Name: 整合基质刚度与流体流动的体外模型用于研究内皮细胞反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解整合基质刚度与流体流动的体外模型，用于研究内皮细胞在机械刺激下的反应。该模型结合GelMA水凝胶与流室装置，可模拟血管生理环境，助力动脉粥样硬化等血管疾病机制研究。

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作者感谢 Robert Egan 在流室制造过程中提供的帮助。作者感谢 Lucas McCauley 在实验过程中给予的协助。此外，作者谨向东北大学活体系统化学成像研究所（CILS）核心设施表示感谢，感谢其提供共聚焦显微镜的使用权限。作者感谢美国国立卫生研究院（NIH 1R01EB027705，授予 SB）和美国国家科学基金会（NSF 职业奖：DMR 1847843 授予 SB，CMMI 1846962 授予 EE）提供的经费支持。

1. GelMA 的合成
<ol>
	<li>配制 0.2 M 的无水碳酸钠溶液和 0.2 M 的碳酸氢钠溶液。</li>
	<li>将 46 mL 碳酸氢钠溶液与 15 mL 碳酸钠溶液混合，并加入 139 mL 去离子水（DI 水）。必要时使用 0.1 M NaOH 和 HCl 将 pH 调节至 9.5。</li>
	<li>将 10 g 猪皮来源的 A 型、300 Bloom 明胶加入 100 mL 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，使其浓度为 10%（w/v）。</li>
	<li>将溶液置于 55 °C 水浴中，并使用磁力搅拌器以 700 rpm 搅拌，使明胶完全溶解。溶解后，使用 0.1 M NaOH 将明胶溶液的 pH 调节至 9.5。</li>
	<li>为启动甲基丙烯酰化反应，将 938 µL 甲基丙烯酸酐（MAH）逐滴加入溶液中。通过在不同位置（包括不同深度和距中心不同径向距离处）注入 MAH，以改善其在明胶溶液中的初始分布。</li>
	<li>用铝箔包裹反应容器，避免光照。保持反应温度为 55 °C，并以 500 rpm 搅拌 1 小时以完成反应（图 1A）12。 
	注意：当 pH 低于 7.4 时，反应将停止。</li>
	<li>准备一个装有 1.8 L 丙酮的 2 L 烧杯和一个装有 0.3 L 丙酮的 0.6 L 烧杯。</li>
	<li>在 200 rpm 搅拌下，将所得 GelMA 溶液逐滴加入 2 L 烧杯中，以诱导沉淀13。为最大限度收集沉淀产物，可放置不锈钢棒或刮刀作为成核位点，便于转移。</li>
	<li>将产物从大烧杯转移至小烧杯，静置 10 分钟后进入干燥步骤。沉淀的 GelMA 应呈现为白色纤维状。</li>
	<li>用吸水纸收集产物，在室温（RT）下真空干燥箱中干燥，并于 -20 °C 保存以备后续使用。 
	注意：有关通过质子核磁共振（1H NMR）对产物进行化学表征的更多细节，可参见先前发表的研究8。</li>
</ol>
2. 玻璃器皿硅烷化
注意：将水凝胶固定在玻璃载片上可提供一个平整均匀的表面，便于操作，并确保在流体剪切力作用下的稳定性。通过3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯对玻璃表面进行功能化处理，对于改善表面特性并在聚合过程中实现水凝胶的共价结合至关重要。
<ol>
	<li>使用玻璃切割器将普通显微镜载玻片（1 mm 厚度）精确切割成与最终水凝胶尺寸相近的片状。用肥皂清洗切割后的载玻片，以去除可能阻碍玻璃表面处理的表面污染物和碎屑。 
	注意：如有必要，可将玻璃载玻片在乙醇中超声处理 5 分钟，然后空气干燥。</li>
	<li>在无水乙醇中配制 0.5% 的 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯溶液。在去离子水中配制 10% 的冰醋酸溶液。混合上述溶液，使冰醋酸的终浓度为 3%。 
	注意：冰醋酸溶液可大量配制并储存。</li>
	<li>将玻璃载玻片有序放置于玻璃容器中，确保玻璃表面不被遮挡。将所得溶液倒入容器中，覆盖载玻片，并在 80 rpm 的摇床上反应约 5 分钟，以完成表面修饰。通过去除夹带的气泡，确保载玻片两面均被充分修饰。</li>
	<li>反应完成后，吸除溶液，并用乙醇洗涤载玻片两次。将载玻片空气干燥后，避光保存于室温。 
	注意：在此条件下，玻璃载玻片的表面修饰可稳定保持 1 个月。</li>
</ol>
3. 水凝胶制备
<ol>
	<li>使用氧化还原引发的自由基聚合方法制备水凝胶。
