Name: 确定假复层肺气道上皮的睫状功能和膜不可渗透性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 了解如何使用气液界面培养正常人支气管上皮细胞，建立假复层肺气道上皮模型，并通过纤毛摆动频率和跨上皮电阻评估其生物物理特性，为研究呼吸道病毒感染提供可靠方法。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究&#160;由NIH P20GM113123和UND SMHS试点项目资助。

该实验方案应在生物安全二级的超净工作台（生物安全柜）内无菌条件下进行。所有培养基和溶液在使用前应于37 °C解冻。离心操作应在4 °C进行。实验中使用的所有材料必须保持无菌。原代细胞（去标识供体）由内布拉斯加大学医学中心（UNMC），奥马哈，内布拉斯加州的Kristina Bailey博士合作提供。这些原代细胞来源于去标识的供体，不属于美国国立卫生研究院（NIH）定义的人类受试者范畴。细胞的获取遵循北达科他大学，大福克斯，北达科他州与内布拉斯加大学医学中心，奥马哈，内布拉斯加州之间签署并获批的材料转让协议（MTA）。本研究中使用的是第4代人正常支气管上皮（NHBE）细胞。尽管更高代次的NHBE细胞（最高至第8代）也被证明可分化为气道上皮，但我们常规使用第4代NHBE细胞，因为在第1至第4代细胞之间，全基因组转录谱无明显差异6,14。
1. 原代细胞培养
注意：原代细胞的操作需格外小心。整个实验流程应避免对原代细胞进行剧烈处理或过度移液。
<ol>
	<li>使用无菌刻度移液管向100 mm组织培养（TC）培养皿中加入5 mL胶原蛋白溶液，以预包被培养皿。将TC培养皿在室温（RT）下孵育20分钟。</li>
	<li>使用无菌刻度移液管，吸除TC培养皿中的胶原蛋白溶液，并替换为8 mL预解冻的完全气道上皮细胞（AEC）培养基，其中添加2%（v/v）青霉素-链霉素和1%（v/v）两性霉素B（表1）。</li>
	<li>在37 °C水浴中解冻一管原代正常人支气管上皮（NHBE）细胞（每管含5 × 105个细胞）。</li>
	<li>用5 mL无菌刻度移液管，将1 mL预解冻的完全AEC培养基逐滴加入细胞中，使NHBE细胞适应环境，并将全部细胞收集至无菌15 mL锥形管中。</li>
	<li>在4 °C下以212 × g离心5分钟，使细胞沉淀。轻柔地弃去管中上清液，并通过轻轻敲击管壁，用管内残留的少量培养基重悬细胞。 
	注意：应避免剧烈或过度敲击。</li>
	<li>使用5 mL无菌刻度移液管，缓慢向重悬的细胞中加入2 mL完全AEC培养基，并收集全部细胞。</li>
	<li>将细胞加入已预先加入8 mL完全AEC培养基的培养皿中。水平移动TC培养皿，使细胞在皿内均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、85%–95%湿度的CO2细胞培养箱中孵育。24小时后，在显微镜下以10倍或20倍物镜观察NHBE细胞在TC培养皿上的贴壁情况和生长状态。若细胞悬浮于培养基中，则表明为死细胞。</li>
	<li>48小时后，使用无菌刻度移液管吸除TC培养皿中的旧培养基。</li>
	<li>使用无菌刻度移液管，向细胞中缓慢加入10 mL预温的完全AEC培养基。将培养基缓慢加至培养皿的一个角落，避免直接倾倒于细胞上方。</li>
	<li>每48小时更换一次完全AEC培养基，直至细胞达到95%–100%汇合度。</li>
</ol>
2. 气液界面培养
<ol>
	<li>使用 P200 移液器，将 100 µL 胶原蛋白加入预先包被的 6.5 mm Transwell 小室（孔径 0.4 μm，聚酯膜）中&#160;膜（此后称为插入物）并在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>使用无菌刻度移液管，吸除汇合的NHBE细胞中的培养基。</li>
	<li>使用无菌血清移液管，向组织培养皿的一角加入 5 mL 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）。</li>
