Name: 结构引导设计与开发新型环孢蛋白A抑制剂及调性醇-F衍生物：一种 硅内 方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 了解基于结构引导设计的新型环孢蛋白A抑制剂开发方法，通过分子对接与动力学模拟评估配体-受体结合稳定性。该方法整合AutoDock与Gromacs工具，为抗肿瘤药物研发提供计算支持。

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作者无利益冲突。

一种名为SFA或1nmk分子受体的新型免疫抑制天然物质从Streptomyces中提取出来。采用分子对接分析方法，确定了所构建配体与靶标蛋白之间的结合能。结果表明，在所有设计的配体中，SFA在结构上不同于CsA，并对Cyp A16表现出较强的亲和力。Cyp A具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性，通过与其外部受体CD147结合16，调控多种细胞过程。本研究计算了配体对新型Cyp A抑制剂及SFA 1nmk受体的亲和电荷。AutoDock 4.2.6的早期应用集中在分析蛋白质与核酸复合物的结合机制及催化特性。
尽管 AutoDock 4.2.6 软件的准确率约为 68%37该软件被认为是预测配体与蛋白质结合构象的理想工具。其性能已得到提升，且高速计算机和计算机集群的可及性增加，使得更大规模的筛选试验成为可能，从而能够将整个药物分子库针对制药行业相关靶点进行筛选。38,</s...

亲环素A是人源Cyp A的强效抑制剂。亲环素是一类不会损害免疫系统、具有更优药理学特性并能降低转运体抑制作用的强效抑制剂。亲环素蛋白家族具有肽基-脯氨酰异构酶活性，其过表达与不良预后相关1。已有报道表明，亲环素在多种癌症中过表达，包括肝细胞癌。在肝细胞癌（HCC）中，亲环素对肿瘤耐药性和增殖均起着关键作用2。通过采用原子水平的分子对接和分子动力学模拟，确定DC838与Cyp A的精确结合位点，该抑制作用为基于喹喔啉衍生物的新免疫抑制剂的发现提供了重要信息3。
此外，体内研究表明，环孢素结合蛋白DC838可抑制刀豆蛋白诱导的小鼠脾细胞增殖。已有多个研究报道了一系列基于天然物质Sanglifehrin A（SFA）合成的大环类环孢素结合蛋白抑制剂4。初步的化合物优化发现，Sanglifehrin核心结构中m5酪氨酸残基的羟基、C14和C15位的立体中心，以及缬氨酸5m5酪氨酸5哌嗪酸三肽是影响化合物活性的关键因素5。SFA中的C185C21二烯单元可被苯乙烯基团取代，从而获得具有新型结合模式的高活性化合物，其中苯乙烯部分通过堆积作用与Cyp A的精氨酸（Arg）55发生相互作用6。非免疫抑制性环孢素结合蛋白抑制剂在治疗丙型肝炎病毒方面具有疗效。环孢素A1、阿利孢罗韦（alisporivir）以及大多数其他环孢素类化合物均为MRP2、MDR1、OATP1B1及其他重要药物转运体的强效抑制剂7,8。
另一方面，从Ganoderma leucocontextum中纯化的灵芝醇F通过抑制CDK4/CDK69周期蛋白以及依赖周期蛋白的激酶（CDKs）来延缓细胞周期进程，而CDKs在调控哺乳动物细胞周期中起着关键作用。Cyclin D-CDK4/CDK6和Cyclin E-CDK2是灵芝醇F调控细胞周期进程的关键因子。因此，灵芝醇F可作为潜在的CDK4/CDK6抑制剂用于乳腺癌的治疗10,11。FA抑制细胞周期的G1期，从而在不影响细胞活力的情况下阻止M-CSF依赖性巨噬细胞的生长12。该免疫抑制剂通过失活CDK2的活性来抑制细胞增殖。在癌症背景下，Cyclin D-CDK4/6以及其他周期蛋白和CDKs的作用已得到充分证实。癌症的特征之一是周期蛋白-CDK通路的异常失调。具体而言，当细胞准备启动DNA合成时，CDK4在D型周期蛋白的协同下介导细胞通过G1期。这一过程与癌症的发生和发展密切相关9。
Cyp A 的活性位点以不变的催化性精氨酸（Arg55）为特征，并包含一组高度保守的疏水性、芳香性和极性残基，例如 Arg55、谷氨酰胺（Gln）、甘氨酸（Gly）和苏氨酸（Thr）1,13,14。亲环蛋白家族的活性位点还包括丙氨酸（Ala）和天冬酰胺（Asn）1。与此同时，SFA 的活性位点由氨基酸 Arg5515、Gln、Gly、Thr、Ala 和 Asn 组成，这些氨基酸形成一个疏水性口袋，包裹着 SFA 的哌嗪酸部分。与未结合配体的 Cyp A 相比，SFA 中大环与自旋双环之间的连接链迫使 Trp121 重新调整其侧链构象16。
根据先前的研究，选择1nmk作为伐环素A（Sanglifehrin A）的特定PDB编码17。伐环素A（SFA）是一种免疫抑制性天然物质，最初在链霉菌（Streptomyces sp.）A92-3081中被发现5,18。SFA对亲环素A（Cyp A）具有高亲和力，其结构与环孢素A（CsA）明显不同，并通过独特机制抑制免疫系统。SFA复杂的分子结构包含一个22元大环，在23位上连接一个九碳链，末端为高度取代的螺双环结构单元。体外研究表明，在纤维化的人肺成纤维细胞及特发性肺纤维化患者样本中，SFA可增加亲环素B的生成，并抑制I型胶原的分泌19,20。总体而言，共使用了20种不同的伐环素来分离SFA（C16）。在无细胞竞争性结合实验中，其对亲环素的亲和力约为SFA家族其他成员的60倍15。例如，SFA显著减少树突状细胞释放的生物活性IL-12p70（IL-12的主要来源），从而抑制树突状细胞的活性。该研究提示，SFA是一种具有潜力的新型免疫抑制药物1。
在此方案中，使用新型配体结构生成了Ganoderiol F/Cyp A的复合物 计算机模拟 使用Chemsketch软件进行方法处理，然后通过兼容软件转换为PDB文件。蛋白质-配体结合构象在药物发现与设计过程中是一个重要问题。21,22配体-受体相互作用使用 AutoDock 4.2.6 软件进行分子对接。计算对接系统通常会生成多个潜在的蛋白质-配体复合物构象。可选择一个或少数几个与 1nmk 受体结合能最低的候选结构进入药物设计的下一阶段，以确保有效性 计算机模拟 药物设计试验中，使用Chimera软件鉴定最优的氢键结合配体。最后，对配体-受体复合物进行分子动力学（MD）模拟以评估其稳定性。该方法在以下方案中详细描述。

