Name: 雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的开发与应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 了解雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶系统在活细胞中的应用，通过HEK-293T细胞培养研究SHIP-2磷酸酶活性对细胞形态和迁移的影响。该方法为信号通路研究提供了时空调控酶活性的有效策略。

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作者感谢 Jordan Fauser 博士在 RapR-Shp2 及相关实验方案开发中的贡献。本工作获得了 NIGMS 颁发的 5R35GM145318 项目资助、NCI 颁发的 R33CA258012 项目资助以及 NHLBI 颁发的 P01HL151327 项目资助。

Temporal Regulation of Phosphatase Activity with the Rapamycin-Regulated System

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案详细介绍了化学遗传学控制的磷酸酶的开发、表征及应用步骤。RapR-Shp2工具依赖于在Shp2催化结构域中插入的雷帕霉素调控开关。该工具的优势在于对磷酸酶活性具有高度特异性和严格的时间控制。该工具可适用于其他磷酸酶，并可与先前描述的RapR-TAP技术联用，实现对特定下游信号通路的重建26。RapR方法的独特功能使研究人员能够识别由Shp2激活诱导的瞬时事件，并解析调控特定形态动力学过程的下游信号通路。
RapR磷酸酶的设计受到多个关键因素的影响。目标磷酸酶催化结构域的高分辨率晶体结构对于指导iFKBP插入位点的选择非常有帮助。然而，由于酪氨酸磷酸酶之间具有高度的结构相似性，通过比对催化结构域的氨基酸序列即可获得足够的信息来确定插入位点，这一点可通过Shp2与PTP1B及PTP-PEST的序列比对结果加以说明（图2）。对于RapR-Shp2，选择位于通过β-链与关键催化WPD环相偶联位点的Val406作为最优插入位点。相同的插入位点可能也适用于其他蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPases）的有效调控，这一点已在PTP1B和PTP-PEST中得到验证12（图2A）。
如果目标磷酸酶是一种多结构域蛋白，则有关其结构域排列的结构信息将有助于避免干扰该蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）的其他功能。影响最优RapR-PTPase设计的另一个因素是应替换多少个氨基酸以插入iFKBP。在PTPase中较大且更灵活的插入环可能需要进一步缩短，以确保iFKBP对催化活性的紧密调控。同样，连接iFKBP与PTPase的接头长度和组成也会影响调控效率。由单个甘氨酸（Gly）残基组成的短接头可提供更紧密的调控，但如果即使在iFKBP与雷帕霉素和FRB结合时仍引入持续的结构畸变，则可能降低酶的最大活性。中等长度的Gly-Ser-Gly接头提供了更大的灵活性，但对某些PTPase而言可能刚性不足。由Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly组成的长接头有助于防止形成可能影响PTPase调控的非预期二级结构。RapR-Shp2已测试了这三种类型的接头，结果发现Gly-Ser-Gly接头最为理想。
决定 RapR 工具成功开发的一个关键因素是建立一个稳健的磷酸酶检测方法，并设置适当的对照。将 RapR-磷酸酶活性与靶蛋白（POI）的显性负性突变体和组成型活性突变体的活性进行比较，可评估 RapR 构建体的渗漏程度以及激活程度。此外，若组成型活性磷酸酶未引起去磷酸化，或显性负性突变体导致磷酸化水平降低，则提示反应条件不当。
对于磷酸酶活性检测，每种蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）都需要优化反应条件。温度、反应时间及缓冲液条件的调整取决于特定的PTPase。剧烈振荡样品至关重要，以确保Sepharose结合的PTPase与其底物充分混合。最后，如果上述磷酸酶检测方法对特定的PTPase并非最优，则可采用以对硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate）为底物的磷酸酶反应作为替代检测方法27。
在活细胞成像实验中，制备样品时应考虑多个因素。本方案采用基于 HEPES 缓冲液的 L-15 培养基，其对 CO2 浓度不敏感。如果希望使用基于碳酸氢盐的培养基，则应添加 HEPES 以维持样品的 pH 值，或使用可补充 CO2 的环境控制成像室。本方案建议在样品上方覆盖一层矿物油，以防止蒸发并便于添加雷帕霉素。也可采用其他配置，如使用环境控制成像室或封闭式培养室，但在此类系统中添加雷帕霉素可能更具挑战性。在成像过程中向细胞添加雷帕霉素时，需确保载物台不发生位移，且细胞不受扰动。成像过程中样品的任何额外移动都将阻碍数据采集。应保持较低的光照强度和曝光时间，以减少光毒性，尤其是在长时间成像时。细胞的转染效率也至关重要。FRB 与 RapR-Shp2 DNA 以 1:1 的比例共转染可实现足够的表达水平，但对于新构建的质粒，该比例需进行优化调整。为确保有效激活，FRB 的表达水平应高于 RapR 磷酸酶。
基于RapR的工具的一个局限性是无法快速失活。更换培养基可去除细胞外的雷帕霉素，但由于雷帕霉素与RapR结构之间的结合极为紧密，RapR构建体的失活可能需要数小时。通过添加PTP酶活性位点抑制剂可实现快速失活，但该抑制剂潜在的脱靶效应可能使实验结果的解释变得困难。此外，即使与PTP酶抑制剂联用，RapR方法也无法用于周期性激活/失活实验。RapR系统的另一个局限性是缺乏空间控制能力。RapR构建体在细胞内广泛表达，因此会在细胞内的所有位置被激活。一种可能的解决方案是使用笼状雷帕霉素，其可在细胞内特定区域通过近紫外光局部释放28,29。此外，可通过改造RapR工具，使其在特定蛋白质复合物中或特定亚细胞位置激活目标磷酸酶。通过将结合伴侣或亚细胞定位标签连接至FRB结构域，RapR-PTP酶将被靶向至细胞内的特定蛋白质或特定位置。最后，雷帕霉素是一种通过抑制mTOR而被充分表征的免疫抑制剂，可能影响细胞信号通路，进而干扰目标PTP酶的信号传导。为解决这一问题，非免疫抑制性雷帕霉素类似物（iRap和AP21967）是良好的替代选择。已有研究表明，这两种化合物均可有效调控RapR构建体14。

