Name: 评估体外和体外人红细胞生成效率的综合管道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解体外人红细胞生成效率评估方法，使用CD34+造血干细胞进行基因修饰或药物处理后的分化分析。该技术为骨髓增生异常综合征相关贫血治疗研究提供简化可靠的实验流程。

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C.P.、S.B. 和 K.RP. 得到了 HARP 项目、Barts Charity（G-002167）、Kay Kendall 白血病基金（KKL1149）以及英国医学科学院（SBF004\1099）的支持。我们感谢 Pantelitsa Protopapa 博士在 MGG 染色和显微镜图像采集方面的帮助。同时，我们感谢伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所的流式细胞术和显微镜技术平台提供的支持。&#160;我们感谢英国慈善机构 Anthony Nolan 提供本研究中所使用的脐带血单位。

关于原代样本的研究均按照机构指南进行（伦理审查委员会编号：21/EE/0133；IRAS 项目编号：283103）。
1. 慢病毒制备
注意：慢病毒必须在生物安全二级（L2）实验室中无菌条件下进行生产。实验过程中必须穿戴该实验室要求的全部个人防护装备（PPE），包括双层手套。污染材料在丢弃至高压灭菌垃圾桶前，需使用杀病毒消毒剂进行去污染处理。本实验中使用携带 EGFP 报告基因的非特异性 shRNA（对照）以说明该操作流程。
第1天
<ol>
	<li>37℃下温育明胶 &#176;在水浴中加热至完全溶解。用磷酸盐缓冲液（PBS）将明胶稀释至0.1%。</li>
	<li>用 2 mL 0.1% 明胶包被一个 150 mm 培养皿。每种病毒使用两个培养皿。37 °C 孵育 30 分钟。 &#176;C.</li>
	<li>每20 mL含10%杜尔贝科培养基的明胶包被培养皿中接种500万HEK293T细胞&#8242;改良型伊格尔&#8242;s 中（DMEM），并将细胞置于37℃培养箱中 &#176;C.</li>
</ol>
第2天
<ol start="4">
	<li>检查细胞是否已达到约 50% 的汇合度。转染前 2 小时，轻轻更换培养基，加入 22 mL 的 10% DMEM，避免扰动细胞层。</li>
	<li>准备转染混合物。 
	注意：每皿制备一份转染混合物，因为更大的体积可能影响磷酸钙沉淀的形成。
	<ol>
		<li>在 15 mL 离心管中按如下方式配制反应混合液：32 µg 质粒、20 µg PAX（pCMVdR8.74）质粒、9 µg VSVG（pMD.G2）质粒，用 H2O 补足至 1125 µL。</li>
		<li>向反应液中加入 125 µL CaCl2，室温（RT）在摇床上孵育 5 分钟。</li>
		<li>在另一支 15 mL 离心管中准备 1.25 mL 的 2x HEPES 溶液。</li>
		<li>在轻柔涡旋的同时，将 2x HEPES 逐滴加入反应混合液中，然后将混合液置于摇床上，室温孵育 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将反应液以螺旋方式逐滴加入细胞中，然后轻轻以十字形方式移动培养板使培养基混匀，最后将细胞放入 37 °C 培养箱中。</li>
</ol>
第3天
<ol start="7">
	<li>更换培养基，加入 16 mL 的 10% DMEM，注意不要扰动细胞层。</li>
</ol>
第4天
<ol start="8">
	<li>收集上清液，并于 4 °C 下过夜保存。向每块培养板中加入 16 mL 新鲜 DMEM，注意不要扰动细胞层。</li>
</ol>
第5天
<ol start="9">
	<li>收集上清液，并与第4天的上清液合并。使用0.45 µM滤器过滤，以去除碎片。</li>
	<li>将每份30 mL（第4天 + 第5天）的上清液转移至锥形离心管中，用于超速离心。将离心管对称放入摆桶转子中，必要时使用适配器固定锥形底部。</li>
	<li>以0.02 g的精度对称平衡离心管，并在4 °C下以90,000 × g 离心2小时。</li>
	<li>弃去上清液，每管中加入200 µL干细胞培养基。用封口膜封口后，在4 °C冷藏室中振荡孵育2–4小时。</li>
	<li>将每种病毒取20 µL分装，于-80 °C保存。每种病毒保留2 µL，并加入400 µL DMEM。 
	注意：此稀释液将用于滴度测定。</li>
</ol>
2. 慢病毒滴定
注意：慢病毒必须在生物安全二级（L2）实验室的无菌条件下操作。实验过程中必须穿戴所有必要的个人防护装备（PPE），包括双层手套。污染材料在丢弃至高压灭菌废物桶前，需先用杀病毒消毒剂进行去污染处理。
<ol>
	<li>在24孔板中接种HEK293T细胞。每孔加入50,000个细胞和500 µL的10% DMEM培养基。 
	注意：每种病毒使用6个孔，并保留一个孔用于未转导的细胞。</li>
	<li>进行转导。在不同的孔中分别加入步骤1.13中稀释后的病毒2 µL、4 µL、8 µL、16 µL、32 µL和64 µL。轻轻混匀。</li>
	<li>24小时后更换培养基，每孔加入500 µL的10% DMEM培养基。</li>
	<li>转导后第4天，准备细胞进行流式细胞术检测。
	<ol>
		<li>用PBS、2%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（P/S）、2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1/2,000的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）配制FACS缓冲液。</li>