	<li>轻轻晃动培养板以洗涤细胞，然后使用无菌血清移液管吸除1x DPBS。在整个实验过程中，务必确保细胞始终不干燥。</li>
	<li>使用血清移液管向细胞中加入 5 mL TrypsinLE，在 37 °C 湿润的 CO₂ 培养箱中孵育2 细胞培养箱中孵育，直至所有细胞从培养板底部表面解离。</li>
	<li>使用无菌刻度移液管，收集所有细胞至一个15 mL锥形管中。再用无菌刻度移液管向培养皿中加入3 mL胰蛋白酶，收集残留的细胞。</li>
	<li>通过离心（212 x g）沉淀细胞 g 4 °C下孵育5分钟。弃去培养基，轻轻敲击离心管，利用管内残留的胰蛋白酶液滴重悬细胞。</li>
	<li>使用血清学移液管向重悬的细胞中加入 2 mL 完全 AEC 培养基。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
	<li>用完全AEC培养基稀释细胞，每个插入式培养小室加入5 x 104 200 µL 体积中的细胞</li>
	<li>使用无菌镊子将插入物转移至24孔培养板中的一个空孔内。</li>
	<li>使用 P1000 移液器，向培养板的基底室中加入 500 µL 完全 AEC 培养基。</li>
	<li>使用无菌镊子将插入物转移回已添加完全AEC培养基的基底孔中。</li>
	<li>使用P200移液器，加入5 x 104 将NHBE细胞重悬于200 µL完全AEC培养基中，并加入至插入式培养小室的顶端。于37 °C、85%–95%湿度的CO₂培养箱中孵育细胞2 细胞培养箱</li>
	<li>24小时后，在显微镜下观察细胞，检查其是否已在孔内形成融合单层。 
	注意：如果细胞未形成融合单层，需每隔48小时用新鲜的完全AEC培养基更换基础AEC培养基，直至细胞形成融合的单层。更换基础培养基时，使用无菌镊子将插入式培养小室转移至空孔中，用P1000移液器吸除旧培养基，加入新鲜培养基，然后将插入式培养小室放回含新鲜完全AEC培养基的孔中。</li>
	<li>待细胞长至融合后，用无菌镊子将插入式培养小室转移至不含培养基的空孔中。使用P1000移液器吸除所有基础AEC培养基。</li>
	<li>使用 P1000 移液器，向基底孔中加入 500 µL 新鲜的完全气液界面分化（ALI）培养基，培养基中添加 2%（v/v）青霉素-链霉素和 1%（v/v）两性霉素 B。&#160;</li>
	<li>使用无菌镊子将插入物转移至已加入完全ALI培养基的基底室。用P200移液器轻轻吸除顶端AEC培养基。 
	注意：不要向顶端加入完全的ALI培养基。从顶端小心吸出AEC培养基，避免细胞脱落。</li>
	<li>在37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育细胞2 细胞培养箱。48小时后，用无菌镊子将插入物转移至不含培养基的空孔中。</li>
	<li>使用 P1000 移液器吸除旧培养基，并加入 500 µL 新鲜的完全 ALI 培养基。</li>
	<li>使用无菌镊子将插入物放回含有新鲜培养基的孔中。每隔48小时更换一次完全的ALI培养基，直至第28天（四周）。</li>
	<li>第28天，使用P200移液器向插入物的顶侧加入100 µL的1x DPBS，并在37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育2 将细胞置于培养箱中孵育30分钟。使用P200移液器吸除1x DPBS。 
	注意：应加入DPBS&#160;倾倒&#160;在壁上&#160;而不是直接接触细胞。吸取DPBS时，应避免触碰上皮层以及剧烈吹打，因为任何对上皮层的损伤都可能破坏其上皮（类组织）完整性。</li>
	<li>从第2个nd 分化第1周，通过显微镜观察上皮表面是否存在因黏液产生的较深色层，以评估黏液分泌情况。过量黏液可通过DPBS洗涤去除。简而言之，在24孔板的Transwell插入膜顶侧加入200 µL 1× DPBS，将培养板置于37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育2 细胞培养箱中孵育30分钟。移除DPBS，将培养板置于37 °C、湿润的CO₂培养箱中继续培养。2 细胞培养箱</li>