蛋白酪氨酸磷酸酶是一类参与多种细胞信号转导事件的关键蛋白质家族。研究表明，它们在调控细胞增殖、迁移和凋亡过程中发挥着核心作用1,2,3。因此，蛋白酪氨酸磷酸酶的失调会导致多种严重的疾病和功能紊乱4,5,6,7。长期以来，由于缺乏用于深入探究磷酸酶信号通路复杂机制的工具，酪氨酸磷酸酶的生理功能及其在这些病理过程中的作用研究一直受到阻碍8。
传统上，磷酸酶的研究方法往往缺乏理想的特异性，和/或无法实现对其活性的时间控制。现有工具的这些关键局限性使得解析磷酸酶在信号通路中的特定作用变得困难。通过过表达组成型活性或显性负性突变体，或下调磷酸酶的表达水平，虽可提供一定特异性，但缺乏时间上的控制，且常会引发代偿机制，从而掩盖酶的真实功能。
药理学抑制剂可实现对磷酸酶的时间调控。然而，由于酪氨酸磷酸酶活性位点的组成高度保守，许多磷酸酶抑制剂存在显著的非特异性问题9。此外，由于设计上的限制，靶向催化位点的抑制剂通常细胞膜通透性较差10。抑制剂的另一个局限性在于，它们仅能用于研究磷酸酶失活所带来的效应11。因此，亟需开发能够实现特异性、可时间调控的磷酸酶激活工具。这类工具将使研究人员能够识别磷酸酶激活的直接效应，并将其与生物刺激常引发的多条平行信号级联反应区分开来。尤为重要的是，对活性进行严密的时间控制，有助于识别磷酸酶诱导的瞬时事件，并区分急性与持续性磷酸酶活性的不同效应。将时间调控与突变分析相结合，将有助于深入解析磷酸酶各个结构域的特定功能，并探究其下游信号通路12。
为弥补现有工具在功能上的不足，Karginov 研究团队开发了雷帕霉素调控（Rapamycin Regulated, RapR）系统13,14,15。RapR 系统利用一种经过工程改造的开关结构域 iFKBP，可实现对目标蛋白（protein of interest, POI）的变构调控。将 iFKBP 结构域插入与 POI 催化位点存在变构偶联的位置，可使其对雷帕霉素产生响应。在无雷帕霉素存在时，由于 iFKBP 本身具有较高的结构动态性，会破坏 POI 的催化位点，从而使其失活。加入雷帕霉素后，iFKBP 会与共表达的 FRB 蛋白发生相互作用（图 1），导致开关结构域得以稳定，进而恢复 POI 催化结构域的结构与功能。因此，该工具可实现对 POI 的特异性、时间可控的激活。
<img alt="蛋白质激活示意图；通过iFKBP/FRB复合物形成激活Shp2；分子相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：RapR-Shp2雷帕霉素调控系统的示意图。 RapR系统可通过添加雷帕霉素实现对目标蛋白的变构激活。本图改编自Fauser等人的研究12。缩写：iFKBP = 可插入的FKBP12；FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域；R = 雷帕霉素；Shp2 = 含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
RapR 工具可应用于不同的蛋白质家族，可用于调控蛋白激酶以及磷酸酶12,14。本方案将重点介绍 RapR 工具在控制 Shp2 磷酸酶中的应用。Shp2 是一种广泛表达的蛋白酪氨酸磷酸酶，参与增殖、迁移、免疫调节和分化等信号传导过程1,16,17,18。Shp2 的失调已与多种实体瘤、髓系白血病及发育障碍相关5,7。然而，Shp2 同样受到上述工具局限性的制约。为克服这些限制，研究人员开发并表征了一种可特异性且时间可控的 Shp2 构建体——RapR-Shp212。
在开发RapR-Shp2之前，已知Shp2参与细胞迁移过程19,20,21。然而，Shp2在该过程中所涉及的信号通路中的具体作用尚不清楚。Shp2在何种时间尺度上调控细胞迁移，以及在其激活的不同时间点诱导哪些特定的形态动力学变化，也尚未明确。此外，急性激活与持续激活Shp2是否会产生不同的效应仍不清楚。利用RapR-Shp2，研究发现Shp2的急性激活可诱导短暂的细胞铺展、突起增加、细胞极化以及迁移。同时鉴定出Shp2下游调控不同形态动力学变化的特定信号通路12。本实验方案详细介绍了RapR-Shp2的设计与表征方法，可为其他RapR磷酸酶的开发与应用提供指导。