	<ol>
		<li>组装具有适当深度和10 mm2开口窗口的两片式聚四氟乙烯（PTFE）模具，以形成最终基底。在设计过程中需考虑水凝胶聚合后高度会收缩25%。确保模具平整，并在底板和顶板处紧密固定，以防止泄漏。 
		注：所设计的模具尺寸有意比目标水凝胶尺寸大10%。此设计具有多重目的：可防止脱模时损伤水凝胶侧壁，通过将杂质或气泡推向边缘来提高水凝胶表面的平整度，并补偿由于脱水收缩效应（syneresis effect）导致的预期25%收缩量——即高度交联的水凝胶在平衡后排斥水分而发生收缩。收缩程度在实验方案中有具体说明8。</li>
		<li>为确保水凝胶表面平整且高度一致，将经过修饰的载玻片悬置于模具顶板下方，留出狭窄的开口用于注入聚合物溶液。使用盖玻片来悬挂修饰后的载玻片（图1B）。</li>
		<li>制备盖玻片时，将普通显微镜载玻片切割成比模具大20%的尺寸。在较短的两侧各粘附一个垫片。垫片厚度按以下公式计算： 
		垫片厚度 = 1.33 × 最终凝胶厚度 + 1（修饰载玻片厚度）－模具深度</li>
		<li>在盖玻片较长的两侧涂上一层薄薄的细胞相容性密封脂，涂抹面应与垫片所在面相同。</li>
		<li>将修饰后的载玻片固定在盖玻片的两个垫片之间。</li>
		<li>将盖玻片放置于模具上，使垫片落在模具边缘，而修饰载玻片伸入模具内部。该结构可在修饰载玻片与模具底部之间形成一个等于最终水凝胶高度1.33倍的间隙。</li>
		<li>将GelMA分别溶于去离子水中，配制成4%（w/v）和10%（w/v）的溶液，用于制备5 kPa和10 kPa的水凝胶，并将其置于45 °C水浴中。 
		注：GelMA是一种热敏性聚合物，将溶液温度维持在45 °C可防止其在聚合前固化，并降低溶液黏度，这对制备平整的水凝胶至关重要。</li>
		<li>向聚合物溶液中加入TEMED（5 kPa水凝胶为24 mM，10 kPa水凝胶为6.25 mM），并充分混匀。 
		注：仅TEMED不能引发聚合反应，因此请确保在添加前已准备好模具、移液器和所有溶液。</li>
		<li>向GelMA溶液中加入APS（5 kPa水凝胶为24 mM，10 kPa水凝胶为24.5 mM），并充分混匀。 
		注：加入APS即启动聚合反应，水凝胶可能迅速形成，需迅速操作以避免产生缺陷水凝胶。有关刚度测量的更多细节可参见先前发表的研究8。</li>
		<li>在室温下，小心地将所得溶液通过移液方式注入悬空载玻片与模具之间的开口处，使其发生交联。毛细作用力会驱动聚合物溶液进入模具。避免在凝胶中引入气泡，并在移液枪尖端残留少量溶液时停止移液。 
		注：在聚合过程中，GelMA的甲基丙烯酰基团会与修饰载玻片上的甲基丙烯酸残基发生反应，从而使水凝胶化学键合至玻璃表面。</li>
		<li>反应15分钟后完成。使用针等尖锐物体将基底从模具中剥离，并将基底从盖玻片下轻轻滑出以完成分离。</li>
		<li>将水凝胶转移至含1×磷酸盐缓冲液（PBS）的100 mm培养皿中，用塑料封膜密封，在37 °C下平衡以去除残留的反应物和副产物。</li>
		<li>由于水凝胶略大于最终尺寸，需修剪边缘多余部分，使其符合流动室窗口所需的尺寸。</li>
		<li>使用流动室验证水凝胶尺寸。确保水凝胶能紧密贴合流动室内腔，无间隙或可能影响流场的缺陷。若存在可能影响流动模式的形状不规则情况，进而导致细胞行为异常，则应将该水凝胶保留用于静态实验条件。</li>
		<li>将四个水凝胶转移至含有1× PBS的培养皿中，准备进行灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤使用70%乙醇对水凝胶进行灭菌。
	<ol>
		<li>配制25%、50%和70%的酒精溶液，用于逐步脱水处理水凝胶。 
		注：若不进行梯度脱水，较硬的水凝胶可能发生收缩和破裂，而较软的水凝胶表面则可能出现皱褶。</li>
		<li>吸除含有水凝胶的培养皿中的1× PBS溶液。向每个培养皿中加入25%乙醇溶液，完全浸没5 kPa和10 kPa的水凝胶，处理15分钟。</li>
		<li>吸除25%酒精溶液。向每个培养皿中加入50%酒精溶液，完全浸没5 kPa和10 kPa的水凝胶，处理15分钟。</li>
		<li>吸除50%酒精溶液。向每个培养皿中加入70%酒精溶液，完全浸没5 kPa和10 kPa的水凝胶，处理5分钟。将培养皿置于摇床上，以100 rpm振荡。</li>
		<li>让5 kPa水凝胶继续浸泡40分钟，10 kPa水凝胶浸泡20分钟。 
		注：观察发现，5 kPa水凝胶比10 kPa水凝胶更容易受到污染。</li>