</ol>
3. 纤毛搏动频率的测定
注意：如需在 37 °C 下测定脑血流量（CBF），显微镜必须配备环境培养室，能够提供 37 °C、5% CO2 及适宜湿度的环境。
<ol>
	<li>打开显微镜及其连接的计算机和环境培养箱。打开培养箱门，将含有小室的培养板放置在显微镜载物台上。</li>
	<li>将培养板放置于载物台后，关闭培养箱。使用显微镜载物台操作旋钮移动培养板，使小室进入视野。</li>
	<li>选择相差模式下的 20 倍物镜。通过显微镜目镜观察培养板，并使用调焦旋钮对细胞进行聚焦。</li>
	<li>在计算机屏幕上，点击 SAVA system 图标。SAVA 程序应已安装在连接显微镜的计算机上。</li>
	<li>在软件界面中，点击 Configure Experiment。在下一个选项卡中，点击 Create Experiment。</li>
	<li>将弹出一个新选项卡，请在“Enter Experiment Directory Name”中输入数据存储目录，在“Enter Experiment Description”中输入实验详细信息，然后点击 OK。</li>
	<li>点击在“Experiments”目录下已创建的 The Experiment。</li>
	<li>点击 Modify ，并在“Sample Description”中填写样品信息。点击 Add ，然后点击 Exit 退出该选项卡。</li>
	<li>在主软件界面的实验槽位中，从主界面的下拉菜单中选择已创建的实验。</li>
	<li>点击 Record Video ，并在计算机屏幕上监测纤毛摆动频率（CBF）。屏幕将显示清晰的纤毛运动图像。</li>
	<li>对每个小室，以每秒 120 帧的速度记录 6 个不同随机视野，每个视野 2.1 秒。点击 Save Video 以保存 CBF 数据。</li>
	<li>要分析数据，请在软件界面中点击 Analyse Video 。在下一个选项卡中，点击 OK。</li>
	<li>在接下来的选项卡中，点击 Analyse All。将每次实验生成的电子表格下载至计算机的 SAVA 数据采集文件夹中。</li>
	<li>采用高斯平均频率进行数据展示。</li>
</ol>
4. 跨上皮电阻的定量检测
注意：经上皮电阻（TEER）定量检测需要在气道上皮的顶侧存在液体。为建立本实验方案，可在已含有基础培养基（实验组）的插入式培养小室的气道上皮顶侧加入 100 µL 的 1× DPBS，或加入 500 µL 的 1× DPBS。
<ol>
	<li>使用电源开关打开EVOM2伏欧表。将测试电阻连接到EVOM2的INPUT插槽。</li>
	<li>监测EVOM2屏幕上的读数。如果读数高于或低于1000，则需要进行校准。使用镊子调节EVOM2伏欧表上的ADJ开关，直至显示稳定的1000读数。</li>
	<li>取一个空插入物以进行实验对照读数。使用P200移液器在空插入物的顶端侧加入100 µL的1x DPBS，同时使用P1000移液器在基底侧加入500 µL的1x DPBS。</li>
	<li>断开测试电阻，将STX2电极连接至EVOM2的INPUT插槽。用70%乙醇轻轻清洁STX2电极。</li>
	<li>将STX2电极插入含有1x DPBS的空插入物中，保持较短的电极腿位于每个插入物的顶端部分，较长的电极腿位于基底部分。</li>
	<li>记录EVOM2屏幕上的稳定读数，因为读数可能由于移动或其他未确定的原因而波动。</li>
	<li>将STX2电极插入含有28天分化上皮的插入物中，保持较短的电极腿位于每个插入物的顶端部分，较长的电极腿位于培养基中的基底部分。</li>
	<li>记录EVOM2屏幕上的稳定读数。进行多次独立测量以计算可靠的平均值。在计算时，从实验插入物的读数中减去背景（空插入物读数）。</li>
</ol>

