Name: 分析 3D 培养物体外细胞侵袭的替代策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: 了解利用异质球体分析肿瘤细胞侵袭的创新方法。该方案结合非肿瘤细胞与癌细胞，在三维培养环境中评估细胞外基质内的侵袭动态及空间共定位模式。

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本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP 20/10544-1 和 20/10664-7）资助。部分图像使用 BioRender.com 生成。

使用原代人细胞的研究已获得阿拉拉夸拉牙科学院 - 圣保罗州立大学（UNESP）机构人体研究伦理委员会批准（CAAE 57895822.0.0000.5416）。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 三维细胞培养用细胞的制备
注意：本节所有步骤均须在层流罩内进行。
<ol>
	<li>获取将形成异质球体的细胞的单细胞悬液。 
	注意：在本实验中，我们生成了包含口腔鳞状细胞癌细胞系（SCC9）、成纤维细胞（来自舌癌活检组织的原代癌症相关成纤维细胞）和单核细胞（来自健康供体的原代单核细胞）的球体（参见步骤2）。请根据实验需求选择相应的细胞类型。</li>
	<li>使用血细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞数量和活率。 
	注意：本方案中细胞比例为5:3:2（5,000个肿瘤细胞 : 3,000个成纤维细胞 : 2,000个单核细胞），每个球体总计10,000个细胞。可根据实验目的优化细胞比例和总数量。</li>
	<li>将不同类型的细胞分别用适用于各自细胞类型的无添加培养基稀释至1.5 mL离心管中，使接种密度达到每孔5,000个肿瘤细胞、每孔3,000个成纤维细胞、每孔2,000个单核细胞，或总体浓度为每毫升500,000个细胞。 
	注意：为确保实验所需细胞数量充足，建议按总需求量多准备20%，以弥补染色和离心过程中的潜在损失。</li>
	<li>使用不同种类的荧光活细胞染料分别对各类细胞进行标记，这些染料可在活细胞中稳定保留数代。将优化浓度的荧光染料加入含细胞的培养基中（例如：肿瘤细胞使用CFSE—绿色染料；成纤维细胞使用CMTPX—红色染料；单核细胞使用Violet BMQC—蓝色染料），37 °C孵育20分钟。 
	注意：应根据所用共聚焦显微镜的参数，选择激发和发射光谱不同的荧光探针，以避免光谱重叠。</li>
	<li>在室温下以400 × g离心5分钟，使细胞沉淀。用200 µL移液枪吸除上清液，并将细胞重悬于1 mL的1× PBS中。</li>
	<li>再次以400 × g离心5分钟形成细胞沉淀，然后将全部细胞重悬于1 mL含补充物的培养基中，培养基成分根据所用细胞类型/细胞系而定（例如：肿瘤细胞添加100 µg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素、10% (vol) 胎牛血清和400 µg/mL氢化可的松；成纤维细胞和单核细胞添加100 µg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素、10% (vol) 胎牛血清）。在显微镜下检查荧光强度，并通过台盼蓝染色计数细胞。</li>
</ol>
2. 三维细胞培养
