Name: 用于加载和递送外泌体的微针贴片的制造和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学习微针贴片技术用于外泌体的高效递送与稳定性提升。本方法通过穿透生物屏障实现靶向给药，干态保存增强外泌体稳定性，适用于临床及家庭场景，为外泌体临床应用提供新策略。

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F.L.Q. 感谢先锋计划（Pioneer R）的支持&amp;#38;D 计划（2022C03031）、国家重点研发计划（2021YFA0910103）、国家自然科学基金（22274141，22074080）、山东省自然科学基金（ZR2022ZD28）和山东省泰山学者计划（tsqn201909106）。H.C. 感谢国家自然科学基金（82202329）提供的经费支持。作者感谢中国科学院杭州医学研究所（HIM）共享仪器平台所提供的仪器支持。

本研究无需伦理审批，因为第3节所述实验所用猪皮系从市场购买的食用猪耳，而非来源于实验动物。
1. 外泌体的分离
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>在直径为15 cm的培养皿中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液（100×）（见材料表）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养小鼠卵巢上皮癌细胞ID8。</li>
		<li>将ID8细胞置于CO2培养箱（见材料表）中，于37 °C、5% CO2条件下培养，直至细胞密度达到90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外泌体的分离
	<ol>
		<li>移除培养皿中的培养基，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤两次。加入不含胎牛血清（见材料表）和青霉素-链霉素溶液（见材料表）的DMEM培养基20 mL。继续在37 °C、5% CO2条件下培养48小时。</li>
		<li>收集20个直径15 cm培养皿的细胞培养上清液。在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，收集上清液以去除游离细胞。</li>
		<li>在4 °C条件下以2000 × g离心10分钟，收集上清液以去除细胞碎片。</li>
		<li>将0.22 µm一次性真空过滤系统（见材料表）连接至循环水式真空泵（见材料表）。启动真空，使上清液通过0.22 µm聚醚砜膜进入过滤系统的下腔，从而有效去除上清液中大于0.22 µm的囊泡或杂质。
		<ol>
			<li>连接真空泵时，先打开泵的开关，再将其连接至真空过滤系统的进气口。关闭时，应先断开与泵的连接，再关闭真空泵。此操作可防止真空泵回流，避免培养液污染。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>取15 mL上清液加入100 kDa超滤管的内管中（见材料表）。在4 °C条件下以3500 × g离心10分钟，弃去外管中的液体。 
		注：大于100 kDa的颗粒保留在内管膜上，而小于100 kDa的蛋白质随溶液被离心至外管。外泌体大于100 kDa，因此聚集在内管膜上。</li>
		<li>重复上述步骤，直至液体总体积小于5 mL。收集内管中的液体，加入1 mL DPBS。使用移液器在内管中反复吹打至少200次，确保附着的外泌体充分重悬于DPBS中，然后收集。</li>
		<li>在4 °C条件下以10000 × g离心60分钟，将上清液转移至6 mL快封离心管（见材料表）中，并用热封仪密封管口。</li>
		<li>使用超速离心机（见材料表）在4 °C条件下以100,000 × g离心2小时。剪开快封离心管，弃去上清液，将沉淀用100 µL DPBS重悬。此即为外泌体溶液。 
		注：在重悬沉淀过程中，需使用移液器反复吹打并震荡管壁至少200次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 外泌体微针阵列（exo@MN）的制备
<ol>
	<li>主模具的制备
	<ol>
		<li>使用CAD软件构建一个10 × 10阵列的微针模型，针尖为圆锥形，参数如下：高度1200 µm，底面直径400 µm，间距（相邻微针之间的距离）900 µm。</li>
		<li>以HTL树脂为材料，使用3D打印机打印微针的主模具（见材料表）。</li>
		<li>将主模具浸入无水乙醇中1小时，以去除表面附着的树脂。</li>
		<li>将模具暴露于紫外光下5分钟进行固化。</li>
		<li>再次将模具浸入无水乙醇中1小时，随后在60 °C的干燥烘箱中干燥1小时。主模具制备完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生产模具的制备
	<ol>
		<li>按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS，见材料表）的A组分和B组分。充分搅拌后，将混合物倒入主模具中。</li>
		<li>将PDMS模具置于1 psi压力下15分钟，以去除PDMS混合物中的气泡。</li>