Assessing Biophysical Properties of Differentiated Airway Epithelium 

<ol><li>GBDCRD Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+chronic+respiratory+diseases+and+risk+factors%2C+1990-2019%3A+an+update+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22E+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> E Clin Med. 59, 101936(2023).</li>
<li>Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+burden+of+non-influenza-related+viral+respiratory+tract+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The economic burden of non-influenza-related viral respiratory tract infection in the United States.</a> Arch Intern Med. 163 (4), 487-494 (2003).</li>
<li>LeMessurier, K. S., Tiwary, M., Morin, N. P., Samarasinghe, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+barrier+as+a+safeguard+and+regulator+of+defense+against+Influenza+A+virus+and+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Respiratory barrier as a safeguard and regulator of defense against Influenza A virus and Streptococcus pneumoniae.</a> Front Immunol. 11, 3(2020).</li>
<li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li>
<li>Calven, J., Ax, E., Radinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium-A+central+player+in+Asthma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium-A central player in Asthma pathogenesis.</a> Int J Mol Sci. 21 (23), 8907(2020).</li>
<li>Talukdar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSV-induced+expanded+ciliated+cells+contribute+to+bronchial+wall+thickening%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">RSV-induced expanded ciliated cells contribute to bronchial wall thickening.</a> Virus Res. 327, 199060(2023).</li>
<li>Osan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cell+hyperplasia+increases+SARS-CoV-2+infection+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Goblet cell hyperplasia increases SARS-CoV-2 infection in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Microbiol Spectr. 10 (4), e0045922(2022).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia and mucociliary clearance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (4), a028241(2017).</li>
<li>Rhee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+frequency+in+cultured+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat frequency in cultured human nasal epithelial cells.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 110 (11), 1011-1016 (2001).</li>
<li>Scopulovic, L., Francis, D., Pandzic, E., Francis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cilia+beat+frequency+using+high-speed+video+microscopy%3A+Assessing+frame+rate+requirements+when+imaging+different+ciliated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantifying cilia beat frequency using high-speed video microscopy: Assessing frame rate requirements when imaging different ciliated tissues.</a> Physiol Rep. 10 (11), e15349(2022).</li>
<li>Jing, J. C., Chen, J. J., Chou, L., Wong, B. J. F., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+detection+of+ciliary+beating+pattern+and+frequency+in+the+upper+airway+using+phase+resolved+Doppler+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualization and detection of ciliary beating pattern and frequency in the upper airway using phase resolved Doppler optical coherence tomography.</a> Sci Rep. 7 (1), 8522(2017).</li>
<li>Yuksel, H., Turkeli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+barrier+dysfunction+in+the+pathogenesis+and+prognosis+of+respiratory+tract+diseases+in+childhood+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial barrier dysfunction in the pathogenesis and prognosis of respiratory tract diseases in childhood and adulthood.</a> Tissue Barriers. 5 (4), e1367458(2017).</li>
<li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+%28NHBE%29+Cell+3D+Cultures+for+in+vitro+Lung+Model+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) Cell 3D Cultures for in vitro Lung Model Studies.</a> Sci Rep. 9 (1), 500(2019).</li>
<li>Osan, J. K., DeMontigny, B. A., Mehedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+protein+detection+in+PFA-fixed+paraffin-embedded+SARS-CoV-2-infected+COPD+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for protein detection in PFA-fixed paraffin-embedded SARS-CoV-2-infected COPD airway epithelium.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100663(2021).</li>
<li>Talukdar, S. N., McGregor, B., Osan, J. K., Hur, J., Mehedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+Does+Not+Induce+Epithelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Respiratory Syncytial Virus Infection Does Not Induce Epithelial-Mesenchymal Transition.</a> J Virol. 97 (7), e0039423(2023).</li>
<li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Front Pediatr. 2, 111(2014).</li>
<li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ciliaFA%3A+a+research+tool+for+automated%2C+high-throughput+measurement+of+ciliary+beat+frequency+using+freely+available+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software.</a> Cilia. 1, 14(2012).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

