Name: 通过富集和蛋白质相关新生DNA测序法对复制DNA链进行的特异性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解eSPAN技术用于分析DNA复制过程中亲代组蛋白回收机制。该方法以酵母和小鼠胚胎干细胞为模型，揭示染色质复制动态及表观遗传信息传递的分子基础。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R35GM118015（Z.Z.）、R01GM130588（C.Y.）以及Hormel启动基金（C.Y.）的支持。

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与前导链和后随链复制相关的蛋白质检测对于理解染色质复制机制及其相关过程具有重要意义，这些过程直接关系到人类癌症研究以及药物耐药机制。多种方法可用于此类研究，例如二维凝胶电泳、天然染色质免疫沉淀（nChIP）、iPOND 和新生染色质捕获29,30,31，已被用于研究DNA复制及相关过程，如DNA修复。此外，一些方法可用于 在体内 新生染色质的绘图，例如 MINCE-Seq（染色质新生元件测序） 在体 EdU标记新生染色质并测序32 以及 CHOR-seq（复制后染色质占据分析）33，已开发用于研究DNA复制过程中组蛋白及其他染色质结合蛋白的动态变化。尽管这些方法显著推动了我们对染色质复制的理解，但均无法检测复制叉不同链上的蛋白质。eSPAN方法可提供靶蛋白在复制叉处的高分辨率、全基因组范围及链特异性的分析谱图。
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在真核生物中，基因组复制起始于多个称为复制起始位点的位点，在这些位点上，起始识别复合物（ORC）结合并启动包括CMG解旋酶在内的蛋白机器的招募，从而启动DNA复制1。每个复制起始位点处的复制体机器形成两个双向移动的复制叉2,3。这两个复制叉通过前导链的连续合成和后随链的不连续合成来复制两条亲本DNA链。由于每个复制叉具有这种不对称性，因此作用于前导链和后随链的复制组分（包括DNA聚合酶）也有所不同。基于突变型DNA聚合酶的前期遗传学分析表明，DNA聚合酶ε（Pol ε）和DNA聚合酶δ（Pol δ）分别是负责前导链和后随链复制的主要聚合酶4,5。目前已开发出多种方法用于检测DNA聚合酶的链偏好性，包括Pu-seq6,7、HydEn-seq8以及emRiboSeq或RiboSeq9,10。这些用于解析链特异性的遗传学方法仅限于DNA聚合酶，并且需要对每种蛋白引入突变4,5,11,12。追踪任何目标蛋白与DNA复制叉上前导链和后随链的关联，将为理解DNA复制过程提供重要见解。为此，我们首先在酵母细胞中建立了eSPAN技术（与蛋白结合的新生DNA富集与测序，图1）。作为原理验证研究，我们首次证明Pol δ和Pol ε分别在后随链和前导链上富集。我们还揭示了其他关键DNA复制组分的链偏好性，包括复制性DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白（复制蛋白A）、增殖细胞核抗原（PCNA）环及其装载复合物复制因子C（RFC）13。更重要的是，我们及其他研究团队已利用该方法揭示了亲本组蛋白传递的机制，这一过程在超过40年的时间里一直难以解析14,15,16,17。
eSPAN 方法包含两个连续步骤：首先通过 ChIP18 或 CUT&amp;#38;Tag19 富集目标蛋白，再通过 BrdU 免疫沉淀富集与该蛋白相关的新生 DNA。在标准的酵母菌株（W303 或 S288C）中，细胞外的 BrdU 或 EdU 无法进入细胞并掺入染色体。这些菌株缺乏适当的核苷转运蛋白以摄取胸苷，也缺乏将胸苷磷酸化为一磷酸胸苷（TMP）所需的胸苷激酶，而该步骤可将 BrdU（或 EdU）转化为 BrdUMP（EdUMP）。表达人源平衡型核苷转运蛋白 1（hENT1）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）可增强胸苷的摄取，并促进 BrdU（或 EdU）转化为 BrdUMP（EdUMP）20。因此，为了在酵母中进行 eSPAN 实验，菌株必须整合 BrdU 掺入结构（BrdU-Inc）（即 HSV-TK 和 hENT1）13,21。
此前，我们已提供了用于酵母中DNA复制蛋白的eSPAN实验方案22。最近，我们将CUT&amp;#38;Tag方法整合到哺乳动物细胞的eSPAN流程中，以解决技术上具有挑战性的步骤，例如交联、染色质剪切，并尽量减少起始细胞数量17,23。在此，我们提供了利用酵母细胞进行可视化分析的组蛋白eSPAN方法（图2）。该方法主要用于分析复制DNA链上组蛋白修饰形式的分布情况。尽管我们测试了多种组蛋白标记，但本文以H3K4me3为例进行说明，该标记存在于亲本组蛋白H3上。为了分析复制叉处的复制体组分及参与DNA修复的相关因子，我们建议采用超声处理将染色质剪切为较小片段，具体操作如我们在第一篇文献中所述22。对于哺乳动物细胞，我们采用了改良的Cut&amp;#38;Tag流程，以替代酵母中所描述的ChIP步骤23。这一改进显著减少了起始材料（细胞）的需求量，更重要的是，能够在无需单链DNA制备试剂盒的情况下构建用于测序的eSPAN文库。在酵母实验方案中，我们选择不使用Cut&amp;#38;Tag方法，原因是起始材料的量已足够。更为关键的是，我们发现Cut&amp;#38;Tag流程在我们的实验条件下对酵母细胞的效果并不稳定。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA低吸附管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>10x Ampligase 缓冲液</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G × 1-1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头</td><td>BD 生物科学</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ACCEL-NGS 1S PLUS DNA文库构建试剂盒</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>10009817</td><td>单链DNA与低起始量DNA文库制备试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>安捷伦 2100 生物分析仪&amp;nbsp;</td><td>安捷伦</td><td>2100 生物分析仪</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000试剂盒&amp;nbsp;</td><td>安捷伦</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&amp;nbsp;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>操作多聚甲醛时需谨慎，其为易燃固体危险品。</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>贝克曼</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP SPRI 试剂</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>抗BrdU抗体&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>抗H3K4me3抗体&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪&amp;nbsp;，型号 TC10</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>杆菌肽&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>盐酸苯甲脒&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>可燃固体</td></tr><tr><td>BrdU&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>小心操作 BrdU，因其具有潜在的致突变性和致畸性。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Forma系列II水套式CO₂培养箱</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养基&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞系 ES-E14&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&amp;nbsp;</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1422842</td><td>200&amp;ndash;400目干筛粒径</td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白A（ConA）包被的磁珠&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&amp;nbsp;tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP2818100</td><td>小心操作乙醇，其具有易燃性</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP26324</td><td>操作异丙醇时需小心，其具有易燃性</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>罗氏</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>sigma</td><td>221473</td><td>操作氢氧化钾时需小心，具有腐蚀性</td></tr><tr><td>低速真空</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力架&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR 温度循环仪</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>微球菌核酸酶&amp;nbsp; （MNase）</td><td>沃辛顿</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>微型珠磨机</td><td>Mini BeadBeater 24 细胞破碎仪</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl₂</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>多平台摇床</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>多平台摇床培养箱</td><td>基准测试</td><td>INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>多温控加热模块&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸&amp;nbsp;(靶向甲基化测序，TAPS)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&amp;ndash;400目干筛粒径</td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>小心操作 NaOH，具有腐蚀性</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2&amp;times; PCR预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J61055.AP</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>sigma</td><td>158127</td><td>操作多聚甲醛时需谨慎，其为易燃固体，具有危险性。</td></tr><tr><td>pA-Tn5 酶&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>苯酚-氯仿-异戊醇&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>P1000、P200、P20 和 P2 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物片剂</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物片剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Protein G-sepharose珠子&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>蛋白沉淀溶液</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质沉淀溶液</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>操作氢氧化钾时需小心，具有腐蚀性</td></tr><tr><td>蛋白质沉淀溶液&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶</td><td>新英格兰生物实验室&amp;nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