		<li>在生物安全柜中将样品转移至6孔板，并用无菌PBS清洗水凝胶2–3次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 包被水凝胶
<ol>
	<li>通过将 3 mg 明胶溶解于 50 mL 无菌 PBS（含镁和钙盐的 1x 溶液）中，配制 60 µg/mL 的明胶溶液。将溶液置于 37 °C 水浴中加热 30 分钟，或直至明胶完全溶解。</li>
	<li>使用 0.2 µm 注射器滤器对包被溶液进行无菌过滤。吸除每孔中的 1x PBS 溶液，并向各孔加入明胶溶液，确保完全覆盖每个水凝胶。为降低污染风险，向包被溶液中添加 40 单位/mL 青霉素和 10 µg/mL 链霉素。</li>
	<li>将每块孔板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 45 分钟。用 1x PBS 溶液洗涤水凝胶。</li>
	<li>吸除 PBS，并加入细胞培养基。</li>
	<li>将水凝胶置于细胞培养基中，于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育，时间不超过两天，直至进行细胞接种。 
	注意：尽管纤连蛋白具有优良的细胞黏附性能，但由于内皮细胞（ECs）在动脉粥样硬化条件下会沉积内源性纤连蛋白，可能引发促炎反应，因此对其使用存在担忧。为避免化学刺激引起的细胞反应，我们不使用纤连蛋白。此外，Orr 等人证明，与 I 型胶原包被相比，纤连蛋白包被会上调致动脉粥样硬化基因的表达。具体而言，他们观察到细胞间黏附分子 1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子 1（VCAM-1）以及核因子-κB（NF-κB）的表达水平升高14。</li>
</ol>
5. 在基底上接种细胞
<ol>
	<li>按照现有的细胞脱离方案制备细胞悬液，并使用血细胞计数板对细胞进行计数8。</li>
	<li>彻底吸除水凝胶中的培养基。向每个样品中加入 50,000 个细胞/cm²。向每个样品中加入适当体积的细胞悬液，以防止细胞溢出。 
	注意：较硬的基底更具疏水性；因此，应尽量缩短各步骤之间的时间，以提高基底表面的润湿性和细胞悬液的分散性。</li>
	<li>将接种细胞的水凝胶置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 2 小时。待细胞贴附于凝胶后，向样品中加入细胞培养基。</li>
</ol>
6. 流动腔室的制备
注意：设计流室的方法成本低廉，且在制造和使用过程中所需的专门技术极少。
<ol>
	<li>使用聚甲基丙烯酸甲酯（poly(methyl methacrylate)）制作腔室，以便直观评估流动质量、水凝胶在剪切应力下的完整性，以及在流动实验期间进行潜在的实时生物标志物研究。腔室设计采用计算机辅助设计（CAD）软件完成。该流动腔室已申请专利，因此本实验方案中无法披露该装置的具体细节。</li>
	<li>流动腔内流动条件的计算评估
	<ol>
		<li>将设计好的流动腔室的各个部件（.SLDPRT 文件）组装起来，形成最终的腔室结构。</li>
		<li>沿流动方向在水凝胶表面切线的中心线上绘制一条线，用于分析剪切应力。封闭入口和出口开口，以定义一个封闭的控制体积。</li>
		<li>在 CAD 软件的“加载项”选项卡中打开 Flow Simulation。在 Flow Simulation 选项卡中，启动向导功能以输入参数。设定单位系统，并将压力和应力单位调整为 dyne/cm2。</li>
		<li>在“物理特征”中勾选流体流动和重力。将重力设置为 Z 方向 -9.8；X 和 Y 方向应为零。</li>
		<li>在“几何处理”中选择内部作为分析类型。选择水作为默认流体。 
		注：假设培养基的行为特性与水相似。</li>
		<li>流动类型选择层流和湍流。将壁面定义为绝热壁，并在“壁面条件”中输入表面粗糙度。</li>
		<li>在“初始条件”中将温度设置为 37.5 °C（310.65 K）。在 Flow Simulation 项目中定义计算域，确保其覆盖整个控制体积。</li>
		<li>选择所有与流体接触的壁面以定义流体子域。在“边界条件”中，将入口盖内表面指定为“入口体积流量”，并设定流量（Q）和均匀流动。然后，将出口盖密封内表面设为静压。</li>
		<li>根据可用的计算资源确定全局网格尺寸。点击运行以启动仿真。</li>
		<li>仿真完成后，查看所需结果，包括剪切应力图和流动模拟结果。</li>