		<li>在60 °C下固化PDMS模具2小时，然后脱模，得到微针的生产模具。</li>
		<li>使用前用超纯水清洗生产模具。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶液的制备
	<ol>
		<li>使用BCA蛋白定量试剂盒（见材料表）测定外泌体溶液的蛋白含量。加入适量DPBS，使外泌体溶液浓度达到10 µg/µL。</li>
		<li>使用DPBS作为溶剂，配制200 mg/mL的海藻糖溶液（见材料表）。搅拌20分钟，确保完全溶解。</li>
		<li>使用DPBS作为溶剂，配制200 mg/mL的透明质酸（HA，见材料表）溶液。搅拌过夜，确保完全溶解。</li>
		<li>使用无水乙醇作为溶剂，配制150 mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮（PVP，见材料表）溶液。搅拌过夜，确保完全溶解。</li>
		<li>将外泌体溶液（10 µg/µL）与海藻糖溶液（200 mg/mL）按1:1体积比混合，然后加入等体积的HA溶液（200 mg/mL），充分混合，得到针尖溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>exo@MN的制备
	<ol>
		<li>使用等离子清洗机（见材料表）对PDMS模具表面进行30秒低功率处理，以增强其亲水性。</li>
		<li>向PDMS模具中加入40 µL针尖溶液。在室温（RT）下以3000 × g离心3分钟，确保液体充满模具的针体层。</li>
		<li>去除模具中多余的液体，并在室温下于真空干燥烘箱中（见材料表）干燥1天。</li>
		<li>向PDMS模具中加入200 µL PVP溶液。在室温下以3000 × g离心3分钟，确保液体充满模具的背衬层。</li>
		<li>在室温下于干燥烘箱中干燥1天，然后脱模，得到exo@MN贴片。 
		​注：exo@MN贴片应保存在干燥烘箱中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="外泌体包封过程示意图，包括离心、干燥，以及使用海藻糖/透明质酸和PVP溶液。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：外泌体@微针贴片的制备流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 外泌体@MN贴片的表征
<ol>
	<li>形态学观察
	<ol>
		<li>将贴片的背衬粘贴至一个倾斜45°的表面，并将其置于体视显微镜下进行观察（参见 材料表）。</li>
		<li>打开照明光源，使用4倍物镜拍摄贴片的形态图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）检测
	<ol>
		<li>使用导电胶将贴片固定在样品台上，并用自动精细镀膜仪（参见 材料表）处理30秒。</li>
		<li>采用加速电压为1 kV的扫描电子显微镜（参见 材料表）拍摄exo@MN贴片的图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>机械性能测试
	<ol>
		<li>从贴片上裁剪出一个3 × 3阵列，将针尖朝上放置在拉力仪的刚性平台上（参见 材料表）。调节探针高度，使其接近针尖但不接触。</li>
		<li>设置参数，当压力达到20 N时自动停止。以0.5 mm/min的速度垂直压缩针尖，并记录载荷-位移曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶解性测试
	<ol>
		<li>从市场购买新鲜猪耳，切成5 cm × 5 cm × 0.3 cm的片状。将猪皮平铺于桌面，并用纸巾吸干表面水分。</li>
		<li>准备四个干燥的微针贴片，针尖朝下贴于猪皮表面，各贴片之间保持适当间距。用拇指和食指垂直按压每个微针贴片。每隔15秒取下一个贴片。</li>
		<li>立即将取下的贴片放入干燥烘箱中，干燥5分钟。剪下一列微针针尖，水平置于显微镜下（参见 材料表），使用4倍物镜观察针尖的溶解情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. exo@MN 贴片中外泌体的表征
注意：将 exo@MN 的微针尖端溶解于 100 µL DPBS 溶液中，以对释放的外泌体进行以下表征。
<ol>
	<li>透射电子显微镜（TEM）
	<ol>
		<li>处理铜网（参见 材料表）并使用离子清洗仪进行亲水处理（参见 材料表5 分钟</li>
		<li>分配 10 µL 将样品滴加到铜网的碳膜面上，静置1分钟，然后从边缘用滤纸吸去液体。</li>
		<li>添加 10 µL 3%醋酸铀溶液（见 材料表)加入样品中，静置10秒，然后从边缘用滤纸吸去液体。</li>
		<li>添加 10 µL 加入3%醋酸铀溶液至样品中，静置1分钟，然后从边缘用滤纸吸去液体，并在室温下晾干。</li>
		<li>使用透射电子显微镜（TEM）拍摄外泌体的图像（参见 材料表加速电压为80 kV。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒跟踪分析（NTA）
	<ol>
