本方案描述了使用腺相关病毒（AAV）载体进行细胞特异性标记的方法 体内 使用共焦扫描激光检眼镜（CSLO）进行成像。该方法可实现对不同类型视网膜细胞及其在视网膜功能与疾病中作用的研究。
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本方案描述了使用腺相关病毒（AAV）载体进行细胞特异性标记的方法 体内 使用共焦扫描激光检眼镜（CSLO）进行成像。该方法可实现对不同类型视网膜细胞及其在视网膜功能与疾病中作用的研究。
视网膜细胞过程的动态特性要求基因递送和活体监测技术不断进步，以加深对眼病的理解与治疗。本研究介绍了一种优化的腺相关病毒（AAV）方法，通过使用特定的血清型和启动子，实现对靶向视网膜细胞（包括视网膜神经节细胞（RGCs）和穆勒胶质细胞）的高效转染。借助共聚焦扫描激光检眼镜（CSLO）的精确定位能力，本文提出了一种非侵入性的体内成像方法，可连续观察AAV介导的绿色荧光蛋白（GFP）的长期表达。该方法避免了终末性操作，保持了观察的连续性和受试对象的健康状态。此外，可在AAV感染的RGCs中沿视觉通路追踪GFP信号至视顶盖（SC）和外侧膝状体核（LGN），从而实现直接绘制视觉通路的潜力。这些发现提供了一套详细的实验方案，并展示了该强大工具在实时研究视网膜细胞行为、疾病发病机制以及基因治疗干预效果中的应用，为活体视网膜及其连接特性提供了宝贵的见解。
视网膜是中枢神经系统中唯一光学可及的部分，因此成为神经科学研究中一个重要的模型1。视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜的输出神经元，负责将视觉信息传递至大脑，在视觉功能中发挥关键作用。RGCs的丢失或功能障碍会导致视力受损甚至不可逆的失明，如青光眼及其他视神经病变中所见2。穆勒胶质细胞（Müller glia）是视网膜中的主要胶质细胞，对维持视网膜稳态至关重要，可为神经元提供结构和代谢支持，调节神经递质水平，并参与视网膜的修复与再生3。其功能障碍与多种视网膜疾病相关，包括糖尿病性视网膜病变4、年龄相关性黄斑变性5和眼部缺血综合征6。RGCs与穆勒胶质细胞之间存在密切的相互作用和相互依赖关系：穆勒胶质细胞为RGCs提供必要的支持，而RGCs的活动亦可影响穆勒胶质细胞的功能3,7。对RGCs和穆勒胶质细胞的研究对于理解视网膜功能以及开发多种视网膜疾病的有效治疗方法至关重要。
目前视网膜研究中的评估主要采用光学相干断层扫描（OCT）等技术来测量视网膜神经纤维层的厚度或轴突束的走行轨迹....
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所有实验均遵循《眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明》的规定，并经北京首都医科大学机构动物护理和使用委员会批准。所有实验均使用4周龄雄性C57BL/6J小鼠（体重15–20 g），饲养于温度受控的环境中，光照/黑暗周期为12小时/12小时。可自由获取标准啮齿类动物饲料和水 随意摄取本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 腺相关病毒介导的视网膜细胞转染
注意：为了实现对视网膜神经节细胞（RGCs）的靶向转导，本实验方案采用AAV2-hSyn-eGFP，该载体含有hSyn启动子，可驱动增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的高效表达。针对穆勒胶质细胞（Müller glia）的转导则使用AAV9-GfaABC1D-eGFP。为获得最佳的转导效率和强健的外源基因表达，建议用于小鼠玻璃体内注射的腺相关病毒（AAV）滴度至少为1 × 1012 病毒基因组（vg）/mL13。
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根据所提供的实验方案，成功实现了对不同视网膜细胞的可视化与追踪 体内 通过结合AAV介导的基因递送与共焦扫描激光检眼镜（CSLO）技术。AAV2-hSyn-eGFP可有效转导视网膜神经节细胞（RGCs），在全视网膜范围内实现强烈的eGFP表达，该结果经CSLO确认，并通过与RGC特异性标志物RNA结合蛋白多剪接体（RBPMS）的共定位得到验证，后者特异性分布于节细胞层（图2 和 图3）。该方案还证实了利用 AAV9-GfaABC1D-eGFP 靶向穆勒胶质细胞的能力。共聚焦扫描激光检眼镜（CSLO）观察显示，eGFP 表达广泛，特异性分布于视网膜内层，与穆勒胶质细胞已知的主要分布区域一致。此外，GFP 阳性信号与穆勒胶质细胞标志物谷氨酰胺合成酶（GS）高度共定位，进一步验证了该方法的特异性（图2E，F 和 图3B）。这些结果再次证实了腺相关病毒（AA.......