<table><tbody><tr><td>#1.5 玻璃盖玻片 25 mm 圆形</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli 缓冲液</td><td></td><td></td><td>配制 500 mL：5.18 g Tris-HCl，131.5 mL 甘油，52.5 mL 20% SDS，0.5 g 溴酚蓝，终 pH 6.8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus 缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor 细胞培养腔室</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark 胎牛血清（FBS）</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>热灭活，三重 0.1 &amp;micro;m 无菌过滤</td></tr><tr><td>Brig 35, 30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>发表于 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask 深红色细胞膜染料</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>菌落筛选 MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5α 感受态细胞</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>DNA Marker</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 酶</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-二硫苏糖醇，Cleland 试剂</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET 凝胶回收试剂盒</td></tr><tr><td>Gel Green 核酸染料</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>6x 紫色上样缓冲液</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 图像处理软件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>咪唑缓冲液</td><td></td><td></td><td>25 mM 咪唑 pH 7.2，2.5 mM EDTA，50 mM NaCl，5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH，pH 7.8，50 mM KCl，1 mM EGTA，1% NP40</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>使用 R 2022b 版本运行 CellGeo 函数</td></tr><tr><td>Metamorph 显微镜自动化与图像分析软件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Gene Choice</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 预制胶 12 孔</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>多波段多色镜</td><td>Chroma Technology</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO 40x 物镜</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca 和 Mg 的 PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8 联管及盖子，刚性条带，独立连接圆顶盖</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA 聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/滤纸夹心结构</td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1x [-] 钠</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-乙酸-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>用于电泳</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH，pH 7.8，50 mM KCl，100 mM NaCl，1 mM EGTA，1% NP40</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 EGFR 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>抗 Erk 1/2 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>抗 Flag 抗体</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>抗 mCherry 抗体</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>抗 Paxillin 抗体</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化 EGFR Y992 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化 Erk 1/2 T202/Y204 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化 Paxillin Y31 抗体</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化 PLC&amp;gamma; Y783 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>抗 PLC&amp;gamma; 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的开发与应用