		<li>用DPBS稀释外泌体溶液，使颗粒浓度达到1 x 107 颗粒/mL。使用1 mL注射器缓慢将1 mL外泌体溶液注入纳米颗粒追踪分析仪（NTA）的样品室（参见 材料表).</li>
		<li>将仪器的标准操作程序（SOP）类型设置为 EV-488，以检测外泌体的粒径分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹法（WB）
	<ol>
		<li>通过混合放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解缓冲液与苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，见 材料表以100:1的比例在冰上裂解外泌体20分钟，每10分钟涡旋一次。</li>
		<li>将溶液在 12,000 x g 10 min 4 °C收集上清液以测定蛋白浓度。</li>
		<li>加入5倍SDS-PAGE上样缓冲液（参见 材料列表) 按1 : 4的体积比加入上清液中，充分混匀。于 100 °C 10分钟以变性蛋白质。</li>
		<li>添加 5 µL 180 kDa预染蛋白质标记物（参见 材料表）和 10 µg 将变性样品加入至4%-20%预制胶中（参见 材料表). 运行电泳系统（参见 材料表60 V 电泳 10 分钟，然后 140 V 电泳 50 分钟。</li>
		<li>将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜（参见 材料表用甲醇预活化的条件下，在冰上以290 mA电流进行电泳，持续90分钟。</li>
		<li>将PVDF膜置于5%脱脂牛奶溶液中孵育1小时。用含吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST，见 材料表每次5分钟。</li>
		<li>根据蛋白质的位置切下目标条带。将条带与抗小鼠CD63抗体和抗小鼠Alix抗体孵育（参见 材料列表) 按照生产商说明书稀释至适当浓度，于4°C孵育过夜 4 °C.</li>
		<li>用 TBST 洗涤条带三次。加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体孵育（见 材料表室温孵育1小时。然后，用TBST再洗涤三次。</li>
		<li>使用超敏ECL检测试剂（参见 材料表) 以覆盖条带表面，并立即使用凝胶成像系统曝光并捕获条带图像（参见 材料清单).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
	<ol>
		<li>培养 5 x 105 使用2 mL的罗切斯特公园纪念研究所1640（RPMI 1640）培养基，在共聚焦培养皿中培养树突状细胞（DCs）（参见 材料列表）。加入外泌体或 exo@MN，于 37 °C 24 h。</li>
		<li>向每个共聚焦培养皿中加入一滴 Hoechst 33342，在避光条件下孵育 37 °C 20 分钟。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行成像（参见 材料表) 使用60倍物镜。滴加一滴浸油（参见 材料表将物镜上的镜头置于共聚焦培养皿上，并将培养皿放置于载物台上。调节x/y/z轴以定位细胞的合适焦平面。</li>
		<li>使用DAPI/TRITC/TD通道开始成像，选择1024像素的分辨率，并将快速模式设置为1/8秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>在6孔板中培养DCs，每孔含5 x 105 细胞和2 mL 1640培养基。分别加入等体积的DPBS溶液、外泌体、不含外泌体的微针以及exo@MN，混匀后于 37 °C 24小时。</li>
		<li>将每孔中的培养基转移至离心管中。在300 x g 3 分钟 4 °C，弃去上清液。</li>
		<li>添加 0.5 µL FITC-CD11c 抗体 2.5 µL APC-CD80 抗体 0.5 µL 太平洋蓝标记的I-A/I-E抗体（参见 材料表) 至 100 µL 5% BSA 溶液（参见 材料表充分混匀，重悬细胞，在冰上避光振荡孵育20分钟。</li>
		<li>加入 1 mL DPBS，以 300 x g 离心 g 3 分钟 4 °C，然后移除上清液。重复洗涤两次以去除未结合的抗体，随后通过流式细胞术分析相应的荧光通道（参见 材料表).
		<ol>
			<li>首先，在FSC-A/SSC-A散点图中，圈选主要细胞群为P1。在P1细胞群的SSC-A/SSC-H散点图中，沿对角线圈选方形区域P2，以去除聚集细胞。</li>
			<li>使用 FITC、APC 和 Pacific Blue 通道对 P2 细胞群进行荧光分析。设定终止条件为在 P2 门内收集 10,000 个细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 统计学分析
<ol>
	<li>以均值 ± 标准差（SD）表示定量数据。使用适当的数据分析软件，通过 t 检验分析评估统计学显著性。认为 p 值小于 0.05 具有统计学意义。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。</li>
</ol>