		<li>吸去上清液，每孔直接加入含EDTA的500 µL FACS缓冲液。</li>
		<li>通过移液吹打使细胞脱离孔底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞经40 µm滤网过滤后转移至流式管中。</li>
	<li>通过流式细胞术测定EGFP阳性细胞的百分比。</li>
	<li>设置以下门控：
	<ol>
		<li>设置DAPI对侧向散射光（SSC-A）以排除死细胞。</li>
		<li>设置侧向散射光高度（SSC-H）对侧向散射光面积（SSC-A）以排除细胞聚集体并选择单个细胞。</li>
		<li>设置前向散射光面积（FSC-A）对侧向散射光面积（SSC-A）以圈选细胞并根据细胞大小去除碎片。</li>
		<li>设置绿色荧光蛋白（GFP）对侧向散射光面积（SSC-A）以选择GFP+细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定病毒滴度。
	<ol>
		<li>计算每种条件下的颗粒浓度（颗粒数/mL）：</li>
		<li>（EGFP阳性细胞比例 × 病毒稀释倍数（200） × 接种细胞数 × 1000）/ 病毒体积。 
		注意：例如，细胞接受了64 µL、1/200稀释的病毒处理。流式细胞术分析结果显示54%的细胞为EGFP阳性。在此条件下，滴度计算为（54% × 200 × 50,000 × 1000）/ 64 = 8.44 × 107 颗粒/mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 转导自脐带血中分离的 CD34+ 细胞
注意：本步骤需在无菌条件下进行。此处，使用携带 eGFP 报告基因的一种 shRNA（对照）对 CD34+ 脐带血细胞（纯度 >85%）进行转导。实验设置三个技术重复。比例需根据样本数量进行调整。
第1天
<ol>
	<li>准备以下培养基和缓冲液：
	<ol>
		<li>准备解冻培养基：添加1%青霉素-链霉素（P/S）和10 µg/mL DNA酶的胎牛血清（FBS）</li>
		<li>准备FACS缓冲液：添加1%青霉素-链霉素（P/S）、2%胎牛血清（FBS）（±10 µg/mL DNA酶）的磷酸盐缓冲液（PBS）</li>
		<li>在干细胞培养基中加入150 ng/mL SCF、150 ng/mL FLT-3、10 ng/mL IL-6、25 ng/mL G-CSF、20 ng/mL TPO和1% HEPES，配制刺激培养基</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将100,000个CD34+脐带血（UCB）细胞在37 °C水浴中解冻30秒。向每支冻存管中逐滴加入1 mL解冻培养基，然后轻轻吹打混匀。</li>
	<li>将细胞悬液逐滴转移至总共5 mL解冻培养基中，轻柔混匀。 
	注意：为避免细胞损失，预先保留2 mL解冻培养基，用于最后冲洗移液枪头和冻存管。</li>
	<li>室温下以320 × g离心8分钟。用10 mL FACS缓冲液（含DNA酶）洗涤细胞。</li>
	<li>室温下以320 × g离心8分钟。将细胞沉淀重悬于2 mL刺激培养基中（用刺激培养基冲洗枪头和离心管）。</li>
	<li>取5 µL细胞悬液与5 µL台盼蓝混合，进行细胞计数。 
	注意：细胞总数应至少达到75,000个（每组条件至少25,000个细胞）。</li>
	<li>将2 mL细胞悬液转移至24孔板中，于37 °C孵育≥4–6小时。 
	注意：此步骤中所有细胞（75,000–100,000个）均接种于同一孔中。</li>
	<li>将细胞收集至FACS管中，并用1 mL干细胞培养基补足体积。室温下以320 × g离心8分钟。</li>
	<li>解冻病毒，并按感染复数（MOI）为30的条件，将所需体积加入刺激培养基中。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于含病毒的培养基中，按每100 µL病毒液含100,000个细胞的比例接种至96孔板的1个孔中。在空孔中加入PBS，并于37 °C过夜孵育。</li>
</ol>
第2天
<ol start="11">
	<li>在干细胞培养基中加入 150 ng/mL SCF、150 ng/mL FLT3-L 和 20 ng/mL TPO，配制扩增培养基。</li>
	<li>将 96 孔板中单个孔的全部细胞悬液转移至流式管中，并加入 1 mL 干细胞培养基。用干细胞培养基冲洗孔和移液枪头，最终向流式管中的细胞悬液中加入共计 2 mL 的干细胞培养基。</li>
	<li>在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 2 mL 扩增培养基中。将细胞悬液加入 24 孔板的一个孔中（过程中冲洗孔和枪头，确保总体积为 2 mL）。将细胞在 37 °C 下培养 4 天。 
	注意：细胞分选在第 7 天进行。</li>
</ol>
4. CD34+ EGFP+ 细胞分选与红系分化
注意：此步骤需在无菌条件下进行。
<ol start="1">
	<li>准备以下培养基和缓冲液。 
	注意：含细胞因子的培养基需新鲜配制：
	<ol>
		<li>通过在 PBS 中添加 1% P/S 和 2% FBS 来制备 FACS 缓冲液。</li>
		<li>通过在干细胞培养基中添加 150 ng/mL SCF、150 ng/mL FLT3-L 和 20 ng/mL TPO 来制备扩增培养基（在干细胞培养基中）。</li>