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

酪氨酸磷酸酶是一类重要的酶家族，可调控关键的生理功能。这类酶在人类疾病中常出现失调，因此成为生物学研究的关键靶点。能够调控磷酸酶活性的工具对于解析其功能至关重要。传统的研究方法，例如组成型活性或显性负性突变体的过表达，或利用siRNA进行下调，均缺乏时间上的控制。磷酸酶抑制剂通常特异性较差，且仅能帮助研究人员确定哪些过程受到磷酸酶活性抑制的影响。
我们开发了一种化学遗传学方法，即雷帕霉素调控（RapR）系统，该系统可实现对磷酸酶催化结构域的变构调控，从而对磷酸酶的激活进行严格的时间控制。RapR系统包含一个插入磷酸酶变构位点内的iFKBP结构域。RapR结构域固有的结构动力学会破坏催化结构域，导致酶失活。加入雷帕霉素后，可介导iFKBP与共表达的FRB蛋白形成复合物，从而稳定iFKBP并恢复磷酸酶催化结构域的活性。
该系统可在活细胞中实现磷酸酶激活的高特异性及严密的时间控制。该系统的独特功能使得研究人员能够识别磷酸酶下游信号通路中的瞬时事件，并对单个信号通路进行深入探究。本实验方案详细阐述了构建RapR-磷酸酶的指导原则、其生物化学表征方法，以及对其下游信号转导和细胞形态动力学调控作用的分析流程。同时，本文还提供了蛋白质工程策略的详细说明。 体外 分析磷酸酶活性的检测方法，以及通过活细胞成像实验鉴定细胞形态变化。