Microneedle Patches for Sustained Delivery of Exosomes in Biomedical Applications

<ol><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), 6977(2020).</li>
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</ol>

H. C.、F.L.Q 和 S.J.M 是一项专利申请的发明人，该专利申请基于本文手稿中的数据。H.C. 是 Medcraft Biotech. Inc. 的科学创始人。

目前，分离外泌体的主要方法包括超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫亲和磁珠法以及微流控技术24。由于微针针尖空间较小，导致其载药能力有限，因此有必要提高外泌体的浓度以实现更高载量。为此，我们选择先采用超滤法浓缩细胞培养上清液，再通过超速离心法分离外泌体。通过少量液体重悬的方式提高了外泌体的浓度，使微针能够负载数十至数百微克的外泌体。然而，该方法所获得的外泌体溶液中仍含有大量蛋白质杂质，且在离心过程中会造成显著的外泌体损失。目前，外泌体在治疗应用中的局限性之一，正是缺乏能够高效、高纯度、大规模分离外泌体的有效方法。随着外泌体临床潜力的不断探索，未来亟需开发更先进的技术以应对提取过程中的各项挑战。
本研究的关键技术在于基于外泌体的微针设计。为了最大限度减少外泌体的浪费并实现更强的治疗效果，采用了一种两步浇铸法来制备exo@MN贴片。已有文献报道，海藻糖是适合用于外泌体冻干保存的材料25，而透明质酸（HA）具有优异的生物相容性、亲水性，并在抑制炎症和促进皮肤修复方面发挥功能26。使用这两种材料制备载有外泌体的针尖，有助于维持外泌体的生物活性，使其在皮肤内快速溶解并释放。此外，该方法还可降低感染风险，促进皮肤快速恢复。通过离心和真空干燥处理，使外泌体在微针针尖部位实现富集。考虑到乙醇与海藻糖之间的不相容性，选择将聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶解于无水乙醇中作为背衬材料。这种分层制备方法显著提高了外泌体的递送效率。
外泌体稳定性差 体外在4 °C、37 °C或-80 °C保存时，均可能导致外泌体结构改变或降解11为了解决这一问题，多项研究探索了外泌体的储存方法，例如冻干法。微针技术则提供了另一种新颖的策略。通过在室温下干燥，微针技术可提高外泌体的稳定性，并可直接用于外泌体递送，无需其他处理步骤。此外，外泌体的提取过程复杂且易发生降解，导致其大规模应用面临挑战。采用微针技术储存已提取的外泌体虽不能简化提取步骤，但可减少所需提取次数。一次提取即可制备大量外泌体负载的微针贴片（exo@MN），并实现长期储存。每次治疗使用同一批次制备的外泌体微针，可最大限度降低不同批次间差异对治疗效果的潜在影响，从而提升外泌体纳米平台的可重复性与可靠性27这为外泌体的临床应用提供了更多可能性。
在未来的研究中，值得探索能够精确控制载药量并最大限度减少针尖间药物差异的方法。这可以通过工艺优化、实施质量控制措施以及采用先进技术来实现。解决这些问题将对开发可靠且一致的药物递送系统起到重要推动作用。

外泌体是由细胞释放到细胞外基质中的小囊泡，被认为在多种疾病和癌症的治疗中具有作为生物治疗剂和药物递送载体的潜力1在生物合成过程中，外泌体包裹了细胞内的多种生物活性分子，包括功能蛋白和核酸2因此，在运输过程中被受体细胞摄取后，外泌体能够调控靶细胞中的基因表达和细胞功能3作为一种天然的信息传递介质，外泌体已在组织再生、免疫调节以及作为递送载体方面得到充分应用4通过工程技术，可将特定配体富集于外泌体表面，从而诱导或抑制受体细胞中的信号事件，或靶向特定细胞类型5化疗药物也可被载入外泌体用于癌症治疗6此外，外泌体能够穿过血脑屏障以递送治疗性载荷，因此在脑部疾病治疗中具有广阔的应用前景7与脂质体相比，外泌体表现出更强的细胞摄取能力和更优的生物相容性8它们能够高效进入其他细胞，同时表现出更好的耐受性和更低的毒性9然而，外泌体的传统团注给药方式容易在血液中被肝脏、肾脏和脾脏截留并迅速清除10此外，外泌体的稳定性较差 体外 且易受储存条件影响，限制了其临床应用11.
微针是由微米级针尖组成的阵列，能够穿透生理屏障，用于递送小分子药物12、蛋白质13、核酸14和纳米药物15。微针经过精确设计，可靶向皮肤表面的病灶，其分散的针尖可确保在靶部位实现药物的均匀分布，从而增强治疗效果16。微针的结构设计和材料组成有利于&#160;蛋白质和核酸等生物活性物质的干燥储存，提高其稳定性17。传统的注射方法作用时间相对较短，且可能引起疼痛，导致患者恐惧18。微针的微米级长度可最大限度减少组织损伤并避免刺激神经，从而消除疼痛，提高患者的依从性19。此外，微针使用简便，患者无需专业人员协助即可自行给药16。除皮肤外，微针还可应用于眼部20、口腔黏膜21、心脏22和血管23等组织。利用微针进行外泌体的临床递送，提供了一种具有前景的策略。
因此，我们介绍了一种载有外泌体的微针（exo@MN）贴片，并公开其制备方法。微针贴片采用两步浇铸法结合离心和真空干燥技术制备，该方法可促进外泌体在微针针尖部位的聚集，从而提高递送效率。微针的针尖和背衬均采用具有良好生物相容性和水溶性的材料构建。针尖部分添加了海藻糖和透明质酸（HA）以保护外泌体，背衬材料则选用溶于无水乙醇的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。采用显微镜和扫描电子显微镜&#160;(SEM)对微针贴片的形貌进行表征。通过拉伸仪对微针进行力学性能测试，验证其穿透皮肤的能力，并在猪皮肤上测得释放时间为60秒。此外，采用透射电子显微镜&#160;(TEM)、纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质印迹（WB）对外泌体在新鲜状态以及装载于exo@MN中时的形貌、粒径和蛋白含量进行表征。利用共聚焦激光扫描显微镜&#160;(CLSM)检测树突状细胞（DCs）对外泌体的内化作用，并通过流式细胞术评估DCs的成熟情况。两种来源外泌体的形态学特征和生物学功能基本一致。