人原代气道上皮（ALI 培养）作为一种体外肺模型，正越来越多地用于生物学评估，以研究其功能与机制，并减少动物实验的使用14。相较于任何单层浸没式培养，ALI 具有多种优势。例如，它可形成类似组织的假复层气道上皮，模拟肺气道的顶面结构6,7,14。然而，为了提高实验的可靠性和可重复性，应评估分化后假复层气道上皮的质量与完整性。两项关键的生物物理指标——纤毛功能和膜不透性，可提供高度分化气道上皮顶面质量的重要信息。尽管这些特性可在原代上皮&#160;细胞在 ALI 条件下分化的早期阶段进行评估，但在感染性疾病研究中，通常采用 3 至 4 周的分化时间以稳定生成假复层气道上皮6,15,16。不同供体来源的细胞在生长和分化为气道...

哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和囊性纤维化等慢性呼吸系统疾病是全球主要的健康问题之一1。由甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等病毒引起的呼吸系统疾病的流行也带来了沉重的经济和公共卫生负担2。因此，迫切需要开发针对导致不可逆呼吸组织损伤的呼吸道疾病的治疗方案。呼吸上皮组织不仅参与氧气摄取，还作为屏障保护机体免受病原体和有害化学物质的侵袭3。呼吸上皮具有复杂的细胞结构，主要由三种细胞类型组成：纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞。最近有研究报道了气道上皮中存在一种新型但稀有的离子细胞4。这些结构复杂的组织通过协调作用，发挥先天免疫功能，例如分泌抗菌肽、释放细胞因子以激活适应性免疫应答，以及进行黏液纤毛清除5。缺乏合适的气道模型是研究呼吸道感染及开发治疗方法的主要障碍之一。
气液界面（ALI）模型正成为呼吸系统疾病研究的关键工具6有效的 体外 肺气道模型中，主要的肺气道细胞分化为假复层气道上皮，该上皮至少由三种通常位于气道顶端侧的细胞组成。第一，纤毛细胞覆盖气道顶端侧的大部分区域，参与黏液纤毛清除。第二，杯状细胞产生黏液，是与纤毛细胞共同位于气道顶端侧的最大细胞。第三，基底细胞位于气道的基底层，是可分化为不同类型上皮细胞的前体细胞5,7尽管离子细胞和簇细胞在气道上皮中较为罕见，但它们也可能在纤毛功能和膜通透性方面发挥作用。4该技术不同于传统的浸没式细胞培养，后者无法模拟 体内 肺部环境。由于气液界面（ALI）模型来源于健康人、哮喘患者和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的原代上皮细胞，因此为研究感染反应和疾病病理生理学提供了更为多样的研究平台。
对气液界面（ALI）培养体系的健康评估是监测培养细胞活力、功能性和生理相关性的关键环节，有助于增强对ALI培养模型完整性、可靠性和可重复性的信心。如先前发表的研究所述，我们课题组通过评估两个生物物理参数来评价ALI培养的完整性：一是通过量化纤毛搏动频率（CBF）来评估纤毛功能，二是通过测定跨上皮电阻（TEER）来评估上皮屏障的完整性6,7,8。黏液纤毛清除（MCC）是气道上皮的重要功能之一，由纤毛细胞介导。纤毛细胞表面存在一种称为纤毛的特化细胞器，其以异时性波动的方式协调摆动，从而清除附着于气道上皮黏液层中的病原体和吸入颗粒物。有效的MCC完全依赖于正常的纤毛活动9。良好的CBF是健康且结构完整气道上皮的标志，因此对ALI培养模型的CBF进行监测可为上皮完整性提供重要信息10。尽管已有多种量化CBF的方法，例如高速视频显微技术11和相位分辨多普勒光学相干断层扫描技术12，但这些方法均需要专业技术知识和专用设备。在本实验方案中，我们提供了一种更为简便且技术门槛较低的方法，用于量化分化后气道上皮的CBF。同时，我们也描述了对同一上皮组织TEER值的测定方法，该参数可反映上皮组织的完整性和屏障功能13。