		<li>以不同流速重复步骤 6.2.8 至 6.2.10，以计算不同流速下施加的剪切应力。通过回归分析建立流速与剪切应力之间的关系。</li>
		<li>评估系统对水凝胶尺寸变化的容差，以增强仿真的真实性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 运行均匀层流
<ol>
	<li>在 5 kPa 和 10 kPa 的水凝胶上培养细胞后，将细胞单层置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中，确保细胞达到汇合状态。每种水凝胶上均应形成完整的细胞单层。</li>
	<li>使用 30 分钟重力式高压灭菌循环对平行板流动腔系统中的可高压组件（不锈钢螺丝、刮刀、镊子、垫圈和培养基储液罐）进行灭菌。其余部件（丙烯酸组件和储液罐密封件/阻尼器）通过紫外光照射进行灭菌。</li>
	<li>在生物安全柜内组装流动腔装置。将水凝胶样品牢固地固定在装置中，并确保其位置均匀。若用于流动实验的样品数量不足，可使用与水凝胶尺寸相同的填充物替代。</li>
	<li>预先润湿腔室内表面及水凝胶表面，以减少气泡形成，并防止组装过程中细胞干燥。</li>
	<li>向进样储液罐中加入足量培养基，使组装后约有 20%–30% 的培养基流入出样储液罐。使用阻尼器/密封件将进样储液罐密封，确保气密性。 
	注意：进样储液罐内的压力积聚可驱动液体流动，任何漏气均会改变流速。若外侧管路中出现气泡，请检查密封件是否存在缺陷。</li>
	<li>将出样端阻尼器调节至大气压，以建立压力差。将装置及储液罐置于 37 °C、5% CO2 培养箱中。将装置管路连接至培养箱外的蠕动泵（图 1C）。</li>
	<li>启动泵，开始施加 3.6 dyne/cm2 的剪切应力。以每次 2 mL/min 的增量逐步提高流速（例如，10 分钟内从 65 mL/min 增至 85 mL/min），直至施加约 8 dyne/cm2 的剪切应力。</li>
	<li>继续以每次 2.5 mL/min 的增量提高流速，直至达到 12 dyne/cm2 的剪切应力。 
	注意：应给予细胞足够时间以适应动态环境，过快增加流速可能导致细胞脱落或单层结构受损。</li>
	<li>6 小时后，停止流动，将装置从培养箱中取出并拆卸流动腔。随后将水凝胶样品转移至六孔板中。</li>
	<li>用预冷的 PBS 清洗样品，随后可选择对细胞进行固定以用于免疫染色，或裂解样品以提取蛋白。</li>
</ol>
8. 高倍镜共聚焦显微镜免疫染色实验设置
注意：为了提高研究效率，已开发出一种对水凝胶小部分进行免疫染色的方法，可在单个样品中检测多个生物靶标。
<ol>
	<li>准备直径为 3 或 4 mm 的活检打孔器或首选切割工具。</li>
	<li>使用移液器吸头盒作为染色室。在移液器吸头盒底部放置一张湿润的纸巾，以保持室内湿度，防止长时间孵育过程中染色液蒸发。</li>
	<li>通过为单个样品创建小体积溶液池来减少抗体消耗。用透明封口膜覆盖吸头盒架，并用指尖轻轻按压膜面，使其在架孔处形成凹陷，每个凹陷中加入 70 µL PBS。</li>
	<li>将单个水凝胶转移至空的培养皿中，使用活检打孔器或首选切割工具进行切割。借助显微镜选择具有代表性的取样区域。应切割出完整的凝胶圆柱体，以避免共聚焦显微镜成像时出现问题。</li>
	<li>将切割后的水凝胶样品放入第 8.3 步中形成的凹陷内。按照标准染色流程15进行染色。在最后一次染色洗涤后，取一块厚度与水凝胶相匹配的硅胶橡胶片。 
	注意：建议使用单面带粘性的橡胶片，以提高密封效果。本研究中，使用与鬼笔环肽偶联的荧光二抗对肌动蛋白纤维进行染色，稀释比例为 1:20。</li>
	<li>将橡胶片切成 15 mm × 15 mm 的正方形，并用活检打孔器或首选切割工具打一个直径为 6 mm 的孔。</li>
	<li>将橡胶片粘附在显微镜盖玻片（1.5 号）上，构建样品容器。在样品仍处于凹陷中时，向其中加入 10 µL 湿封片介质，并在避光条件下孵育 10–15 分钟。 
	注意：本研究中，封片介质含有 0.9 µg/mL 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），以缩短染色流程。</li>
	<li>将样品从染色室中取出，并放入第 8.7 步制备的容器中。在样品上方滴加 1–2 µL 封片介质。 
	注意：封片介质的用量会影响高倍镜下的图像质量。过多或过少均可能导致图像清晰度下降。</li>
	<li>在样品上方再盖上一片盖玻片，并轻轻按压，确保样品与玻璃充分接触。将样品置于 4 °C 避光保存，直至进行显微成像。</li>
</ol>