<table><tbody><tr><td>100倍青霉素-链霉素溶液</td><td>杰润生物科学</td><td>MA0110</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>180 kDa 预染蛋白标记物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26616</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>3% 醋酸铀酰</td><td>河南瑞鑫实验用品</td><td>GZ02625</td><td>外泌体的形态学表征</td></tr><tr><td>3D 打印机</td><td>BMF 技术</td><td>nanoArch S130</td><td>模具制备</td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;20% 预制胶</td><td>Genscript</td><td>ExpressPlus PAGE 凝胶</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>5&amp;times; SDS-PAGE 上样缓冲液</td><td>泰坦</td><td>04048254</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>抗小鼠Alix抗体</td><td>Biolegend</td><td>12422-1-AP</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>抗小鼠CD63抗体</td><td>Biolegend</td><td>ab217345</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD80 抗体</td><td>Biolegend</td><td>104713</td><td>抗体</td></tr><tr><td>自动匀胶机</td><td>自主</td><td>JBA5-100</td><td>微针的形态学表征</td></tr><tr><td>BCA 法检测试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>蛋白质浓度测定</td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Muitifuge X1R pro</td><td>细胞离心机</td></tr><tr><td>循环水真空泵</td><td>Yuhua Instrument</td><td>SHZ-D(III)</td><td>过滤</td></tr><tr><td>CO2培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>CellXpert C170</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>尼康</td><td>A1HD25</td><td>荧光成像</td></tr><tr><td>铜网</td><td>北京中精科仪科技&amp;nbsp;</td><td>JF-ZJKY/300</td><td>外泌体的形态学表征</td></tr><tr><td>D-(+)-海藻糖二水合物</td><td>Aladdin</td><td>5138-23-4</td><td>微针的制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Meilunbio</td><td>MA0212</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液</td><td>美仑生物</td><td>MA0010</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>电泳系统</td><td>Bio-rad</td><td>PowerPac-basic</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>杰润生物科学</td><td>JR100</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>抗体</td></tr><tr><td>流式细胞术</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>荧光检测</td></tr><tr><td>凝胶成像仪</td><td>Cytiva</td><td>Amersham ImageQuant 800</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>HRP标记的山羊抗兔IgG</td><td>CST</td><td>7074S</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>HTL 树脂</td><td>BMF 技术</td><td></td><td>模具制备</td></tr><tr><td>透明质酸（分子量 = 300 kDa）</td><td>Bloomage Biotechnology</td><td>9004-61-9</td><td>微针的制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>浸油</td><td>尼康</td><td>MXA22168</td><td>荧光成像</td></tr><tr><td>离子清洗器</td><td>JEOL</td><td>EC-52000IC</td><td>外泌体的形态学表征</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>观察微针尖端的溶解过程</td></tr><tr><td>小鼠卵巢上皮癌细胞 ID8</td><td>MeisenCTCC</td><td>&amp;nbsp;CC90105</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>纳米颗粒跟踪分析</td><td>Particle Metrix</td><td>ZetaView</td><td>外泌体大小分析</td></tr><tr><td>太平洋蓝标记的抗小鼠 I-A/I-E 抗体</td><td>Biolegend</td><td>107619</td><td>抗体</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Beyotime</td><td>ST507</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>合肥科晶材料技术</td><td>PDC-36G</td><td>微针的制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷</td><td>道康宁</td><td>9016-00-6</td><td>模具制备</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮（分子量 = 40 kDa）</td><td>Aladdin</td><td>9003-39-8</td><td>微针的制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Prism&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>版本 9</td><td>统计分析</td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>快速离心机</td><td>贝克曼</td><td>344619</td><td>外泌体提取</td></tr><tr><td>RIPA裂解缓冲液</td><td>Applygen</td><td>C1053</td><td>裂解膜</td></tr><tr><td>罗斯威尔公园纪念研究所1640</td><td>美仑生物</td><td>MA0548</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT800</td><td>微针的形态学表征</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>SZX16</td><td>形态学表征</td></tr><tr><td>超敏ECL检测试剂</td><td>Applygen</td><td>P1030</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>拉力计</td><td>Instron</td><td>68SC-05</td><td>机械测试</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100plus</td><td>外泌体的形态学表征</td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水</td><td>Sangon Biotech</td><td>JF-A500027-0004</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼</td><td>Optima XPN-100</td><td>外泌体提取</td></tr><tr><td>超滤管</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>外泌体浓度</td></tr><tr><td>真空干燥箱</td><td>上海易恒科技</td><td>DZF-6024</td><td>微针的制备</td></tr><tr><td>真空过滤系统</td><td>Biosharp</td><td>BS-500-XT</td><td>过滤</td></tr></tbody></table>