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>气道上皮细胞生长培养基</td><td>PromoCell, Germany</td><td>C-21060</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2伏特欧姆计</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>肝素溶液</td><td>STEMCELL technologies, USA</td><td>07980</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松储备液</td><td>STEMCELL technologies, USA</td><td>07926</td><td></td></tr><tr><td>显微镜：Leica DMI8（Leica Microscope），配备与显微镜相连的120帧/秒高速相机（Basler），显微镜还固定有i8型载物台培养箱。</td><td>Leica, USA</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Corning, USA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI基础培养基&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies, USA</td><td>05002</td><td></td></tr><tr><td>PureCol</td><td>Advanced BioMatrix, USA</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Sisson-Ammons视频分析（SAVA）系统，软件版本V.2.1.15&amp;nbsp;</td><td>Amson Engineering, USA</td><td>不适用</td><td></td></tr></tbody></table>

测定假复层肺气道上皮的纤毛功能与膜不通透性

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway Epithelium

在气液界面（ALI）中分化原代肺气道上皮细胞是一种常用技术，可用于构建模拟肺气道顶面的多细胞假复层气道上皮。尽管原代肺气道细胞的分化是预期结果，但对纤毛功能和膜不透性等生物物理特性的评估可提供气道上皮的质量评价，并确保实验的可靠性。本文介绍了一种在ALI培养体系中构建多细胞假复层气道上皮的简便方案，并评估两个重要的生物物理特性：纤毛功能和膜不透性。为测定纤毛功能，我们使用连接倒置显微镜的高速相机记录培养4周后气道上皮的纤毛运动，随后利用Simon Amon视频分析系统（SAVA）对纤毛摆动频率（CBF）进行量化。此外，我们使用伏欧姆计测量跨上皮电阻（TEER），以评估气道上皮屏障的完整性。

我们评估了来自两位独立匿名供体（两位非吸烟健康成人或患有慢性阻塞性肺疾病（COPD）的成人，均为50岁以上女性）的原代正常人支气管上皮（NHBE）细胞分化所得的气道上皮的纤毛功能及膜通透性。为测定纤毛功能，我们检测了培养28天后分化气道上皮的纤毛搏动频率（CBF）。我们观察到两种气道上皮的CBF均达到至少3 Hz，与先前发表的结果相当（图1)6,7,14我们还通过测定跨上皮电阻（TEER）来评估同一气道上皮的膜不通透性。测得的TEER值约为800 ohm/cm2 对于气道上皮而言，结果与先前已发表的数据相似（图2)6,7,14因...