通过富集和测序蛋白质相关新生dna方法对复制dna链上蛋白质进行链特异性分析

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

基因组复制由复制体蛋白协调完成，其中包括解旋酶，后者将双链DNA解旋为两条反向平行的单链，每条单链需要不同的复制模式：连续复制（前导链）和不连续复制（后随链）。理解染色质相关蛋白与正在复制的DNA链之间的相互作用 体内 对于阐明染色质组装机制以及与DNA复制相偶联的DNA修复过程至关重要。本方案介绍了蛋白结合新生DNA富集与测序（eSPAN）方法，旨在定量复制叉处前导链和后随链上新生DNA的相对蛋白水平。eSPAN实验流程起始于染色质免疫沉淀（ChIP，用于酵母）或靶点切割与标签化（CUT&amp;#38;Tag；在哺乳动物细胞中）标记目的蛋白，随后通过溴脱氧尿苷（BrdU）免疫沉淀富集与该蛋白结合的新生DNA。对分离得到的单链DNA（ssDNA）进行链特异性的高通量测序。该技术可用于确定某蛋白是否在前导链或后随链复制叉处富集。eSPAN技术可提供复制叉处染色质相关蛋白（包括组蛋白）在全基因组范围内的链偏好性信息。

eSPAN可用于获取关于靶蛋白（如组蛋白及其修饰）的链特异性信息。在此代表性结果中，样本收集和eSPAN操作按照图2所示的流程，利用芽殖酵母系统进行。样本处理与收集遵循本方案中经羟基脲处理的早期S期条件。实验使用了两种酵母菌株：野生型（WT）和mcm2-3A突变体。DNA解旋酶亚基MCM2作为亲代组蛋白H3-H4的分子伴侣，而mcm2-3A突变体（含有3个氨基酸突变）则丧失了结合亲代组蛋白H3-H4的能力14,27。图3A显示了具有恒定长度倍数的DNA片段，呈现出通过生物分析仪分析测序文库所观察到的染色质核小体梯状模式。通常，按照本方案制备的eSPAN文库浓度范围为2 nM至20 nM。在标准eSPAN流程中，我们还制备了输入样本（input）和BrdU免疫沉淀（BrdU-IP）的单链DNA文库，可分别作为ChIP和eSPAN文库的对照或偏差归一化依据。<strong...

蛋白相关新生DNA富集与测序技术（eSPAN）旨在检测染色质相关蛋白在两条复制DNA链上的相对丰度，从而揭示染色质复制及其偶联过程的分子机制。本实验方案描述了在酵母和小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行eSPAN的操作步骤。

通过富集和测序蛋白质相关新生DNA方法对复制DNA链上蛋白质进行链特异性分析

基因组复制由复制体蛋白协调完成，其中包括解旋酶，该酶可将双链DNA解旋为两条反向平行的单链……

我们的研究聚焦于表观遗传继承的机制，特别是与DNA复制偶联的亲本组蛋白回收过程，该过程是表观遗传继承中的首个关键起始步骤。已发现多个参与DNA复制的亲本组蛋白沉积因子在亲本组蛋白回收中发挥重要作用。这包括 D 解旋酶复合物、DNA 聚合酶以及用于保护的复制复合物。传统遗传学和生物化学方法在此研究领域中一直被广泛使用。传统上，高通量测序方法被用于研究亲本组蛋白的传递过程。在富集和测序与蛋白质相关的DNA之前，研究亲代组蛋白的传递过程具有挑战性。该实验方法为解决这些基本问题提供了强有力的工具。首先，收集酵母细胞沉淀，并通过轻柔涡旋重新悬浮。然后用含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物的 0.4 毫升 CHIP 裂解缓冲液洗涤沉淀，以防止细菌污染。将混合物在 5,000 G 条件下离心一分钟。接着，向沉淀中加入含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物的 0.1 毫升 CHIP 裂解缓冲液。