微针贴片的制备与表征及其用于外泌体装载与递送

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

外泌体作为一种新兴的&#34;下一代&#34;生物治疗剂和药物递送载体，在从药物递送、再生医学到疾病诊断和肿瘤免疫治疗等多个生物医学领域展现出巨大潜力。然而，传统推注给药方式导致外泌体迅速被清除，且其稳定性较差，限制了其临床应用。微针可作为一种解决方案，延长外泌体在给药部位的滞留时间，从而维持药物浓度，实现持续的治疗效果。此外，微针还具备维持生物活性物质稳定性的能力。因此，我们介绍一种用于负载和递送外泌体的微针贴片，并分享相关方法，包括外泌体的分离、载外泌体微针贴片的制备及其表征。该微针贴片采用海藻糖和透明质酸作为针尖材料，聚乙烯吡咯烷酮作为背衬材料，通过两步浇铸法制备而成。微针具有良好的机械强度，针尖可承受2 N的力。实验中使用猪皮模拟人体皮肤，微针刺入皮肤后，针尖在60秒内完全溶解。从微针中释放的外泌体在形态、粒径、标志蛋白及生物学功能方面均与新鲜外泌体相当，能够被树突状细胞摄取并促进其成熟。

本文介绍了一种外泌体分离、exo@MN 贴片制备及其表征的实验方案。图1展示了exo@MN贴片的制备流程图。将外泌体与海藻糖和透明质酸（HA）混合后，加入微针模具中并进行离心。该过程促使外泌体在针尖处聚集，从而实现快速释放。干燥后，加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液并再次离心，以完全填充模具。待其完全干燥后，脱模即获得exo@MN贴片。采用显微镜和扫描电镜（SEM）对微针的形貌进行表征，结果如图2所示。exo@MN贴片的针尖呈圆锥形，排列为10 × 10阵列，针尖锐利且结构完整。微针针尖可承受2 N的力，足以穿透皮肤屏障。此外，采用猪皮作为人皮肤的替代模型，模拟exo@MN贴片的应用过程。将贴片按压至猪皮表面以观察释放时间，结果显示微针针尖在60秒内完全溶解。将exo@MN贴片溶解于DPBS中进行表征，结果如图3所示。透射电镜（TEM）图像显示囊泡具有典型的杯状结构，符合外泌体的形态特征。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定exo@MN溶液的粒径分布，结果显示颗粒主要集中在50–250 nm范围内。然而，也存在部分较大颗粒，这可归因于HA材料的黏附特性导致的外泌体聚集。对exo@MN溶液中CD63/Alix蛋白进行的WB分析表明，exo@MN能够部分保留外泌体中的蛋白质。exo@MN释放的外泌体的生物学功能在图4中得到验证，重点评估了细胞对外泌体的摄取能力以及树突状细胞（DC）的活化情况，并与新鲜外泌体进行了比较。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像证实，DCs对外泌体的摄取效率较高，无论是新鲜外泌体还是exo@MN中的外泌体均能被有效摄取。流式细胞术的代表性图像及比例统计结果显示，exo@MN中的外泌体具有促进DC活化的生物学功能，其效果与新鲜外泌体相似。
<img alt="微针阵列、扫描电镜图像、压力-位移曲线、动态吸收时间研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：外泌体微针贴片（exo@MN patches）的表征。 （A）外泌体微针贴片的体视显微镜图像。比例尺 = 400 µm。（B）外泌体微针贴片的扫描电镜（SEM）图像。比例尺 = 200 µm。（C）外泌体微针贴片的载荷-位移曲线。（D）外泌体微针贴片在不同时间插入猪皮肤后的显微图像。比例尺 = 400 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="外泌体的透射电镜图像、纳米颗粒尺寸分布图及蛋白质标志物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：新鲜外泌体及 exo@MN 中外泌体的表征。 （A）透射电镜（TEM）观察外泌体形态。比例尺 = 100 nm。（B）纳米颗粒追踪分析（NTA）检测外泌体的粒径分布。（C）Western blot 检测外泌体中 CD63 和 Alix 的表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过显微镜图像、流式细胞术图谱和柱状图结果分析外泌体摄取。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：新鲜外泌体及 exo@MN 中外泌体的生物学检测。 （A）树突状细胞（DC）摄取外泌体的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。比例尺 = 10 µm。（B）流式细胞术检测树突状细胞活化的代表性图谱。（C）CD11c+CD80+MHCII+ 树突状细胞百分比的定量分析。数据以均值 ± 标准差表示（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