Studying Tissue Rigidity and Shear Stress Effects on Endothelial Cells

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作者声明已提交一项临时专利申请（申请号：63/634,853），专利名称为“具有机械可调基底的流动室”，且不存在其他竞争性利益。

血管系统是一个动态的环境，其中多种力显著影响细胞行为。若在研究心血管疾病中的生物学事件时不考虑这些力的作用，则研究结果将不准确。因此，能够模拟血管力学环境的细胞模型至关重要。研究人员已在阐明这些力对细胞行为的影响方面取得了显著进展11。然而，为了理解人体内病理和生理条件下细胞的行为，必须开发出更精确、更接近血管环境的模型。因此，我们的目标是开发一种系统，既能更准确地模拟血管环境，又能保持操作便捷性和用户友好性。
该模型能够在具有不同刚度水平的基质上对人源细胞施加可控的流体剪切应力，所产生的条件相较于现有模型更接近生理现实。本模型中合成并使用了 GelMA，以满足以下标准：1）可调节的机械性能；2）不发生溶胀的特性；3）良好的细胞相容性与细胞黏附性；4）能够包埋血管细胞，从而更精确地模拟血管结构。通过调节生物聚合物浓度8来实现机械性能的可调性，以模拟生理和病理条件。第二个标准是不发生溶胀的特性。为保持流体腔室尺寸的一致性、相关的流动条件以及细胞所受剪切应力的稳定性，使用不溶胀的基质至关重要...