加入约 100 微升 0.5 毫米的玻璃珠。在 4 摄氏度冷室中，通过珠磨法裂解细胞，重复三个循环。使用 16 号热针在管底打孔。将穿刺后的离心管嵌套入一个1.5毫升的空DNA低吸附离心管中，收集裂解液，并在室温下以1,600 ×g离心2分钟。小心吸取上清液，避免扰动沉淀物。细胞碎片部分将含有染色质。用移液器将0.35毫升添加了补剂的微球菌核酸酶（MNase）消化缓冲液加入细胞沉淀中，重悬细胞。接着，向悬液中加入10单位MNase。轻轻颠倒混匀4至6次，于37°C水浴中孵育20分钟。加入5微升0.5摩尔的EDTA至终浓度为10毫摩尔，以终止MNase消化反应。轻轻颠倒混匀，将试管置于冰上至少30分钟。使用1.5毫升Bioruptor微管，对反应混合物进行高强度超声处理，总时长3分钟，采用30秒开启、30秒关闭的循环模式。然后，在 4 °C 条件下以 10,000 G 离心 5 分钟。将上清液转移至新的离心管中，再在 4 °C 条件下以 10,000 G 离心 10 分钟。随后，收集约 400 µL 的上清液。将30微升保存为DNA提取的输入DNA，并在-20摄氏度下冷冻。使用剩余的370微升细胞裂解液进行组蛋白染色质免疫沉淀。首先，取约150微升先前获得的输入样本和H3K4me3 CHIP样本，置于100摄氏度的加热块上煮沸5分钟，随后立即在冰上冷却5分钟。然后，向样品中加入上述组分的所需量。在4摄氏度、10转/分钟的旋转条件下孵育样品两小时。将混合物转移至含有20微升经洗涤的蛋白G Sepharose微珠的1.5毫升离心管中。将混合物在4°C、10 RPM转速的旋转器上孵育突变1小时。在室温下以800 ×g离心1分钟。用1毫升冰冷的溴脱氧尿苷（BrdU）免疫沉淀缓冲液重悬珠子，每次洗涤旋转3分钟，共洗涤3次。将离心管再次离心，并用一毫升 TE 缓冲液洗涤三分钟。在室温下以 800 G 离心一分钟，小心吸去上清液。向磁珠中加入含有 1% SDS 的 100 微升 TE 缓冲液。将混合物在 65 摄氏度孵育 5 分钟，然后在室温下以 800 ×g 离心 1 分钟。使用 DNA 纯化柱将上清液纯化至 18 微升洗脱缓冲液中，以获得 BrdU 免疫沉淀和 H3K4me3 eSPAN 样品。根据单链 DNA 及低起始量 DNA 文库制备试剂盒说明书，利用上述样品制备单链 DNA 文库。将连接产物纯化至20微升低EDTA洗脱缓冲液中。使用单链DNA文库制备试剂盒中的50微升反应混合物扩增DNA文库。按照所示循环程序扩增PCR混合物。将PCR产物与60微升预热至30摄氏度的磁珠混合，以纯化PCR产物。充分混匀PCR产物与磁珠。室温静置5分钟。将磁珠置于磁力架上结合3分钟，然后用200 µL新配制的80%乙醇洗涤两次。将磁珠室温干燥2分钟，随后将DNA溶于DNA文库构建试剂盒提供的低EDTA缓冲液中，终体积为20 µL。使用高分辨率电泳系统检测文库浓度及片段大小分布。将包括输入的H3K4me3染色质免疫沉淀、BrdU免疫沉淀和eSPAN样品在内的各个文库等量混合，以进行平行的成对末端测序。对H3K4me3 eSPAN的DNA测序文库进行凝胶分析显示，呈现出典型的染色质核小体梯状条带模式。主单核小体条带位于270个碱基对处，该位置对应于在DNA片段上添加接头后的长度，而DNA片段来源于酶切消化。不同样本的定位结果显示，在野生型和 mcm2-3A 细胞中，围绕自主复制序列 607 的单个核小体位置均出现峰信号。平均链偏向性分析表明，在野生型酵母细胞中，亲本组蛋白的沉积略微偏向滞后链；然而，在突变体中，亲本组蛋白 H3H4 被转移至前导链。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过富集和蛋白质相关新生DNA测序法对复制DNA链进行的特异性分析