外泌体具有重要的临床应用潜力，但其实际应用受限于易降解和难以稳定保存等问题 体内 清除率高且稳定性差。微针技术通过穿透生理屏障实现局部递送，并可在干燥状态下保存，从而克服了外泌体给药的局限性，拓展其临床应用价值。

外泌体作为一种新兴的“下一代”生物治疗剂和药物递送载体，在从基础研究到临床应用的多种生物医学领域中具有巨大潜力，涵盖……

我的研究聚焦于外泌体的高效开发。微针策略的发展能够提高外泌体的稳定性，从而为外泌体的临床应用提供更多可能性。我们将成功开发细胞系以及微针递送系统。这些技术包括自愈合微珠、用于持续药物递送的微针、用于快速载药和给药的超洁净微针装置、用于递送活细胞的侧向微针以及用于递送外泌体的糖微针。我们利用微针穿透生物屏障，从而高效地将外泌体直接递送至靶向区域。通过将其制成干燥状态，可提高其稳定性，使整个过程更加简便，便于临床及家庭使用。在我的实验室中，我们专注于开发先进的基于微针的递送系统的关键技术，该系统能够负载并递送多种治疗剂，包括mRNA、小分子药物、抗体、潜伏细胞以及外泌体。我们还研究这些递送系统在不同生物医学应用中的化学和物理性质及其治疗效果。首先，取培养的小鼠卵巢上皮癌细胞。从培养皿中移除培养基，用 DPBS 洗涤两次。加入 20 毫升不含 FBS 和青霉素-链霉素溶液的 Dobecco 改良 Eagle 培养基。在 37°C 和 5% 二氧化碳条件下孵育 48 小时。然后从20个直径为15厘米的培养皿中收集细胞培养上清液。在4°C下以300 ×g离心10分钟，并收集上清液。将上清液在4°C下以2,000 ×g再次离心10分钟，收集上清以去除细胞碎片。现在打开真空泵，并将其连接至真空过滤系统的进气口。通过0.22微米的聚醚砜膜过滤上清液，以去除大于0.22微米的囊泡或杂质。取15毫升过滤后的上清液加入100千道尔顿超滤管的内管中。在 4 °C 条件下以 3,500 ×g 离心 10 分钟。然后移除外管中的液体。接着，收集内管中的液体。向内管中加入一毫升 DPBS，反复吹打重悬外泌体，然后收集。在 4°C 条件下，以 10,000 G 离心 60 分钟。将上清液转移至 6 毫升快速密封离心管中，并用热封仪密封。将上清液超速离心两小时后，剪开离心管。去除上清液后，用100 µL DPBS重悬沉淀，以获得外泌体溶液。首先，将聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）的A组分与B组分按10:1的比例混合。充分搅拌混合物后，将混合物倒入主模具中。将PDMS模具置于每平方英寸一磅的压力下15分钟，以去除气泡。在60摄氏度下固化PDMS模具2小时。脱模以获得微针的生产模具，使用前用超纯水清洗生产模具。使用BCA法试剂盒定量所制备的外泌体溶液中的蛋白质含量。向外泌体溶液中加入适量DPBS。现在使用DPBS作为溶剂，配制浓度为200毫克/毫升的海藻糖溶液。搅拌20分钟以确保完全溶解。接下来，分别使用DPBS和乙醇作为溶剂，配制透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液。充分搅拌过夜以确保完全溶解。将外泌体溶液与海藻糖溶液按等比例混合。加入等体积的透明质酸溶液，充分混匀，得到尖端溶液。使用等离子清洗机，在低功率下处理PDMS模具表面30秒，以增强其亲水性。向PDMS模具中加入40微升针尖溶液。在室温下以3,000 G离心3分钟，确保液体充满模具的针尖层。去除模具中的多余部分，并在真空干燥箱中室温下干燥一天。然后向PDMS模具中加入200 µL的PVP溶液。在室温下以3,000 ×g离心三分钟，以确保液体充满模具的背衬层。干燥模具一天后，脱模以获得载有外泌体的微针贴片。首先，准备好载有外泌体的微针贴片，并将其背衬粘贴至一个呈45度倾斜的表面。将贴片置于体视显微镜下进行观察。打开照明光源，使用4倍物镜拍摄微针贴片的形貌。进行力学测试时，从贴片上切下3×3阵列的样品，将其针尖朝上放置于拉力计的刚性平台上。调节探针高度，使其接近针尖但不接触。当压力达到20牛顿时，设置参数以自动停止。在记录载荷与位移曲线之前，以每分钟0.5毫米的速度垂直压缩针尖。载有外泌体的微针贴片中的针尖呈圆锥形，排列成10×10阵列，针尖尖锐且完整。微针的尖端可承受两牛顿的力，从而能够穿透皮肤屏障。