血管内壁内表面的内皮在维持血管健康方面发挥着关键作用。内皮细胞（ECs）是调控多种心血管功能的核心，包括血管张力控制、选择性通透性、止血以及机械信号转导1,2。研究表明，内皮细胞功能障碍与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。值得注意的是，内皮细胞在其与血流及下方血管组织相互作用的界面上会受到多种机械力的影响3,4。多项研究已将内皮细胞功能障碍与血管微环境中机械因素的异常变化联系起来，例如血流产生的流体剪切应力以及组织刚度的变化5,6,7。
然而，以往的研究在理解组织刚度和剪切应力对内皮细胞（EC）功能的联合影响方面关注有限。为了提高将研究成果转化为治疗动脉粥样硬化及其他心血管疾病有效疗法的能力，改进该领域所使用的细胞模型至关重要。通过使用人源内皮细胞，并将其暴露于剪切应力或不同刚度的基底材料上，研究人员在人源化细胞模型方面已取得显著进展8,9,10。然而，整合动态流动环境与具有可调刚度特性的内皮细胞基底材料的细胞模型，其应用和优化进展仍然缓慢。挑战在于设计出不发生溶胀的内皮细胞基底材料，以避免流动通道内流体参数的改变，同时支持完整且牢固贴壁的内皮细胞单层的培养。体外模型若能克服这些障碍，将有助于更有效地研究高血压、衰老和血流条件如何共同影响内皮细胞的机械转导、血管健康以及最终的动脉粥样硬化发生过程。目前已开发出多种在控制基底刚度的同时对细胞施加剪切应力的方法，包括旋转板法和微流控装置。在旋转板法中，细胞被置于两块板之间，通过板的旋转运动施加剪切应力。该方法结构较简单，建模速度快；但存在空间剪切应力分布不均的问题，中心区域剪切应力为零，而边缘区域达到最大值11。
另一方面，微流控装置代表了新一代的工具，能够控制基质刚度和流动条件。这些系统适用于在层流条件下模拟微血管环境。然而，使用此类装置研究动脉粥样硬化并不切实际，因为动脉粥样硬化发生在具有扰动流的大血管中11。本文旨在通过介绍一种经济高效的系统，为内皮细胞（EC）研究这一关键领域做出贡献，该系统能够在不同流动条件下检测EC基质在不同刚度水平下的影响。该系统集成了不同刚度的基质，以模拟病理性和生理性血管。本方案概述了制备无溶胀、刚度分别为5 kPa和10 kPa的明胶基水凝胶的方法，分别代表生理性和病理性刚度。此外，还详细描述了可整合这些基质的平行板流动腔室的构建过程。采用计算流体动力学（CFD）评估剪切应力和流动条件。文中描述了用于内皮细胞培养的水凝胶制备及6小时流动实验的实施步骤，随后讨论了实验后免疫染色的分析方法。

<table><tbody><tr><td>(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯，四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>水凝胶制备</td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>玻璃硅烷化</td></tr><tr><td>含4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>A18-4</td><td>GelMA合成</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555鬼笔环肽&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8953S</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>水凝胶制备</td></tr><tr><td>透明抗刮擦且抗紫外线的浇铸丙烯酸板（45/64英寸）</td><td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td><td>流动腔体制备</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 800</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Covidien Monoject 硬包装60 mL无针注射器</td><td>Fisher&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>22-031-375</td><td>流动实验</td></tr><tr><td>内皮细胞生长试剂盒&amp;nbsp;</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>PCS-100-041</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>200度乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>玻璃硅烷化</td></tr><tr><td>猪皮来源A型明胶（300 bloom值）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA合成</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>9526-33</td><td>玻璃硅烷化</td></tr><tr><td>高纯度耐高温硅橡胶片</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K74</td><td>流动腔体制备</td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>PSC-100-010</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>M3×30 mm 六角圆头机械螺钉，304不锈钢紧固件螺栓，20件装</td><td>Uxcell</td><td>B07Q5RM2TP</td><td>流动腔体制备</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 数字驱动器，配备Easy-Load&amp;reg; 3泵头用于精密泵管；115/230 VAC</td><td>VWR</td><td>#MFLX77921-65</td><td>流动实验&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密泵管，Puri-Flex，L/S 25；25英尺</td><td>VWR</td><td>#MFLX96419-25</td><td>流动实验&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酐（MAH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>GelMA合成</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td>通用</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>GelMA合成</td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>GelMA合成</td></tr><tr><td>SOLIDWORKS 教育版</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLIDWORKS 学生版桌面软件，2023版</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>流动腔体设计</td></tr><tr><td>血管基础培养基</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>PCS-100-030</td><td>细胞培养</td></tr></tbody></table>

整合基质刚度与流体流动的体外模型用于研究内皮细胞反应

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

我们提出了一种创新的体外模型，旨在研究组织刚度与剪切应力对内皮细胞（EC）功能的联合影响，这对于理解血管健康以及动脉粥样硬化等疾病的发生至关重要。传统研究通常独立地探讨剪切应力和基底硬度对EC的影响。然而，该集成系统将这两种因素结合，以更精确地模拟血管系统的力学环境。本研究的目标是利用人源内皮细胞，在不同组织硬度水平和流动条件下，考察EC的机械转导行为。我们详细描述了制备可调硬度的明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）水凝胶并接种EC以实现完全融合的实验方案。此外，我们还介绍了低成本流动腔的设计与组装方法，并结合计算流体动力学模拟，以产生具有层流特征和适当剪切应力水平的生理流动条件。该方案还包括荧光标记步骤，用于共聚焦显微镜观察，从而评估EC对组织顺应性和流动条件的响应。通过在培养的EC上施加多种整合的机械刺激，该模型可全面探究高血压、衰老等因素如何影响EC功能及EC介导的血管疾病。这些研究获得的见解将有助于阐明血管疾病的潜在机制，并为开发有效的治疗策略提供重要依据。