气液界面培养常用于通过分化原代正常人支气管上皮细胞来构建假复层气道上皮，以模拟肺气道的顶面结构。本文介绍一种通过监测其生物物理特性（如纤毛功能和膜完整性）来评估其质量的简便方案。

在气液界面（air-liquid interface, ALI）中分化原代肺气道上皮细胞是一种常用的多细胞假复层……

我们的研究旨在测量假复层气道上皮的两个关键生物物理特性，这些特性可通过在气液界面分化正常人支气管上皮细胞获得。我们利用假复层气道上皮鉴定了不同呼吸道病毒的特征。例如，呼吸道合胞病毒引发的细胞骨架炎症，这是一种支气管炎的非经典机制。我们还发现杯状细胞增生会增加慢性阻塞性肺疾病气道上皮中SARS-CoV-2的复制。我们的研究重点是阐明呼吸道合胞病毒（RSV）驱动的细胞骨架信号通路调控机制，以确定可用于对抗RSV感染及病毒诱导性细支气管炎的新型治疗靶点。首先，取正常人支气管上皮（NHBE）细胞悬液。使用P200移液器，将重悬的50,000个细胞加入200微升完全气道上皮细胞（AEC）培养基中，接种至小室的顶端侧。将细胞置于37°C、85%至95%湿度的二氧化碳细胞培养箱中孵育。待细胞达到汇合状态后，用无菌镊子将小室转移至空孔中。使用 P1000 移液器吸除所有基础 AEC 培养基。然后向基础室中加入 500 微升新鲜的完全 ALI 分化培养基，该培养基需添加 2% 青霉素-链霉素和 1% 两性霉素 B。使用无菌镊子将插入式培养小室转移至已加入完全 ALI 培养基的基础室中。使用 P200 移液器轻轻吸出小室顶部的 AEC 培养基并进行孵育。48 小时后，用无菌镊子将插入物转移至一个新的无菌小室中。使用 P1000 移液器吸去旧培养基，并加入 500 微升新鲜的完全 ALI 培养基。使用无菌镊子将小室放回孔中，并加入新鲜培养基。第26天，使用P200移液器向小室的顶端加入100 µL DPBS。在37°C、湿润的细胞培养孵育箱中孵育30分钟。然后，使用 P200 移液器吸除 DPBS。首先，打开显微镜、连接的计算机和环境培养箱。打开培养箱门，将含有 NBHE 细胞插件的培养板放置在显微镜载物台上。将培养板放入载物台后，关闭腔室。然后使用显微镜载物台操作旋钮移动培养板，使插入物进入视野。在计算机屏幕上，单击 SAVA 系统图标以打开 SAVA 程序。在软件界面中，点击“配置实验”。在下一个选项卡中，点击“创建实验”。然后，在新选项卡中，在“输入实验目录名称”字段中输入数据将要存储的目录，并在“输入实验描述”字段中填写详细信息，然后点击“确定”。现在，点击已创建并在“实验”部分目录下显示的实验。随后，点击“修改”按钮，在“样品描述”字段中填写样品详细信息。点击“添加”，然后点击“退出”以关闭该选项卡。在主软件界面中，从“实验”槽位的下拉菜单中选择已创建的实验。然后，点击“录制视频”以在计算机屏幕上监测纤毛搏动频率。屏幕将显示清晰的纤毛运动图像。对于每个插入样本，在每秒120帧的条件下，随机记录六个不同视野区域，每个持续2.1秒。单击“保存视频”以监测纤毛搏动频率数据。要分析数据，请在软件界面中单击“分析视频”，然后在下一个选项卡中单击“确定”。接着转到下一个选项卡，单击“全部分析”。下载计算机 SAVA 数据采集文件夹中为每个实验生成的电子表格。数据展示时采用高斯平均频率。健康成人和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的气道上皮纤毛摆动频率均达到至少三赫兹，表明其纤毛功能具有可比性。首先，使用电源开关打开 EVOM2 伏欧表。将测试电阻器连接到 EVOM2 的输入插槽。监测 EVOM2 屏幕上的读数。如果读数高于或低于 1,000，请使用镊子调节 EVOM2 上的 ADJ 开关，直至显示均匀的 1,000 读数，以校准设备。现在，取一个空插件用于实验对照读数。使用 P200 移液器，向空插件的顶端侧加入 100 微升 DPBS。然后，使用 P1000 移液器向基底侧加入 500 微升 DPBS。之后，断开测试电阻器，并将 STX2 电极连接到 EVOM2 的输入插槽。接着，用 70% 乙醇轻轻清洁 STX2 电极。将STX2电极插入含有DPBS的空插件中，短电极腿置于顶端部分，长电极腿置于基底部分。现在记录EVOM2屏幕上的稳定读数。接着，使用P200移液器向插件的顶端侧加入100微升DPBS。将STX2电极插入含有26天分化气道上皮的培养插件中，操作如前所述。然后记录EVOM2屏幕上的稳定读数。慢性阻塞性肺疾病（COPD）成人患者的跨上皮电阻值升高，表明COPD中细胞膜通透性增强。