注意：本研究采用生物打印磁场法11构建异质类球体。在此方法中，使用生物相容性磁性纳米颗粒对细胞进行磁化，并施加温和的磁力作用。应根据细胞类型优化纳米颗粒与细胞的比例。也可采用其他方法建立类球体培养。本节所有操作均应在超净工作台内进行。
<ol>
	<li>按每 20,000 个细胞加入 1 µL 磁性纳米颗粒的比例添加，并通过混合 10 次充分重悬。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，然后通过混合 10 次重悬细胞。重复此离心/重悬循环额外两次。 
	注意：磁化后的细胞将形成棕褐色沉淀。</li>
	<li>完成最后一次离心循环后，吸除培养基，并将细胞重悬于每孔 34 µL 的完全培养基中（34 µL/5,000 个肿瘤细胞；34 µL/3,000 个成纤维细胞；34 µL/2,000 个单核细胞），完全培养基为添加了 100 µg/mL 链霉素、100 IU/mL 青霉素和 5%（体积比）FBS 的 DMEM/F12 培养基（用于肿瘤细胞）。 
	注意：根据孔板规格计算体积。本方案使用 96 孔板，每孔总培养基体积为 100 µL。</li>
	<li>将所有细胞混合至一个新的离心管中进行共培养，然后重悬。</li>
	<li>将 100 µL 共培养细胞转移至超低吸附培养板的每一孔中。</li>
	<li>将球形体驱动磁体置于培养板下方，以诱导细胞聚集和球形体形成，并将培养板放入培养箱（5% CO2，37 °C）中孵育 3 小时。 
	注意：暴露于磁场的时间可根据球形体大小或组成进行调整。</li>
	<li>移除磁体，并将培养板置于培养箱（5% CO2，37 °C）中继续孵育至少 24 小时，以促进细胞外基质蛋白的分泌以及细胞间和细胞与基质间的相互作用。</li>
</ol>
3. 细胞外基质包被的微孔膜制备
注意：本节步骤需在超净工作台中进行。
<ol>
	<li>使用 200 µL 吸头将 50 µL 商业化的细胞外基质添加到 24 孔微孔膜的中央。 
	注意：将细胞外基质置于湿冰上保存。在将基质置于膜表面时，切勿触碰微孔膜。</li>
	<li>使用无菌针头去除气泡，并确保基质覆盖整个膜表面。</li>
	<li>将膜置于培养箱（37 °C）中孵育 1 小时，以使细胞外基质形成凝胶。</li>
</ol>
4. 侵袭实验
注意：本节步骤需在层流罩内进行。
<ol>
	<li>在微孔膜的下室中加入 500 µL 添加了 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基，作为趋化因子。</li>
	<li>小心移除已形成类球体中的培养基，并在异质类球体上方轻柔地加入 50 µL/孔的新鲜无添加 DMEM/F12 培养基。 
	注意：此步骤可使用生物打印磁场方法的固定驱动装置完成。</li>
	<li>使用无菌剪刀剪去 200 µL 低吸附枪头的尖端边缘。 
	注意：枪头的尺寸应根据类球体的大小进行调整。</li>
	<li>使用低吸附枪头吸取类球体及 50 µL 培养基。 
	注意：此步骤应缓慢且小心操作，避免类球体解体。</li>
	<li>将类球体轻柔地放置在细胞外基质的表面。 
	注意：请勿触碰已凝胶化的细胞外基质。</li>
	<li>逐滴小心加入 150 µL 无添加 DMEM/F12 培养基，使总体积达到 200 µL。</li>
	<li>将培养板放入培养箱（5% CO2，37 °C）中培养 48 小时。 
	注意：培养时间可根据细胞系或具体实验方案有所不同。</li>
</ol>
5. 图像采集