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，对单个DNA分子进行实时复制观察的方法。...

利用单分子DNA拉伸实验直接观察酶复制DNA

用于NGS测序的基因组DNA富集是研究遗传性突变的一种简便而强大的工具。本文介绍了对11个参与DNA损伤修复的基因进行完整序列分析的实验流程。...

基于转座酶技术的gDNA富集用于NGS分析BRCA1、BRCA2及9个DNA损伤修复相关基因的全序列

在本实验方案中，我们描述了一种新型的BrdU-ChIP-Slot-Western技术，用于检测与新合成或新生DNA相关的蛋白质及组蛋白修饰。...

使用BrdU-ChIP-Slot-Western技术检测哺乳动物细胞中与新生DNA结合的蛋白质

我们在此描述一种利用位点特异性、可逆的系统 体内 蛋白阻断导致复制叉停滞和崩溃...

在 E. coli 中利用荧光阻遏蛋白-操纵子系统诱导位点特异性复制阻滞

我们描述了一种将流式细胞术与高通量测序相结合的技术，用于鉴定基因组中晚期复制的区域。...

G2-seq：一种基于高通量测序技术鉴定基因组晚期复制区域的方法

采用高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）结合单核苷酸延伸策略，建立了一种无需标记和放射性同位素的DNA聚合酶校对及DNA修复检测方法。该检测方法在检测长度短于9个核苷酸的校对和修复片段时，表现出高度特异性、操作简便、快速且易于实施的特点。...

使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与DNA修复检测

蛋白质结合微阵列（PBM）实验结合生化分析，可关联DNA引物酶（一种在模板DNA上合成RNA引物的酶）的结合特性与催化特性。该方法被称为高通量引物酶分析（HTPP），可用于揭示多种酶的DNA结合模式。...

利用高通量引物酶谱分析技术研究DNA引物酶对DNA序列的识别

利用圆二色光谱法描述了ATP依赖性染色质重塑因子与DNA配体之间的相互作用。通过产生的峰分析基因启动子上发生的诱导构象变化，可用于理解转录调控的机制。...

利用圆二色光谱研究DNA-蛋白质相互作用

本文提供了一种人源重组蛋白 flap 内切酶 1（FEN1）的亲和纯化方法，该蛋白带有...

使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6X-His标签蛋白

本文概述了利用二维凝胶电泳分析通过致病性、易形成结构的重复序列进行复制进程的实验步骤。...

基于SV40的人工附加体中通过结构倾向性DNA重复序列的复制电泳分析

了解eSPAN技术用于分析DNA复制过程中亲代组蛋白回收机制。该方法以酵母和小鼠胚胎干细胞为模型，揭示染色质复制动态及表观遗传信息传递的分子基础。

通过富集和测序蛋白质相关新生DNA方法对复制DNA链上蛋白质进行链特异性分析

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