fabrication-characterization-microneedle-patches-for-loading-delivery

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于加载和递送外泌体的微针贴片的制造和表征

本文介绍了一种通过光刻技术实现的无模具聚合物微针制备方案。...

通过光刻法制备聚合物微针阵列

本文介绍了一种独特的制备带有通气孔的母模的方法，可在高粘度聚合物浇铸过程中防止气泡滞留，从而实现具有尖锐针尖的明胶微针的制备。通过减少高粘度明胶的浇铸体积，还可制备出薄壁中空的锥形微针。...

制备带有微米级通气孔的微针主模具

本方案描述了包载辣椒素的α-乳白蛋白纳米胶束可溶性微针贴片的制备方法。该方法提供了一种可重复、微创的透皮递送技术，可将疏水性生物活性物质靶向递送至脂肪组织，实现有效的局部减脂，有望拓展其在肥胖管理中的应用。...

制备负载α-乳清蛋白纳米胶束的可溶性微针贴片用于辣椒素经皮递送及脂肪组织减少

本研究旨在提供一份实用指南，帮助研究人员使用溶剂浇铸法（也称为微模塑法）制备自己的 DMAP...

通过溶剂浇铸法制备的可溶性微针阵列贴片及基于微针的生物医学器件的关键表征

本文详细介绍了基于微针的多重传感器的构建方法。该装置正在被开发用于对多种分析物进行原位采样和电化学分析，具有快速且选择性高的特点。我们预期这类基于微针的传感器将在临床医学和生物医学研究中得到应用。...

基于中空微针的多通道透皮电化学传感传感器

我们设计了一种新型机械负荷生物反应器，可在将软骨生物复合材料移植到关节软骨缺损部位之前，对其施加单轴或双轴机械应变。...

用于组织工程的双轴机械加载生物反应器设计

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位...

用于三维细胞培养的自报告支架

当两种相邻的流体通过带有沟槽的微流控通道时，可被引导形成包裹预聚物核心的鞘层，从而 决定微纤维的形状和横截面。光引发聚合反应（如硫醇点击化学反应）非常适合将核心流体快速固化为具有预定尺寸和形状的微纤维。...

预设计尺寸与形状的聚合物及生物杂化纤维的微流控制备

本文介绍了制造和表征一种可延展、类皮肤电子系统的方法，以及将其用于临床应用（特别是皮肤伤口管理）的操作规程。...

用于定量经皮伤口管理的可延展类肤电子系统的制备与表征

组织特异性的细胞外基质（ECM）是调控细胞功能的关键介质。本文介绍了一种合成纯ECM来源的泡沫材料和微载体的方法，这些材料在培养中稳定，无需化学交联，可用于先进的三维体外细胞培养模型或作为促再生生物支架。...

用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

学习微针贴片技术用于外泌体的高效递送与稳定性提升。本方法通过穿透生物屏障实现靶向给药，干态保存增强外泌体稳定性，适用于临床及家庭场景，为外泌体临床应用提供新策略。

微针贴片的制备与表征及其用于外泌体装载与递送

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