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜进行成像。</li>
	<li>根据所用活体荧光染料的激发和发射特性设置显微镜（例如，CFSE染料：488 nm激光，520 nm检测波长；成纤维细胞：CMTPX染料，561 nm激光，610 nm检测波长；单核细胞：Violet BMQC染料，405 nm激光，516 nm检测波长）。</li>
	<li>将培养板装载到显微镜载物台上。</li>
	<li>使用10倍放大倍率的明场定位类球体/细胞。</li>
	<li>将放大倍数调整至40倍。</li>
	<li>为每个荧光通道设置激光功率和探测器增益。</li>
	<li>通过明场观察膜孔，确定膜焦平面作为Z轴层扫的起始点。</li>
	<li>在每个通道（包括明场）中，沿Z轴在膜平面下方采集3张图像，在膜平面上方采集5至8张图像，图像间保持10 µm间隔，覆盖Z轴方向90–120 µm的总深度。</li>
	<li>成像完成后，将项目保存为.czi格式文件。</li>
</ol>
6. 图像提取
注意：图像软件的使用方法如下所述。
<ol>
	<li>使用图像编辑软件打开 .czi 文件（参见 材料清单).</li>
	<li>点击 处理 右上角，然后选择 单个接下来，点击 方法 并选择 图像导出.</li>
	<li>选择下方的文件 输入.</li>
	<li>点击 参数 按钮，然后选择以下设置： 文件类型 （标记图像文件格式 - .TIFF） 压缩 （LZM）， 调整大小 (100%), 应用显示曲线和通道颜色, 单通道图像, 使用通道名称, 定义亚群 （通道，选择所有通道） Z轴位置 （提取全部） 区域 （完整） 瓷砖 （导出选定的图块）和 导出至 （选择目标文件）。 
	注意：要提取合并通道图像，请选择以下设置： 文件类型 （标记图像文件格式 - .TIFF） 压缩 （LZM）， 调整大小 (100%), 应用显示曲线和通道颜色、合并通道图像、使用通道名称、定义子集 （通道，选择要叠加的特定通道） Z轴位置 （提取全部） 区域 （完整） 瓷砖 （导出选定的图块）和 导出至 （选择目标文件）。</li>
	<li>点击 应用 位于右上角的图标。 
	注意：此步骤将同时从不同通道导出图像。</li>
</ol>
7. 图像分析
注意：此步骤中解释了自由软件的使用方法。
<ol>
	<li>点击 文件 在左上角，选择 开放，选择图像，然后单击 OK.</li>
	<li>点击 分析，然后 设置测量参数，并选择 面积，积分密度 和 显示 标记. 点击 好的.</li>
	<li>点击 分析，然后 测量. 
	注意：确保所有图像的面积相同。“积分密度”显示两个数值：（1）原始积分密度（RawIntDen）：图像中所有像素值的总和；（2）积分密度（IntDen）：平均灰度值与面积的乘积。由于图像为RGB彩色图像且所有图像的面积相同，建议采用RawIntDen作为荧光测量值。图像间荧光值（强度与数量）的差异可能反映细胞侵袭与增殖强度的变化。另一种归一化方法是利用不同类型细胞共培养体系，通过计算不同RawIntDen值之间的比值，以标准化细胞在细胞外基质中向微孔膜方向的侵袭模式。 
	比率 RawIntDen =   <img alt="用于数据归一化过程中计算 RawIntDen 值的公式。" src="/files/ftp_upload/67114/67114eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	比值为1表示该特定细胞类型在z轴上细胞侵袭/定位程度最高的图像/位置。</li>
</ol>

