确定假复层肺气道上皮的睫状功能和膜不可渗透性

我们的研究旨在测量假复层气道上皮的两个关键生物物理特性，这可以通过在气液界面中分化正常人支气管上皮细胞来获得。我们使用假复层气道上皮鉴定了不同呼吸道病毒的不同特征。例如，呼吸道合胞病毒驱动的细胞骨架炎症，这是毛细支气管炎的非典型机制。

我们还发现杯状细胞增生增加了慢性阻塞性肺病气道上皮中的 SARS-CoV-2 复制。我们专注于阐明呼吸道合胞病毒驱动对细胞骨架信号传导的调节机制，以确定对抗 RSV 感染和病毒诱导的毛细支气管炎的新治疗靶点。首先，服用正常人支气管上皮细胞 （NHBE） 细胞悬液。

使用 P200 移液器，将 50， 000 个重悬细胞添加到 200 μL 完全气道上皮细胞或 AEC 培养基中，添加到插入片段的顶端侧。将细胞在 37 摄氏度下在 85% 至 95% 加湿的二氧化碳细胞培养箱中孵育。细胞汇合后，使用无菌镊子将插入物转移到空孔中。

使用 P1000 移液器吸出所有基础 AEC 培养基。然后，向基孔中加入 500 微升新鲜的完全 ALI 分化培养基，其中补充有 2% 青霉素-链霉素和 1% 两性霉素 B。使用无菌镊子，将插入物转移到添加的完全 ALI 培养基的基底孔中。

用 P200 移液器轻轻地从孔中吸出顶端 AEC 培养基并孵育。48 小时后，用无菌镊子将插入物转移到空孔中。使用 P1000 移液器吸出旧培养基并加入 500 微升新鲜的完全 ALI 培养基。

使用无菌镊子将插入物放回装有新鲜培养基的孔中。第 26 天，使用 P200 移液器，将 100 微升 DPBS 添加到插入物的顶端侧。在 37 摄氏度下在加湿细胞培养箱中孵育 30 分钟。

然后，使用 P200 移液器吸出 DPBS。首先，打开显微镜、连接的计算机和环境室。打开腔室门，将包含带有 NBHE 细胞的插入物的板放在显微镜载物台上。

一旦板放在载物台上，关闭腔室。然后，使用显微镜载物台作旋钮移动板并将插入物置于视野中。在计算机屏幕上，单击 SAVA 系统图标以打开 SAVA 程序。

在软件界面上，单击 Configure Experiment。在下一个选项卡中，单击 Create Experiment （创建实验）。然后，在新选项卡中，在 Enter Experiment Directory Name 字段中输入数据存储的目录，并在 Enter Experiment Description 字段中提供详细信息，然后单击 OK。现在，单击已创建的实验，该实验显示在 Experiments 部分下的目录中。

然后，单击 Modify 并在 Sample Description 字段中提供示例详细信息。单击 Add，然后单击 Exit 退出选项卡。在软件主界面上，从 Experiment 插槽的下拉菜单中选择创建的实验。

然后，点击 录制视频 在计算机屏幕上监控纤毛跳动频率。屏幕将显示集中的纤毛运动。对于每个插入，以每秒 120 帧的速度录制 6 个不同的随机字段，持续 2.1 秒。

点击 Save Video 监控纤毛搏动频率数据。要分析数据，请单击软件界面上的分析视频。在下一个选项卡中，单击 OK.然后转到以下选项卡并单击 Analyze All。

在计算机的 SAVA Data Acquisition 文件夹中下载为每个实验生成的电子表格。采用高斯平均频率进行数据表示。健康成人和 COPD 患者的气道上皮的睫状跳动频率至少达到 3 赫兹，显示出相似的睫状功能。

首先，使用电源开关打开 EVOM2 伏特欧姆表。将测试电阻连接到输入槽处的 EVOM2。监控 EVOM2 屏幕上的读数。

如果读数高于或低于 1， 000，请使用镊子打开 EVOM2 上的 ADJ 开关，直到显示统一的 1， 000 读数以校准设备。现在，取一个空插入片段作为实验对照读数。使用 P200 移液器，将 100 微升 DPBS 添加到空插入物的顶端侧。

然后，用 P1000 移液器将 500 微升 DPBS 添加到基底侧。然后，断开测试电阻并将 STX2 电极连接到 EVOM2 上的输入槽。然后，用 70% 乙醇轻轻清洁 STX2 电极。

用 DPBS 将 STX2 电极插入空插入物中，保持较短的电极腿在顶端部分，较长的电极腿在基底部分。现在，在 EVOM2 屏幕上记录稳定的读数。接下来，使用 P200 移液器，将 100 微升 DPBS 添加到插入物的顶端侧。

如前所述，将 STX2 电极插入具有 26 天分化气道上皮的插入物中。然后，在 EVOM2 屏幕上记录稳定的读数。成人 COPD 患者的跨上皮电阻值增加，表明 COPD 的膜不通透性增强。