) 通过在同一周期内进行山梨醇处理，获得以成熟裂殖体阶段为主的P. falciparum培养物。ii) 将寄生虫轻轻铺在15 mL锥形管中70/40 Percoll/山梨醇梯度上，以富集成熟裂殖体阶段的寄生虫。iii) 将位于40%和70% Percoll/山梨醇界面处的黑色环状层转移至新的50 mL管中，进行处理后重悬于cRPMI中。将富集的裂殖体阶段寄生虫与预先在37 °C预孵育的新鲜红细胞共同孵育以实现侵袭。iv) 寄生虫继续培养4小时，随后用5%山梨醇处理，以获得高度同步化的0–4小时环状体阶段寄生虫。v) 在山梨醇处理后进一步培养额外44小时，以获得高度同步化的44–48小时裂殖体阶段寄生虫。vi) 使用皂苷处理同步化的寄生虫，使其从红细胞中释放，并储存于RNA提取试剂中。从重悬于RNA提取试剂中的寄生虫中分离总RNA。vii) 以分离的RNA为模板合成cDNA。viii) 使用cDNA模板和基因特异性引物建立实时PCR实验，在实时PCR系统上运行反应板。ix) 使用分析软件对转录表达数据进行分析。该图显示了CDPK1 T145M寄生虫相对于野生型（WT）中11种激酶的差异性转录表达水平。此图改编自32。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基因名称</td>
			<td colspan="4">引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ck1f1&#160;</td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ck1r3wt</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究中使用的引物列表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基因名称</td>
			<td colspan="2">正向引物</td>
			<td colspan="2">反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG 
			ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT 
			GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA 
			TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKA (PF3D7_0934800)&#160;&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA 
			AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKG (PF3D7_1436600)&#160;&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB (PF3D7_1246900)&#160;&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3K (PF3D7_0515300)&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT 
			ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：靶基因列表（PlasmoDB 编号）及用于实时 PCR 分析的引物序列。

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。

疟原虫通过重连其转录组来削弱药物作用的机制之一。这种效应更为……

耐药性是抗击疟疾面临的主要挑战。本研究旨在鉴定含有必需蛋白激酶功能低下等位基因的疟原虫中的补偿通路。同时靶向两种激酶可能是更优的策略，可避免针对单个激酶产生耐药性。利用CRISPR-Cas9进行基因编辑极大地推动了疟疾研究，在等位基因交换、内源性标记、条件性基因敲除以及靶基因敲低等方面发挥了关键作用。现在，药物抗性的分子机制、靶基因功能的研究以及宿主与寄生虫相互作用的探讨都变得更加便捷。目前的实验挑战之一是在大肠杆菌（E.coli）中进行异源蛋白表达，这主要由于疟原虫基因组富含AT碱基。此外，CRISPR-Cas9 的脱靶效应使数据解读变得复杂，并导致错误的结果。疟原虫的转录效率较低，延长了获得所需遗传修饰所需的时间。我们的研究结果表明，靶向疟原虫中的单个激酶可能会引起其他激酶的代偿性过表达。这引发了关于适应性耐药潜力的新问题，以及双重激酶抑制是否能有效阻止此类适应，从而为联合治疗策略开辟了新途径。未来，我们的实验室将利用化学生物学方法靶向疟原虫的其他必需蛋白激酶。突变寄生虫中的转录重编程将有助于鉴定可被同时靶向的补偿通路，以防止针对单个激酶的药物耐药性产生。

understanding-development-compensatory-pathways-mutant-malaria

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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构建抗疟疾与登革热的改良蚊子：鉴定冈比亚按蚊与埃及伊蚊中赋予抗性的基因

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体内 建模：利用Danio rerio模拟人类疾病基因组

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本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

我们描述了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在Plasmodium...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

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利用一套实用且可行的方法表征RAF家族激酶的疾病相关突变体

本文介绍了一种利用Leishmania major前鞭毛体来检测成孔毒素所诱导的结合、细胞毒性和信号转导的实验方案。文中以链球菌溶血素O作为概念验证示例，也可使用其他毒素，结合L.

利用Leishmania major解析孔形成毒素的分子机制与功能

了解携带植物样激酶亚型等位基因的疟疾寄生虫中补偿途径的发展机制。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，探索双重激酶抑制策略以规避抗药性问题。

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

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