3D Models in Cancer Biology: Invasion Dynamics in Heterospheroids

<ol><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+Mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+Plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: Plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 1-16 (2019).</li>
<li>Nagy, ÁG., Székács, I., Bonyár, A., Horvath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+automatic+monitoring+of+cancer+cell+invasion+into+an+epithelial+monolayer+using+label-free+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and automatic monitoring of cancer cell invasion into an epithelial monolayer using label-free holographic microscopy.</a> Sci Rep. 12 (1), 1-13 (2022).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+A+comparison+of+different%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - A comparison of different.</a> Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2016).</li>
<li>Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+cultures%3A+Evolution+of+an+ancient+tool+for+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications.</a> Front Physiol. 13, 1-15 (2022).</li>
<li>Trindade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+3D+cell+culture+State+of+the+art+and+current+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Magnetic 3D cell culture State of the art and current advances.</a> Life Sci. 286, 1-8 (2021).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell Int. 21 (1), 1-19 (2021).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. (160), e61392(2021).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

三维球体培养是研究细胞生物学多个方面的有力方法。本研究中，我们报道了一种利用异质球体评估肿瘤细胞侵袭的实验方案，该方法通过多层次且更具动态性的方式模拟肿瘤微环境。此方法可在非肿瘤性间质细胞存在的条件下，评估共定位及侵袭模式。
有一些关键步骤需要特别注意。首先，选择能够形成球状体的细胞至关重要12。其次，细胞的侵袭速度各不相同，因此在实验方案中优化并确定合适的侵袭时间窗口十分关键。第三，必须优化荧光活体染料的浓度，并选择具有不同激发和发射光谱的染料，以避免光谱重叠。此外，还需考虑所用细胞的增殖速率，因为活体荧光染料发出的荧光会随着细胞分裂而减弱。本实验方案的一个局限性在于，需要使用能够分泌大量细胞外基质以形成致密球状体的细胞，因为较稀疏的球状体在操作过程中置于细胞外基质上时可能被破坏。此外，利用共聚焦显微镜获取多层细胞侵袭的延时成像数据是不可行的。
描述评估肿瘤细胞侵袭方法的文章数量众多，每种方法都有其自身的局限性和优势。一种类似的方法是分析穿过细胞外基质并黏附在微孔膜底面、经结晶...

侵袭是指肿瘤细胞迁移穿过细胞外基质进入周围组织的过程1,2。随着肿瘤的进展，肿瘤细胞会暴露于日益复杂的微环境之中。肿瘤微环境包含细胞外基质的多种组分以及非肿瘤性细胞类型。基质细胞（包括成纤维细胞和常驻巨噬细胞）通过分泌细胞外基质成分、生长因子和细胞因子来重塑微环境，从而反过来影响肿瘤细胞的功能3。基质细胞和浸润的白细胞也在三维微环境中与肿瘤细胞直接相互作用，彼此之间以及与细胞外基质之间也存在相互作用。总体而言，肿瘤微环境（TME）的组成影响肿瘤细胞侵袭的效率和模式4。
肿瘤微环境的复杂性要求采用高效的方法来理解肿瘤组织内的细胞间相互作用。大多数 体外 用于评估侵袭性的检测方法主要是在传统的二维模型和/或单一细胞类型中进行的&#160;培养物5,6,7,8，这&#160;过度简化了侵袭的复杂过程，且存在多种局限性，例如缺乏组织结构、间质成分以及 体内 可重复性。球状体培养代表了一种模型 体外 三维培养&#160;模拟肿瘤团块形态，允许细胞间及细胞与基质间的相互作用，涉及物理和生化特性9近几十年来，三维培养模型的应用日益广泛，有证据表明，与二维模型相比，其在治疗反应、细胞形态和基因表达等多种生物学结果上均存在差异。9,10.
本方案演示了一种用于评估的方法 体外 使用三维球形细胞培养技术研究细胞在人类细胞外基质中的侵袭行为。此外，我们采用由肿瘤细胞、成纤维细胞和单核细胞组成的异质性球体，以模拟包含两种重要非肿瘤细胞类型的肿瘤微环境。通过共聚焦显微镜对细胞在不同侵袭平面上朝向微孔膜的运动进行成像，可在更动态且多层次的背景下可视化该侵袭过程。

<table><tbody><tr><td>96孔生物打印试剂盒</td><td>Greiner Bio-one</td><td>&amp;nbsp;655840</td><td>用于球形体的磁力驱动系统。固定驱动装置。96孔微孔板，具有抗细胞黏附表面</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Violet BMQC 染料</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>C10094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>含Myogel的细胞外基质</td><td>doi: 10.1186/s12885-015-1944-z</td><td></td><td>由Myogel（2.4 mg/mL）、胶原蛋白（0.8 mg/mL）和未添加补充物的肿瘤细胞培养基组成的混合物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>Nanoshuttle-PL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657841</td><td>磁性纳米颗粒</td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>Medix</td><td>AHMD004</td><td>25 x 0.60 mm (23 G x 1)</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1x)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>2012-027</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5,000 U/mL）</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Axygen, Corning Inc.</td><td>TF-200-L-R-S</td><td>带屏障（滤芯）的移液器吸头，200 &amp;micro;L 低吸附滤芯吸头，短型，最大回收率</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>TransWell 24孔板</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>3422</td><td>Transwell 可渗透支持插入物，6.5 mm，24孔板；0.8 &amp;micro;m 聚碳酸酯膜</td></tr><tr><td>Zen 3.4 (蓝色版)</td><td>Zeiss Group</td><td></td><td>软件</td></tr></tbody></table>