图1展示了实验装置，概述了通过甲基丙烯酰化反应合成 GelMA 的过程。所得产物随后用于制备水凝胶基底，并在该基底上接种内皮细胞（ECs）。接着，将细胞引入流动腔室，在 12 dyne/cm2 的条件下进行为期 6 小时的流动实验。
采用1H NMR 谱学方法评估甲基丙烯酰化反应的成功程度（图2A）。GelMA 中在 1.9 ppm 处出现甲基信号，以及在 5.4–5.6 ppm 范围内出现烯烃峰，证实甲基丙烯酰化反应成功。此外，GelMA 中赖氨酸残基在 3 ppm 处的峰强降低，表明赖氨酸残基被消耗，并被甲基丙烯酰基团取代12,13,16。通过压缩试验评估 GelMA 水凝胶的刚度，结果显示其压缩模...

我们合成并表征了一种可调节的明胶基底质，用于在接近生理血管流动条件下培养血管内皮细胞（ECs）。该仿生表面能够模拟生理和病理环境，从而研究机械力对内皮细胞行为的影响，并推动对血管健康与疾病机制的理解。

我们提出了一种创新的体外模型，旨在研究组织刚度和剪切应力对内皮细胞（EC）功能的联合影响，……

本研究聚焦于与动脉粥样硬化和高血压相关的力学生物学。我们旨在解决的主要问题有两个：第一，在生理和病理条件下，如何更准确地模拟血管微环境？第二，当内皮细胞同时暴露于这些机械刺激时，其细胞反应是什么？该研究旨在通过在一个系统中整合基质硬度和流动条件，以更准确地模拟血管环境。以往的体外模型要么在静态条件下研究基质硬度，要么在刚性基质上培养内皮细胞并研究流体剪切力的影响，这两种情况均不符合生理实际。首先，将10克来自猪皮的A型、300 bloom明胶加入100毫升碳酸氢盐缓冲液中。将明胶置于55摄氏度水浴中溶解，同时使用磁力搅拌器以700 RPM的速度搅拌溶液。待完全溶解后，用0.1摩尔氢氧化钠调节明胶溶液的pH至9.5。为启动甲基丙烯酰化反应，将938微升甲基丙烯酸酐逐滴加入溶液中。然后用铝箔包裹反应容器，以避免光照。在55°C条件下维持反应，并以500 RPM的速度搅拌溶液1小时，以完成反应。接下来，准备一个2升烧杯，加入1.8升丙酮，另准备一个0.6升烧杯，加入0.3升丙酮。将所得的 GelMA 溶液在 200 RPM 搅拌条件下逐滴加入 2 升烧杯中，以诱导沉淀。将沉淀产物从大烧杯转移至小烧杯中，静置 10 分钟。用吸水纸收集产物，然后在室温下置于真空烘箱中干燥。使用适当深度且带有10平方毫米开口窗的两件式聚四氟乙烯模具组装，以形成最终的基底。确保模具底部和顶部平板平整并紧密固定，以防止泄漏。然后在盖玻片较长的一侧、与垫片附着的同一面上，涂覆一层细胞相容性密封润滑脂。将修饰后的玻片固定在两个垫片之间的盖玻片上。随后将盖玻片放置于模具上，使垫片置于其上，修饰后的玻片伸入模具内。待 GelMA 溶解于去离子水中后，将溶液置于 45 摄氏度水浴中。依次将TEMED和APS加入聚合物溶液中，充分混匀。15分钟后，用尖锐物体将基底从模具上剥离，将其从盖玻片上滑离，转移至盛有PBS的100毫米培养皿中。随后用塑料封口膜密封培养皿，将水凝胶置于37摄氏度条件下平衡，以去除残留的反应物及副产物。由于水凝胶略大于最终尺寸，需修剪侧面多余的凝胶，使其与流室窗口所需尺寸一致。使用流室验证水凝胶的尺寸。将四个水凝胶转移至两个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，水凝胶将在其中进行灭菌处理。在适当时间吸除水凝胶中的培养基，每平方厘米接种50,000个细胞。将接种细胞的水凝胶置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育2小时。待细胞贴附于凝胶后，向样品中加入细胞培养基。在生物安全柜中组装流室装置。在 GelMA 水凝胶上培养内皮细胞后，将水凝胶样品固定在装置中，确保其均匀性。预先润湿腔室的内表面和水凝胶表面，以尽量减少气泡形成，并防止组装过程中细胞干燥。向入口储液槽中加入足够的培养基，组装后使20%至30%的培养基流入出口储液槽。使用塞子将入口储液槽密封至气密状态，并将出口储液槽保持在大气