		<li>通过在干细胞培养基中添加 25 ng/mL SCF、3 U/mL EPO 和 50 ng/mL IGF1 来制备红细胞分化培养基（在干细胞培养基中）。</li>
		<li>通过在干细胞培养基中添加 50 ng/mL SCF、6 U/mL EPO 和 100 ng/mL IGF1 来制备 2x 红细胞分化培养基（在干细胞培养基中）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将全部体积的细胞加入一个独立的 FACS 管中（在此过程中用干细胞培养基冲洗孔和移液头）。在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。将沉淀的细胞重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>每管加入 5 µL CD34 抗体（Ab），在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于含 DAPI（在 FACS 缓冲液中稀释 1/2000）的 1 mL FACS 缓冲液中，在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于含 DAPI（在 FACS 缓冲液中稀释 1/2000）的 200 µL FACS 缓冲液中，并在分选前通过 40 µm 滤器过滤。</li>
	<li>准备对照用磁珠：
	<ol>
		<li>在 100 µL PBS 中，向一滴磁珠中加入 0.5 µL CD34 抗体（Ab），在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
		<li>加入 1 mL PBS。在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。弃去上清液，将磁珠重悬于 500 µL PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备白血病细胞系用于 GFP 对照。 
	注意：可使用任何可用的 GFP+ 细胞系作为对照；也可使用磁珠替代。
	<ol>
		<li>在 FACS 管中加入 GFP- 细胞（2 管，每管 100,000 个细胞）和 GFP+ 细胞（1 管，100,000 个细胞）。 
		注意：共 3 管。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞。在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。</li>
		<li>将 100,000 个 GFP- 细胞重悬于 500 µL FACS 缓冲液中（未染色），将 100,000 个 GFP- 细胞重悬于含 DAPI（在 FACS 缓冲液中稀释 1/2000）的 500 µL FACS 缓冲液中（DAPI 染色），将 100,000 个 GFP+ 细胞重悬于 500 µL FACS 缓冲液中（GFP+ 细胞）。 
		注意：对照管将用于流式细胞仪的设门和补偿设置。若所用细胞为 100% GFP 阳性，可在管中加入 GFP- 细胞（50,000 个 GFP- 细胞和 50,000 个 GFP+ 细胞）。</li>
		<li>在分选前通过 40 µm 滤器过滤细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置以下设门：
	<ol>
		<li>设置 DAPI 与侧向散射（SSC-A）以排除死细胞。</li>
		<li>设置 SSC 高度与 SSC 面积（SSC-A）以排除细胞聚集体并选择单细胞。</li>
		<li>设置前向散射面积（FSC-A）与 SSC-A，根据细胞大小去除碎片。</li>
		<li>设置 GFP 与 SSC-A 以选择 GFP+ 细胞。</li>
		<li>设置 CD34（PerCP-Cy5.5）与 SSC-A 以选择 CD34+ 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在收集细胞前，将收集用 FACS 管倒置，使管壁被 FBS 涂覆。</li>
	<li>在干细胞培养基中收集细胞。 
	注意：目标收集 75,000–80,000 个细胞（25,000 个细胞 × 3）</li>
	<li>在室温下以 320 × g 离心 8 分钟，将细胞重悬于 3 mL 红细胞分化培养基中。</li>
	<li>将细胞重悬后，每孔加入 1 mL，分装至 24 孔板中的 3 个孔。所有外周孔中加满 PBS。</li>
	<li>每隔一天进行一次半量换液，并用 2x 红细胞分化培养基替换。
	<ol>
		<li>换液时，确保细胞已沉降至孔板底部。轻轻倾斜孔板，吸出 500 µL 培养基。</li>
		<li>加入 500 µL 2x 细胞因子红细胞分化培养基以更新培养基。</li>
		<li>在第 6 天将细胞转移至 12 孔板，并加入 1 mL 培养基，使终体积为 2 mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
从第6天到第14天，每周两次通过流式细胞术分析红系分化
<ol>
	<li>准备以下培养基和缓冲液。
	<ol>
		<li>通过在 PBS 中添加 1% P/S 和 2% FBS 来制备 FACS 缓冲液</li>
		<li>在干细胞培养基中加入 25 ng/mL SCF、3 U/mL EPO 和 50 ng/mL IGF1，制备红细胞分化培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 12 孔板的每个孔中收集 200 µL 细胞，并补充 250 µL 的 2 倍红细胞分化培养基。向每管中加入 1 mL FACS 缓冲液。</li>