determining-ciliary-function-membrane-impermeability-pseudostratified

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

确定假复层肺气道上皮的睫状功能和膜不可渗透性

本文介绍了一种利用小鼠气管可视化并定量纤毛运动及纤毛驱动流的简便且可靠的技术。该技术可经修改后用于确定多种因素对纤毛运动的影响，包括药理学试剂、遗传因素、环境暴露，以及黏液负荷等机械因素。...

ex vivo 法对啮齿类动物气道上皮纤毛运动进行高分辨率成像

本研究优化了一种详细的光学显微技术，用于实时观察和分析脉络丛上皮细胞纤毛的运动 离体...

观察脉络丛上皮细胞的纤毛运动 离体

本文中，我们描述了利用双模态放射性核素成像技术在活体小鼠中评估气道黏膜纤毛清除功能（MCC）的实验方案。该方案针对配备小鼠全身（MWB）准直器的双模SPECT/CT系统，设计用于单光子发射计算机断层扫描（SPECT）与计算机断层扫描（CT）的联合采集流程。...

小鼠体内黏膜纤毛清除功能的评估

本方案描述了鼻上皮细胞的采集、扩增和分化为类器官型气道上皮细胞模型的过程，并通过活细胞成像和自定义脚本对纤毛摆动频率进行定量分析。...

原代人类鼻上皮细胞模型的采集、扩增与分化及其用于纤毛搏动频率的定量分析

本方案介绍了一种从原代肺组织中获取人肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化，从而生成能够真实模拟人类气道上皮的三维和二维气道类器官的方法。...

建立人类肺类器官及近端分化以生成成熟气道类器官

本方案介绍了一种基于鬼笔环肽的丝状肌动蛋白染色技术，并结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），用于观察微流控动态培养通道以及传统固定孔静态培养腔室中贴壁细胞层的结构。该方法有助于评估细胞层的融合度、单层形成情况以及层厚的均匀性。...

生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备与结构评估

本文介绍一种可重复、经济且稳健的方法，用于分离和扩增原代支气管上皮细胞，以实现长期生物样本库保存，并通过气液界面培养生成分化成熟的上皮细胞。...

从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库建设及建立高度分化的气液界面培养模型

用于研究香烟烟雾提取物刺激下小鼠气道上皮细胞分化及多组学变化的体外模型

本方案描述了一种通过三碘化物化学发光法测定顶端分泌物中的亚硝酸盐，从而量化气液界面（ALI）分化培养的气道上皮细胞中一氧化氮（NO）生成的方法。...

气液界面分化的小鼠气管上皮细胞培养物中一氧化氮生成的测定

确定培养物中的细胞数量对于标准化培养条件以及进行准确的定量实验至关重要。在本视频中，我们演示如何使用血细胞计数板对细胞进行计数。...

计数并测定培养细胞的存活率

了解如何使用气液界面培养正常人支气管上皮细胞，建立假复层肺气道上皮模型，并通过纤毛摆动频率和跨上皮电阻评估其生物物理特性，为研究呼吸道病毒感染提供可靠方法。

测定假复层肺气道上皮的纤毛功能与膜不通透性

探索更多视频