分析三维培养物体外细胞侵袭的替代策略

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

类球体培养是一种三维模型，相较于传统的二维（2D）培养，能更真实地模拟体内微环境。侵袭是癌症生物学中备受关注的细胞行为表型。在本方案中，我们设计了一种评估癌细胞侵袭能力的替代策略 体外采用由口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞、癌相关成纤维细胞（CAF）和单核细胞组成的异质类球体。这些异质类球体旨在模拟肿瘤微环境（TME），其中包含两种重要的非肿瘤细胞类型与癌细胞共同存在。在类球体形成前，每种细胞均用发射不同波长荧光的活细胞荧光标记物进行标记。类球体形成后，将其接种于微孔膜上室中一层人源子宫平滑肌瘤来源的细胞外基质上。通过共聚焦显微镜在z轴方向评估细胞侵袭情况。在z轴90 µm深度范围内，以10 µm为间隔，在相应的荧光通道中获取数字图像。使用免费图像分析软件，对每张图像各荧光通道的总荧光强度进行定量分析。该方法可在多层结构背景下更动态地分析细胞侵袭模式，并可观察不同细胞类型在侵袭过程中的空间共定位情况。

本研究提出了一种评估细胞侵袭的替代方法 体外 使用由不同类型细胞构成的球状体。该方法能够分析在多层环境中细胞的侵袭模式，以及侵袭过程中细胞共定位动态的变化。图1).
明场图像显示了类球体/细胞的定位情况，表现为深色或黑色的聚集体（图2A）。膜平面由膜孔内最佳焦平面确定，如图像4所示（图2B）。不同细胞的图像（图3：肿瘤细胞，绿色；成纤维细胞，红色；单核细胞，蓝色）在z轴不同层面以及不同细胞类型之间表现出荧光值（强度和数量）的差异，表明不同细胞具有不同的增殖和侵袭模式。通过共聚焦显微镜，还可叠加不同通道，观察侵袭过程中的共定位模式（图4）。
由于本实验方案中使用了不同类型的细胞，需特别注意对侵袭结果的分析。在考察Ra...

侵袭是癌症发生与进展过程中的一个重要生物学现象。该过程受到肿瘤微环境中非肿瘤性细胞及各种组分的影响。本研究旨在描述一种用于分析肿瘤细胞侵袭的替代方法 体外 使用三维（3D）培养。

类球体培养是一种三维模型，相较于传统的二维（2D）培养，能更真实地模拟体内微环境。

我们的研究团队主要关注癌症与免疫细胞之间的相互作用。我们旨在通过调控肿瘤免疫，研究各种生物学机制对头颈部癌症演变的影响。本实验方案的目的是在多层环境中评估细胞在细胞外基质中的侵袭能力以及不同类型细胞的空间共定位情况。本方案的优势在于使用包含两种相关非肿瘤细胞和癌细胞的异质类球体，以分析细胞在细胞外基质作用下向微孔膜及趋化刺激方向的侵袭能力。首先，将磁性纳米颗粒加入细胞悬液中，混匀10次。在室温下以400G离心细胞5分钟，并混匀10次以重新悬浮细胞。然后将所有细胞转移至新离心管中混匀用于共培养，并将100 µL共培养细胞悬液分装至超低吸附培养板的每个孔中。将球体驱动磁铁置于培养板下方，以诱导细胞聚集和球体形成，并将培养板放入培养箱中孵育3小时。使用200 µL枪头，向24孔微孔膜培养板的中心加入50 µL细胞外基质（ECM）。使用无菌针头去除气泡，确保基质均匀覆盖膜表面。将膜在37摄氏度下孵育一小时以形成凝胶。首先，制备三维细胞培养物和包被有细胞外基质的微孔膜。向微孔膜的下室中加入500微升培养基，培养基中添加10%胎牛血清作为趋化因子。然后小心移除已形成的异源类球体中的培养基，并在每个类球体上方轻轻加入50微升新鲜的无添加培养基。使用无菌剪刀剪去200微升低吸附枪头的尖端边缘，收集类球体及其周围的50微升培养基。将类球体轻轻放置在细胞外基质的上方。随后，逐滴小心加入150微升未添加补充物的培养基，使总体积达到200微升。将培养板放入培养箱中孵育48小时。在分析软件中点击文件。选择打开，然后选择图像并点击确定。接着点击分析，随后选择设置测量以选取面积、积分密度和显示标签。单击“确定”。最后单击“分析”，然后单击“测量”。明场图像表示类球体或细胞定位，由深色或黑色聚集体识别。不同细胞的图像在Z轴方向上的各个图像中表现出荧光强度和数量的差异，表明细胞间存在不同的增殖和侵袭模式。通过共聚焦显微镜，叠加不同通道以观察侵袭过程中的共定位模式。对所展示的代表性结果进行图像分析表明，单核细胞首先侵入，随后是肿瘤细胞，成纤维细胞则是最后侵入细胞外基质的细胞。