	<li>在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。将沉淀的细胞重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>加入 1 µL CD71 抗体（1/100）、1 µL CD34 抗体（1/100）和 1 µL CD235a 抗体（1/100），在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于含 DAPI（在 FACS 缓冲液中稀释 1/2000）的 1 mL FACS 缓冲液中。在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于含 DAPI（在 FACS 缓冲液中稀释 1/2000）的 200 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>准备用于对照的微珠：
	<ol>
		<li>在两管中各加入 100 µL PBS 和 1 滴补偿微珠，然后向每管中分别加入 0.55 µL 单一抗体，以制备单染对照（分别用于 CD34、CD71 和 CD235a）。 
		注意：1 滴足以用于两个对照。</li>
		<li>在 4 °C 避光孵育 20 分钟。加入 1 mL PBS。</li>
		<li>在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。弃去上清液，将微珠重悬于 500 µL PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于对照的白血病细胞系。 
	注意：K562 细胞表达 CD71 标志物，可用作设置流式细胞术（FACS）的阳性对照。
	<ol>
		<li>在 FACS 管中加入 GFP- 细胞（2 管，每管 100,000 个细胞）和 GFP+ 细胞（1 管，100,000 个细胞）。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞。在室温下以 320 × g 离心 8 分钟。</li>
		<li>将 100,000 个 GFP- 细胞重悬于 FACS 缓冲液（未染色）、100,000 个 GFP- 细胞重悬于含 DAPI（在 FACS 缓冲液中稀释 1/2000）的 FACS 缓冲液（DAPI 染色）中，以及 100,000 个 GFP+ 细胞重悬于 FACS 缓冲液中（GFP+ 细胞）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置以下门控：
	<ol>
		<li>设置 DAPI 与侧向散射（SSC-A）以排除死细胞。</li>
		<li>设置侧向散射高度与侧向散射面积（SSC-A）以排除细胞聚集体并选择单细胞。</li>
		<li>设置前向散射面积（FSC-A）与侧向散射面积（SSC-A）以根据细胞大小去除碎片。</li>
		<li>设置 CD235a（APC-Cy7）与 CD71（PE）。</li>
		<li>设置 CD34（PerCP-Cy5.5）与 SSC-A。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行未染色的 GFP- 细胞样本和完全染色的细胞样本，以调整电压，使细胞位于正确位置。</li>
	<li>运行微珠、GFP+ 细胞和 DAPI 染色的细胞。进行补偿并应用补偿至细胞仪设置。</li>
	<li>运行样本并记录事件。</li>
</ol>
6. 通过吉姆萨染色分析红系分化
<ol>
	<li>准备 5 个载玻片染色缸：
	<ol>
		<li>准备一个装有 May-Grünwald 伊红-亚甲蓝溶液 1:1 原液与 PBS 的载玻片染色缸。</li>
		<li>准备一个装有 2.5 mL Giemsa 原液 + 50 mL PBS 的载玻片染色缸。</li>
		<li>准备一个装有蒸馏水的载玻片染色缸。</li>
		<li>准备一个装有 PBS 的载玻片染色缸。</li>
		<li>准备一个装有冰冻甲醇的载玻片染色缸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集 100,000 个细胞以获得最佳染色效果，加入 1 mL PBS，以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 150 µL PBS 中。</li>
	<li>将载玻片、滤纸和锥形适配器放入细胞离心涂片机中，缓慢将细胞悬液滴加至锥形适配器中。</li>
	<li>以 800 × g 离心 3 分钟。取出载玻片，放入冰浴中的甲醇染色缸中固定 15 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入 May-Grünwald 溶液中染色 5 分钟，期间偶尔轻轻晃动以确保染色均匀。</li>
	<li>随后将载玻片浸入 PBS 染色缸中，直至无多余染料析出。</li>
	<li>将载玻片浸入 Giemsa 溶液中染色 20 分钟，期间偶尔轻轻晃动以确保染色均匀。</li>
	<li>小心地将载玻片浸入 PBS 中，直至无染料析出。</li>
	<li>让载玻片在 PBS 中继续浸泡 3 分钟。</li>
	<li>迅速将载玻片浸入蒸馏水中，室温下自然晾干。</li>
	<li>在每处细胞位置滴加一滴合成树脂，轻轻盖上盖玻片。</li>
	<li>让载玻片在室温下干燥 1 小时，用指甲油封固盖玻片以防止干燥滑脱。</li>
</ol>