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本方案详细介绍了一种稳定且易于实施的体内监测特定视网膜细胞群体的方法，结合了腺相关病毒（AAV）介导的基因递送与共焦扫描激光检眼镜（CSLO）成像技术的优势。该方法相较于传统手段具有多项优势，可促进在生理或病理条件下对视网膜细胞动态变化及其对损伤或疾病反应的纵向研究。
该方法的成功取决于多个关键步骤。首先，实现最佳的AAV转导效率对于在目标细胞群体中实现荧光报告基因的强效且特异性的表达至关重要。这一过程可能受到多种因素的影响，包括AAV血清型的选择、病毒滴度以及注射技术13,15,16。其次，在共焦扫描激光眼底成像（CSLO）过程中对动物进行恰当的操作与固定，对于减少运动伪影并保持图像质量至关重要。使用定制的成像平台并避免使用全身麻醉，有助于清晰且稳定地观察视网膜结构。第三，必须仔细优化CSLO成像参数，包括焦距、灵敏度和平均设置，以获得高分辨率、低噪声且信噪比最优的图像
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作受到国家自然科学基金（82130029）资助。图2A 和 图4A 使用 BioRender.com 制作。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 33 号针头 | Hamilton Corp., Reno, NV, USA | 7803-05 | 用于玻璃体内注射 |
| 0.5% 丙帕他卡因 | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | 局部麻醉剂 | |
| AAV2-hSyn-eGFP | OBiO Technology Corp., China | 病毒滴度：2.7 × 1012 病毒基因组 (vg)/mL | |
| AAV9-GfaABC1D-eGFP | WZ Biosciences Inc., China | 病毒滴度：4.5 × 1012 病毒基因组 (vg)/mL | |
| 聚维酮碘 | Healthy medical company | 001651 | 局部消毒剂 |
| 角膜巩膜镊（有齿） | 明仁眼科器械，中国 | MR-F301A | 用于玻璃体内注射时固定眼睑 |
| Dumont 05# 镊子 | FST | 51-AGT5385 | 用于视神经挤压 |
| GraphPad Prism | GraphPad Prism, USA | 图形绘制与统计分析 | |
| HRA Spectralis | Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany | "IR" 和 "FA" 模式用于共焦扫描激光眼底成像（CSLO） | |
| Image J/Fiji | National Institutes of Health, USA | 图像处理 | |
| Maxitrol 抗生素眼膏 | Alcon Laboratories, INC. USA | 0065-0631 | 局部抗生素 |
| 微量注射器 | Hamilton Corp., Reno, NV, USA | 7633-01 | 用于玻璃体内注射 |
| 美多丽-P 滴眼液 | Santen Pharmaceutical Co.,Ltd, Japan | 散瞳 | |
| 眼科手术显微镜 | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M220 | 用于外科手术 |
| 戊巴比妥钠 | Sigma Aldrich, USA | 57-33-0 | 全身麻醉剂 |
| PowerPoint | Microsoft Corporation, USA | 图像对齐与裁剪 | |
| VISCOTEARS 液体凝胶（卡波姆） | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Germany | 局部润滑剂 |
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