alternative-strategy-to-analyze-in-vitro-cell-invasion-of-3d-cultures

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

分析 3D 培养物体外细胞侵袭的替代策略

本文描述了一种在三维胶原凝胶中定量检测转化生长因子（TGF）-β诱导侵袭的实验方法。该方法利用代表乳腺癌不同发展阶段的MCF10A系列细胞系，也可适用于其他细胞系，并可用于研究其他潜在的侵袭激活剂或抑制剂。...

用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

肿瘤细胞侵袭三维细胞外基质的模型更能反映真实情况 体内...

三维集体细胞侵袭的建模与成像

本视频介绍了利用天然基质研究肿瘤细胞侵袭的技术。该检测方法能够在三维环境中评估上皮-间充质细胞相互作用，而无需使用合成或外源性基质。...

肿瘤细胞侵袭实验：一种基于三维体外天然基质的上皮-间质细胞相互作用评估方法

本文描述了常用于体外研究细胞迁移和侵袭的高通可及性方法。in vitro...

体外 细胞迁移与侵袭实验

本文详细介绍了利用三维（3D）实验方法定量分析乳腺癌细胞侵袭的技术。具体而言，我们讨论了建立此类实验所需的步骤、定量方法与数据分析，以及检测细胞侵袭过程中细胞膜完整性丧失的相关方法。...

三维模型定量分析乳腺癌细胞侵袭性

本视频文章描述了一种改良的 体外...

一种改良的 体外 侵袭实验以确定激素、细胞因子和/或生长因子在介导癌细胞侵袭中的潜在作用

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

该方法用于评估癌细胞从类球体向周围三维基质的侵袭。类球体通过悬滴培养法生成，随后包埋于含有基底膜成分和I型胶原的基质中，继而监测类球体外的侵袭情况。...

一种用于在三维环境中评估癌细胞球体侵袭能力的实验方法

本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。...

向上迁移：一种简单灵活的体外三维侵袭实验方案

本方案描述了一种集成化方法，可在单一平台上实时研究癌细胞的迁移与侵袭，为细胞运动性及形态学研究提供了一种易于重复且高效省时的选择。...

使用自动化活细胞成像仪的简单迁移/侵袭实验流程

该方法可同时评估三维球状体实验中的癌细胞侵袭和T细胞介导的细胞毒性。球状体在无支架的琼脂糖多微孔模具中生成。共培养及包埋于I型胶原基质均在同一装置内完成，从而可实时监测癌细胞的侵袭行为以及T细胞介导的细胞毒性效应。...

在三维培养中监测癌细胞侵袭和T细胞毒性

了解利用异质球体分析肿瘤细胞侵袭的创新方法。该方案结合非肿瘤细胞与癌细胞，在三维培养环境中评估细胞外基质内的侵袭动态及空间共定位模式。

分析三维培养物体外细胞侵袭的替代策略

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