Modeling Erythropoiesis Using HSPCs from Cord Blood and Bone Marrow

<ol><li>Sender, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cellular+turnover+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The distribution of cellular turnover in the human body.</a> Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).</li>
<li>Cazzola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+and+its+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis and its treatment.</a> Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).</li>
<li>Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathological+consequences+of+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">The pathological consequences of anaemia.</a> Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).</li>
<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+anemia+and+its+underlying+causes+in+204+countries+and+territories%2C+1990-2019%3A+results+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).</li>
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<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-leucine+in+5q-+syndrome+and+other+RPS14-deficient+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts.</a> Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).</li>
<li>Clough, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+missplicing+of+TMEM14C+and+ABCB7+causes+ring+sideroblast+formation+in+SF3B1-mutant+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).</li>
<li>Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71%28high%29+population+represents+primitive+erythroblasts+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).</li>
<li>Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow%3A+I.+Normal+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development.</a> Blood. 69 (1), 255-263 (1987).</li>
<li>Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71+%28transferrin+receptor%29%3A+an+effective+marker+for+erythroid+precursors+in+bone+marrow+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens.</a> Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).</li>
<li>Berastegui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+DDIT3+is+a+potential+driver+of+dyserythropoiesis+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).</li>
<li>Mian, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+B5+and+succinyl-CoA+improve+ineffective+erythropoiesis+in+SF3B1-mutated+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia.</a> Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).</li>
<li>Armes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+ERCC+excision+repair+6+like+2+%28ERCC6L2%29+mutations+lead+to+impaired+erythropoiesis+and+reshaping+of+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment.</a> Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).</li>
<li>Hug, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+the+RNA+helicase+DHX34+in+NMD+and+pre-mRNA+splicing+and+its+function+in+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.</a> RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种高效且可靠的方法，用于诱导从成人骨髓（BM）或脐带血（UCB）中分离的CD34+造血干细胞（HSPCs）向红系分化。该技术流程包括对原代细胞进行基因编辑/修饰，以研究任何目的基因在红系分化过程中的功能。该方法已成功应用于研究此前未被发现与红系分化相关的基因在健康CD34+ HSPCs以及血液系统恶性肿瘤（如急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征）中的功能意义12,13,14,15。建立红系分化的模型有助于深入理解相关基因在该过程中的生物学意义，并为测试可能缓解分化缺陷的新型治疗策略提供平台。
通过本方案，我们还提供了在分化过程及终点检测时可使用的稳定且可重复的读出指标。这些指标包括通过流式细胞术进行的CD71/CD235a表型分析，以及可用于进一步表征红系分化阶段的瑞氏-吉姆...