图4 展示了基于paxillin的磷酸酶活性检测中可预期的实验结果。在本实验中，使用磷酸化paxillin作为检测指标，比较了组成型活性与显性失活型Shp2磷酸酶的活性，以及活性与非活性RapR-Shp2的活性。Shp2蛋白构建体经免疫沉淀后，按照本方案所述进行活性检测。组成型活性Shp2与活性RapR-Shp2的磷酸化paxillin信号相似，表明RapR-Shp2在引入RapR结构域后其活性未受不利影响，且在激活后仍保持完全活性。显性失活型Shp2与非活性RapR-Shp2的信号也相似，表明RapR-Shp2构建体在未激活状态下无酶活性。这说明RapR-磷酸酶的成功设计。本检测所用的磷酸化底物可根据所研究的磷酸酶不同而有所调整。
图5 与 图4 类似，比较了组成型活性、显性负性以及活性和非活性的 RapR-Shp2。本实验未对构建体进行免疫沉淀，而是旨在表征 RapR-Shp2 构建体在细胞内的下游信号转导效应。在此实验中，Shp2 构建体在 HEK293T 细胞中表达。结果显示，RapR-Shp2 激活后，下游效应分子 ERK1/2 的磷酸化水平升高，与组成型活性样本中的结果一致。而非活性的 RapR-Shp2 则未诱导该变化。这表明 Shp2 的下游信号转导在融合 RapR 结构域后仍得以保留。类似地，在 A431 细胞中，已知的磷酸化底物 EGFR 和 PLCγ 在 RapR-Shp2 激活后发生去磷酸化。
最后，图6展示了RapR-Shp2激活对HeLa细胞形态动力学的影响结果。一旦RapR-Shp2被激活，细胞的突出活动以及细胞面积均有所增加。这表明RapR-Shp2的激活足以诱导HeLa细胞发生形态动力学变化，并可能使研究人员能够探究负责此效应的特定下游信号通路。
<img alt="雷帕霉素处理下蛋白表达的Western印迹结果；Paxillin、Flag-Shp2条带。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：基于Paxillin的活性检测结果：将组成型活性、显性负性以及RapR-Shp2蛋白进行免疫沉淀，并按照所述方案进行活性检测。CA和RapR-Shp2中pY31 Paxillin的水平相似，表明RapR-Shp2构建体在激活后与CA Shp2具有相似的活性。未激活的RapR-Shp2样品无活性，与DN样品类似，表明该构建体无“渗漏”活性。本图改编自Fauser等12。缩写：RapR = 雷帕霉素调控型；Shp2 = 含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶；DN = 显性负性；CA = 组成型活性；FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Western blot 分析，磷酸化 ERK 信号通路，雷帕霉素效应，蛋白质表达比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：全细胞裂解物实验结果：在 HEK293T 细胞中表达了组成型活性、显性失活型以及 RapR-Shp2 蛋白，并完成了全细胞裂解物实验流程。在未激活状态下，RapR-Shp2 不能通过磷酸化激活 ERK1/2，与 DN Shp2 样品结果相似，表明 RapR-Shp2 在失活状态下无活性。激活后，ERK1/2 的磷酸化水平与 CA Shp2 样品相当，表明 Shp2 成功激活并启动了下游信号传导。类似地，表达 RapR-Shp2 的 A431 细胞中，EGFR 和 PLCγ 的磷酸化水平均下降，而这两者均为已知的 Shp2 底物。本图改编自 Fauser 等人12。缩写：RapR = 雷帕霉素调控型；Shp2 = 含 Src 同源 2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶；DN = 显性失活型；CA = 组成型活性；ERK = 细胞外信号调节激酶；GAPDH = 3-磷酸甘油醛脱氢酶；EGFR = 表皮生长因子受体；PLCγ = 磷脂酶 C γ；FRB = FKBP-雷帕霉素结合结构域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞面积变化分析；图表显示RapR-Shp2效应、归一化细胞面积和突出活性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：基于活细胞成像的细胞面积与突出活性数据分析：HeLa细胞转染RapR-Shp2后，按照所述活细胞成像方案进行处理，并根据数据处理方案对结果进行分析。一旦被激活（以垂直灰色线表示），HeLa细胞的细胞突出活性和细胞面积均显著增加。而在仅表达FRB的阴性对照样本中，未观察到此类活性。这表明RapR-Shp2的激活可在HeLa细胞内诱导快速的形态动力学变化，并促进细胞铺展和突起形成。本图改编自Fauser等人的研究12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了雷帕霉素调控的磷酸酶的设计、构建及应用。该方法可在活细胞中实现磷酸酶激活的高度特异性和严格的时空调控。

