U型水平泳动法用于制备低DNA碎片化指数的高质量精子

[旁白] 本研究聚焦于一种精子优化方法，旨在确定UHS技术在制备低DNA碎片化指数（DFI）的高质量精子方面是否具有优势。微流控技术已被用于优化筛选具有较低DFI的高质量精子。UHS方法的主要局限性在于其高度依赖高质量精子的自主游动能力，因此不适用于精子完全不动的患者。触向性在精子分离过程中起着关键作用。U形轨道具有更长的边界，有助于高质量精子自由移动，从而实现其与不动精子、杂质及其他成分的完全分离。与密度梯度离心（DGC）技术相比，UHS通道法涉及更少的人工操作步骤，且通过UHS通道法获得的高质量精子无需经历反复离心过程，因而DFI更低。首先，在操作皿中加入20微升受精培养基，以形成U形轨迹。用移液器吸取10微升受精培养基，在U形轨道左侧起点处制成一个圆形液滴。沿U形轨道左侧中段间隔位置，使用受精培养基分别制作两个10微升的缓冲液滴。用受精培养基将所有液滴连接起来，形成连续的通道。在U形轨道右侧使用2.5微升聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制成一条长条状液体液滴。在PVP条带右侧，使用卵母细胞处理培养基制作六个微液滴。向皿中加入七毫升培养油，确保油层完全覆盖所有液滴的最高点。将培养皿置于37摄氏度、6%二氧化碳培养箱中过夜平衡。采集精液后，采用称重法测量其体积，精确至0.01毫升。将精液样本置于37摄氏度环境中静置15至30分钟，并用宽口塑料一次性移液管吸取。若精液在60分钟内未完全液化，加入等量的受精培养基。使用一次性塑料转移移液管反复吹吸混合液，直至其完全液化。使用pH范围为6至10的精密pH试纸测定精液的pH值。取10微升完全液化的精液，滴加至视野计数板上。在光学显微镜下200倍视野中评估精子活力。将5微升精液加入ICSI操作皿中U形轨道左侧起点处的受精培养基微液滴中。在4倍物镜下调节卵母细胞固定针和注射针的角度与位置。确认设置无误后，将选定的卵母细胞转移至ICSI操作皿中的卵母细胞处理培养基微液滴中。将含有卵母细胞的操作皿放置于已准备好的显微镜热台上。调焦完成后，将注射针下移至ICSI操作皿中的PVP条带处。将注射针移至U形轨道右侧的长条区域，提取高质量精子。将精子转移至操作皿右侧的PVP条带中，并将其置于操作皿底部。轻压注射针于精子尾部中段或下段位置。迅速回拉注射针并划破精子以使其失活。随后，从尾部至头部将精子吸入注射针内。缓慢将精子注入卵母细胞胞质中，并对注射后的卵母细胞进行培养。向一个15毫升无菌锥底试管中加入1.5毫升45%密度梯度离心液。然后缓慢将1.5毫升90%密度梯度离心液加至45%梯度液底部。将液化后的精液加至梯度离心液表面，在室温下以300×g离心15分钟。去除上清液后，收集约0.5毫升剩余的精子沉淀，并与3毫升受精培养基混合。在室温下以200×g离心5分钟。小心吸走上清液，保留约0.2毫升沉淀，然后振荡混匀以重新悬浮沉淀。最后，在将样本置于37摄氏度、6%二氧化碳培养箱中保存备用前，测定精子浓度和活力。将含有25微升低熔点琼脂糖溶液的试管置于90至100摄氏度水浴中加热1至2分钟。随后将试管转移至37摄氏度水浴中5分钟，直至温度稳定。向低熔点琼脂糖管中加入3至10微升精液并充分混匀。将30微升混合液水平滴加至预处理过的载玻片上。盖上盖玻片后，将预处理载玻片水平置于2至8摄氏度冰箱中4分钟，确保其保持水平状态。从冰箱中取出载玻片，轻轻滑下盖玻片。迅速将预处理载玻片浸入变性液中7分钟。取出载玻片并使其直立。然后用滤纸吸除多余水滴，注意不要触碰标本区域。用蒸馏水冲洗载玻片5秒。将载玻片依次浸入相应溶液中特定时间。随后保持预处理载玻片水平，向其表面加入约1毫升混合染色液。染色5分钟后，用蒸馏水轻轻冲洗染色后的载玻片10至15次。具有良好前向运动能力的高质量精子可沿U形轨道边缘平稳游动，便于胞浆内精子注射针逐一捕获。尽管两种方法均可获得良好精子，但采用密度梯度离心法分离的高质量精子其DNA碎片化指数显著高于U形水平游动法。