每天约有2800亿个红细胞（RBCs）在骨髓中生成，以确保氧气在全身的运输1。红细胞生成是一个精密调控的分化过程，可从造血干细胞产生成熟且具有功能的红细胞。许多获得性或先天性疾病均可影响这一过程，包括骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、地中海贫血和先天性红细胞生成异常性贫血2。
红细胞生成障碍的临床表现为贫血，这是全球发病率的主要原因之一。贫血的症状从疲劳、呼吸急促和头晕，到心力衰竭和心脏骤停等危及生命的情况不等。3全球有18亿人受到贫血影响4，建模红细胞生成过程 离体 研究这些疾病及其潜在机制仍是全球关注的重点。本文所述方法旨在提供一种简单且可靠的模型，用于研究正常与异常的红系分化过程。该模型可解析特定基因在此过程中的作用，并可用于测试可能使贫血患者受益的化合物。历史上，构建无效红细胞生成的模型面临诸多挑战，包括某些病变骨髓中干细胞数量稀少，以及难以模拟骨髓微环境。
先前的研究已使用过类似或更复杂的方案；例如，Bondu 等人. 使用包含促红细胞生成素（EPO）、干细胞因子（SCF）和白细胞介素-6（IL6）的细胞因子混合物培养4天，随后在红系分化阶段去除IL6；相比之下，Yip 等人. 在液体培养7天后才向细胞因子混合物中添加EPO。Elvarsdóttir 等人. 建立了一种三维（3D）培养模型，用于CD34+细胞，以促进红系细胞的最大扩增与成熟，包括生成红细胞岛和去核红细胞，这对于研究环形铁粒幼细胞等现象具有重要意义5,6,7,8。本方案在细胞扩增阶段仅使用三种细胞因子（即SCF、血小板生成素[TPO]和FMS样酪氨酸激酶3[FLT3]），并在整个分化过程中持续维持另外三种细胞因子（即EPO、IGF1和SCF）。这些不同研究共有的一个关键标准是使用CD34+细胞。尽管这些细胞的来源各异，但在不同方案中均被一致采用。其来源范围可从非侵入性的脐带血（UCB）采集，到更具侵入性的成人骨髓样本获取，后者可通过粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员的患者或骨髓穿刺获得。通常，液体培养模型持续14天，而3D模型可维持细胞更长时间。这些方案对于模拟遗传性疾病及红细胞生成过程中的异常至关重要。可采用基因操作方法，如短发夹RNA（shRNA）敲低技术，以沉默目标基因并研究其在红细胞生成中的作用。基因沉默的影响可在分化的各个阶段进行监测，从而建立一种体外（ex vivo）人类红细胞生成模型，用于研究健康与疾病状态下的贫血。本方案包括将shRNA转导至CD34+脐带血细胞，该shRNA组成型表达报告基因（如增强型绿色荧光蛋白[EGFP]），使样本可通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选。随后将细胞在分化培养基中孵育2周，并通过流式细胞术分析和免疫化学染色进行监测。

<table><tbody><tr><td>2x HEPES</td><td>Merck</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>微珠</td><td>Thermo Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>CD235a APC Cy7</td><td>Biolegend</td><td>349115</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP Cy5.5 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td></td></tr><tr><td>CD71 PE 抗体</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Merck</td><td>D4527-200KU</td><td></td></tr><tr><td>DPX 封片剂&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Merck</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Abcam</td><td>ab150670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H0887-100mL</td><td></td></tr><tr><td>人 EPO</td><td>PeproTech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>人 Flt-3 配体</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>人 G-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>人 IGF1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-6</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>人 SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>人 TPO</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-18</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald 染液&amp;nbsp;</td><td>Generon</td><td>26250-01</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250 高通量扫描仪&amp;nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>干细胞培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9655</td><td></td></tr></tbody></table>