in-vitro-model-integrating-substrate-stiffness-flow-to-study

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

整合基质刚度和流动性的体外模型以研究内皮细胞反应

我们正在描述一种在无菌连续流动回路中对贴壁细胞施加层流剪切应力的方法。通过透明的腔室可观察细胞的黏附和形态，从回路中获取样品用于代谢物分析，并在剪切作用后收集细胞以用于后续实验或培养。...

平行板流动腔室与连续流动回路用于评估内皮祖细胞在层流剪切应力下的反应

本文介绍一种快速、简单的细胞刚度测量方法。该方法的基本原理是通过微管对细胞表面施加明确定义的负压，测量细胞膜在负压作用下的形变。该方法为研究贴壁细胞的生物力学特性提供了一种强有力的工具。...

利用微吸管对贴壁细胞进行吸吮以评估细胞刚性

黑腹果蝇 幼虫因其半透明的角质层和强大的遗传学工具，成为活体成像的理想模型系统。本方案描述了如何利用一种单层聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，即“幼虫芯片”，对3龄幼虫神经元中的细胞过程进行活体成像rd 龄期 果蝇...

使用微流控芯片进行活体成像及损伤反应研究 果蝇 幼虫

本方案综述了电细胞基底阻抗传感技术，该方法用于记录和分析贴壁细胞的阻抗谱，以定量检测细胞黏附、增殖、运动性以及细胞对药理和毒性刺激的反应。重点强调内皮细胞通透性的检测以及细胞间和细胞-基底相互作用的评估。...

用于定量分析内皮细胞增殖、屏障功能及迁移活性的细胞电阻传感技术

本文介绍了一种可在多孔板中快速、高效且低成本制备聚丙烯酰胺凝胶的方法。该方法无需任何专用设备，任何研究实验室均可轻松采用。该方法在致力于研究刚度依赖性细胞反应的研究中尤为有用。...

基于聚丙烯酰胺的简易多孔硬度检测法用于研究细胞对基质硬度的依赖性反应

我们开发了一种眼刺激性测试方法，该方法采用三维重建的人角膜样上皮（RhCE）组织模型。该测试能够区分具有眼刺激性或腐蚀性的物质（GHS 第1类和第2类合并）与无需标注分类的物质（GHS...

使用重建人角膜样上皮（RhCE）组织模型进行化学品眼刺激性危害识别的刺激性眼试验（EIT）

该方案可模拟生理或病理条件下的血流 体外...

体外 生理与病理血流模型及其在血管细胞重塑研究中的应用

采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。...

使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

椎间盘（IVD）全器官培养可保留天然的细胞外基质、细胞表型以及细胞与基质间的相互作用。本文介绍了一种利用小鼠腰椎和尾椎IVD在其功能性脊柱单元中的培养体系，并展示了该体系的多种应用。...

一个 体外 小鼠椎间盘器官培养模型

本文介绍了一种在流体剪切应力条件下培养内皮细胞并进行基因表达分析的工作流程。该流程包括一种物理装置，可在受控环境中同时容纳和监测多个流动腔室，并采用外源性参照RNA进行定量PCR分析。...

使用多个平行板流动腔对暴露于剪切应力下的内皮细胞进行基因表达分析

了解整合基质刚度与流体流动的体外模型，用于研究内皮细胞在机械刺激下的反应。该模型结合GelMA水凝胶与流室装置，可模拟血管生理环境，助力动脉粥样硬化等血管疾病机制研究。

整合基质刚度与流体流动的体外模型用于研究内皮细胞反应

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