酪氨酸磷酸酶是一类重要的酶家族，可调控关键的生理功能。它们在人类疾病中常出现表达或功能异常，……

我们的研究重点是开发能够调控酪氨酸磷酸酶活性的工具。我们已将雷帕霉素调控系统应用于多种磷酸酶，并证明该系统可对目标蛋白实现特异性和时间依赖性的调控。我们的目标是确定SHIP-2磷酸酶激活所诱导的形态学变化。RapR 工具使我们能够确定磷酸酶激活在细胞中的瞬时效应，并揭示了参与细胞铺展和迁移的磷酸酶所介导的复杂且特异性的下游效应。此外，我们还确定了同一磷酸酶由结构域驱动的行为特征。这些发现增进了我们对磷酸酶在调控细胞形态光动力学及下游信号传导机制方面的理解。我们的 RapR 工具能够对目标磷酸酶进行特异且时间可控的调控。将 iFKBP 结构域插入磷酸酶后，其可作为别构开关，在与雷帕霉素结合后恢复磷酸酶的活性，起到“开启”作用。我们还可以利用雷帕霉素调控系统重建信号复合物。我们利用RapR工具的研究结果为确定SHIP-2相互作用组对其调控细胞活性能力的影响打开了新的途径。我们发现SHIP-2的SH2结构域结合在细胞回缩过程中至关重要。通过使用RapR工具，我们可以进一步探究哪些结合伴侣分子可能介导了这一调控作用。首先，获取 HEK-293T 细胞。在六孔组织培养板中，每孔接种 800,000 个细胞，使用添加补剂的 DMEM 培养基。将培养板置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜，以达到 60% 至 80% 的融合度。接下来，将每份血浆DNA各一微克与200微升无血清DMEM培养基及六微升转染试剂混合。室温孵育15分钟后，将100微升转染混合物加入细胞培养板的每个孔中。在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。第3天，向细胞中分别加入适量的雷帕霉素或乙醇，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育1小时。随后将培养板置于冰上，用3毫升预冷的PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS后，加入300微升含有雷帕霉素或乙醇的裂解缓冲液，用细胞刮棒轻轻刮取细胞。将样品转移至1.5毫升离心管中，在4°C、1,000 g条件下进行微量离心10分钟。为检测表达水平，取20微升上清液分装至新的1.5毫升离心管中。在95至100°C条件下，将样品与含5%β-巯基乙醇的20微升2×Laemmli缓冲液孵育5分钟。首先，培养并制备表达RapR-Shp2的HEK-293T细胞用于免疫沉淀。在准备Sepharose时，将重悬的蛋白G Sepharose加入一个1.5毫升离心管中。加入裂解缓冲液后，在2,000 ×g条件下用微量离心机离心1分钟，并小心移除裂解缓冲液。然后通过轻轻倒置离心管数次，将 Sepharose 重悬于 380 微升裂解缓冲液中。将 Sepharose 与 BSA 及抗体在 4 摄氏度下于旋转仪上孵育 1.5 小时。按照之前演示的方法洗涤 Sepharose 后，使用剪去尖端的吸头小心地将其重新悬浮于裂解缓冲液中。取表达RapR-Shp2的HEK-293T细胞的上清液，加入到新1.5毫升离心管中悬浮的50微升Sepharose中，置于旋转仪上，4摄氏度孵育1.5至2小时。首先，获取表达RapR-Shp2的HEK-293T细胞，并使用蛋白G Sepharose进行免疫沉淀。免疫沉淀后，先用0.5毫升裂解缓冲液洗涤Sepharose两次，每次0.5毫升，再用0.5毫升洗涤缓冲液洗涤两次。最后一次离心后，尽可能吸除上清缓冲液。然后向每个样品中加入40 µL磷酸化paxillin咪唑缓冲液混合物，可加入或不加入1 µmol/L雷帕霉素。轻轻弹动离心管混匀，立即放入32 °C的恒温振荡器中孵育40分钟。将加热振荡器设置为每分钟 1,000 转，以确保样品充分振荡。为终止反应，向每个样品中加入 40 微升 2x Laemmli 缓冲液，并在 95 至 100 摄氏度下孵育五分钟。待样品冷却后，将每个样品取 15 微升上样至 4 至 15% 的梯度 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中。使用PVDF膜进行标准的Western印迹实验。最后，用抗FLAG抗体检测RapR-Shp2构建体，并用抗磷酸化paxillin抗体检测样品中磷酸化的paxillin。活性RapR-Shp2未显示磷酸化paxillin，与组成型活性Shp2相似，表明其保留了完整的活性。无活性的RapR-Shp2与显性负性Shp2表现出相似的磷酸化paxillin水平，表明在失活状态下无活性。

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科研

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Biology

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雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的开发与应用

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