体外与离体评估人类红细胞生成效率的综合性流程

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

红细胞生成是一种极为动态且高效的生理过程，负责每日生成定量的红细胞（约每天280 ± 200亿个细胞），对维持个体健康至关重要。该通路中的任何干扰均可能产生显著后果，导致健康问题。根据世界卫生组织统计，全球约有25%的人口表现出贫血症状。本实验方案描述了如何体外生成人红系细胞 体外 使用来自脐带血（UCB）或健康供体血液等来源的造血干细胞和祖细胞（HSPCs） 离体 使用从患者骨髓中分离的造血干细胞和祖细胞（HSPCs），通过基因操作技术可调控HSPCs中目标基因的表达，并在红细胞分化过程的不同阶段监测其对红细胞生成的影响。该方法可用于筛选能够干扰、增强或恢复HSPCs向成熟红系细胞分化能力的化合物，同时可用于研究目标基因在红系分化过程中的功能作用。

首先将来自脐带血或骨髓的CD34+细胞解冻，进行刺激，并用表达GFP的shRNA进行转导（图1A）。转导后第4天，根据图1B所示的设门策略对CD34+GFP+细胞进行分选。代表性结果展示了转导及FACS分选后CD34+细胞的成熟过程。通过以下方法对细胞进行分析：（1）在不同成熟阶段使用CD71/CD235a9,10,11染色进行流式细胞术分析（图1A）；（2）经吉姆萨染色后在显微镜下观察，进行免疫化学分析。
红系分化的特点是依次表达CD71和CD235a，而终末成熟阶段则需要丢失CD71。这些是公认的、可重复且稳定的红系分化标志物<s...

建立红细胞生成模型为理解该过程中各参与因子的生物学意义以及评估可能缓解分化缺陷的新型治疗策略提供了宝贵机会。本文介绍了一种简单且可靠的方法，可高效地将CD34+ 造血干细胞和祖细胞 离体.

红细胞生成是一个极为动态且高效的过程，负责生成每日所需数量的红细胞（约 280 ± 20 × 10⁹ 个）……

我们的研究聚焦于白血病，特别是骨髓增生异常综合征或骨髓增生异常肿瘤。这是一种起源于造血干细胞的干细胞疾病。它会影响多种血细胞谱系，尤其是红系谱系，该谱系负责红细胞的生成。该细胞系的破坏可导致贫血，这在骨髓增生异常综合征（MDS）患者中常见。本文提供的实验流程为在基因修饰或药物处理后，体外评估人红系前体细胞分化效率提供了一种可靠且简化的方 法。造血干细胞自出生起至生命终结始终存在。在我们的机体中，没有哪种组织的增殖性比每天产生数万亿细胞的组织更高。仍有许多未知领域有待探索，因此我们将继续深入研究健康氨基酸组织中的这些神奇细胞，重点聚焦于蛋白质稳态与RNA生物学。首先，将装有100,000个CD34+UCB细胞的冻存管置于37摄氏度水浴中浸泡30秒，以解冻细胞。向冻存管中逐滴加入一毫升解冻液，然后用移液器轻轻吹打使细胞重悬。将重悬后的细胞悬液逐滴转移至五毫升解冻液中。随后在室温下以320 ×g离心八分钟。用 10 毫升含 DNA 酶的荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液洗涤细胞。再次离心细胞后，将沉淀重悬于 2 毫升刺激培养基中。取 2 毫升细胞悬液转移至 24 孔板中，在 37 °C 条件下孵育 4 至 6 小时。然后将细胞收集到荧光激活细胞分选管中，并加入一毫升干细胞培养基补足体积。病毒解冻后，将其所需体积加入刺激培养基中，使感染复数达到30。将细胞沉淀重悬于含病毒的培养基中，细胞密度为每100微升病毒液中含有100,000个细胞，随后转移至96孔板的一个孔中。向空孔中加入 PBS，并在 37 摄氏度下孵育过夜。然后将 96 孔板中细胞悬液的全部体积转移至含有 1 毫升干细胞培养基的 FACS 管中。用干细胞培养基清洗孔和移液枪头，以向 FACS 管中再加入 2 毫升干细胞培养基。离心FACS管后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于2毫升扩增培养基中。将悬液转移至24孔板的一个孔中，孵育细胞。首先，将转导了EGFP报告基因的CD34+细胞全部体积转移至另一个FACS管中。在室温下以 320 ×g 离心八分钟。用 100 µL FACS 缓冲液重悬沉淀的细胞。每管加入 5 µL CD34 抗体，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。然后将细胞重悬于1毫升含DAPI的FACS缓冲液中，在室温下以320 ×g离心8分钟。将细胞重悬于200微升含DAPI的FACS缓冲液后，分选前需通过40微米滤网过滤细胞悬液。接下来，在100微升PBS中取一滴磁珠，加入0.5微升CD34抗体。将混合物置于4°C避光孵育20分钟。然后向混合物中加入1毫升PBS。在室温下以320 ×g离心8分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于500微升PBS中。接着，将GFP阴性与GFP阳性的白血病细胞加入FACS管中。用1毫升FACS缓冲液洗涤细胞。离心细胞后，分别将100,000个GFP阴性细胞和100,000个GFP阳性细胞重悬于500 µL FACS缓冲液中。分选前，将细胞悬液通过40 µm滤网过滤。随后将分选后的细胞收集至干细胞培养基中。在室温下以 320 ×g 离心细胞 8 分钟。然后将细胞重悬于 3 毫升红系分化培养基中。随后将重悬的细胞每 1 毫升分别加入 24 孔板的 3 个孔中。用 PBS 填充所有外周孔。更换培养基时，需确保细胞已沉降至培养板底部。轻轻倾斜培养板，移除 500 µL 培养基。然后加入 500 µL 的 2X 细胞因子红系分化培养基以更换培养板中的培养液。在第 6 天，将细胞转移至 12 孔板中，并向每个孔加入 1 mL 培养基，使最终体积达到 2 mL。从 12 孔板的每个孔中收集 200 µL 细胞悬液。用250微升2倍浓度的红系分化培养基替换已移除的体积。向每根收集管中加入1毫升FACS缓冲液。离心后，将沉淀的细胞重悬于100微升FACS缓冲液中。向各管中分别加入1微升CD71、CD34和CD235a抗体。然后将细胞重悬于1毫升含DAPI的FACS缓冲液中。室温下以320 G离心8分钟。用含DAPI的200微升FACS缓冲液重悬细胞。设置DAPI与侧向散射光（SSC）图以排除死细胞。设置SSC高度与SSC面积图以排除聚集体并选择单细胞。根据细胞大小，设置前向散射面积（FSC-A）与侧向散射面积（SSCA）以去除碎片。设置CD235a与CD71的散点图。设置CD34与SSCA的散点图。运行磁珠标记的GFP阳性细胞和DAPI染色的细胞。对读数进行补偿，并将补偿应用于流式细胞仪的设置。来自脐带血的CD34阳性细胞在第4天时Annexin V阳性凋亡细胞比例为14.4%，到第17天时上升至34.2%。柱状图显示，Annexin V 阳性细胞的百分比在第 17 天显著增加，达到约 40%

a-comprehensive-pipeline-to-assess-efficiency-human-erythropoiesis

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

评估体外和体外人红细胞生成效率的综合管道

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。...

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

本文描述了一种利用人脐带血和白血病骨髓细胞进行造血的三维培养系统。该方法基于使用涂覆有细胞外基质蛋白的多孔合成聚氨酯支架。该支架可适应多种细胞的培养。...

ex vivo 模拟正常与异常的人类造血过程

本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。...

通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

我们介绍一种 体外 小鼠胎肝成红细胞培养系统，可解析终末红细胞生成的早期与晚期阶段。该系统有助于对不同发育阶段中特定基因的功能进行分析。...

小鼠胎肝培养系统用于解析终末红细胞生成早期和晚期靶基因功能

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。...

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

本文介绍了通过ektacytometry测量红细胞变形能力及细胞异质性的技术。这些技术适用于红细胞变形能力的常规研究，以及针对某些血液疾病的特定研究，这些疾病的特点是循环血液中同时存在刚性红细胞和可变形红细胞，例如镰状细胞贫血。...

通过变形性测量和红细胞异质性分析的ektacytometry方法研究血液中的红细胞特性

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

本文介绍的方法总结了利用细胞外通量分析仪实时测定非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），以评估其细胞生物能量学的优化实验方案。...

利用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞及原始祖细胞的细胞生物能量代谢

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

了解体外人红细胞生成效率评估方法，使用CD34+造血干细胞进行基因修饰或药物处理后的分化分析。该技术为骨髓增生异常综合征相关贫血治疗研究提供简化可靠的实验流程。

体外与离体评估人类红细胞生成效率的综合性流程

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