<table><tbody><tr><td>Autodock&amp;nbsp;</td><td>Autodock&amp;nbsp;</td><td>v4.2.6</td><td>http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/</td></tr><tr><td>CGenFF</td><td>CGenFF</td><td>v2024</td><td>https://cgenff.umaryland.edu</td></tr><tr><td>Chemsketch&amp;nbsp;</td><td>Chemsketch&amp;nbsp;</td><td>v2024</td><td>http://www.acdlabs.com/resources/freeware/</td></tr><tr><td>Cygwin终端&amp;nbsp;</td><td>Cygwin终端&amp;nbsp;</td><td>v3.6.3</td><td>http://www.cygwin.com/</td></tr><tr><td>Gromacs教程</td><td>Gromacs教程</td><td>v25.04 (Plucky Puffin)</td><td>http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html</td></tr><tr><td>MGL工具&amp;nbsp;</td><td>MGL工具&amp;nbsp;</td><td>v1.5.7</td><td>mgl tools 1.5.6 rc3</td></tr><tr><td>Open Babel</td><td>Open Babel</td><td>v3.1.1</td><td>http://openbabel.org/wiki/main_page</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>PyMOL</td><td>v3.1.6.1</td><td>PyMOL | pymol.org</td></tr><tr><td>Ubuntu</td><td>Ubuntu</td><td>v25.04l</td><td>https://ubuntu.com/download/desktop</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF Chimera</td><td>v1.19</td><td>chimera-1.17.3-win64.exe</td></tr></tbody></table>

基于结构指导的新型亲环素a抑制剂与灵芝醇-f衍生物的设计与开发：一种计算机模拟方法

Structure-Guided Design and Development of Novel Cyclophilin A Inhibitors and Ganoderiol-F Derivatives: An In-Silico Approach

Cyclin Ds-CDKs 轴（亲环素 A（Cyp/灵芝醇 F））通过调控增殖和抑制癌细胞等多种过程在癌症中发挥关键作用。灵芝醇 F 衍生物可作为多种癌症类型的致癌靶点。本研究证明，基于结构设计和开发新型 Cyp A 抑制剂及灵芝醇 F 衍生物可用于选择计算位置，以提高化学抑制剂的有效性及其与选定受体的相互作用。为此，采用了多种软件程序以实现最佳分子相互作用。总体而言，使用 Chemsketch 软件构建了 117 种新型亲环素抑制剂配体分子。将新型 Cyp A 抑制剂配体转换为 PDB 文件格式，用于导入 Sanglifehrin A 酶受体。采用 AutoDock 4.2.6 软件进行配体-蛋白对接相互作用，以揭示最佳的几何构型匹配。对接结果通过 PyMOL 2.5 软件进行确认。最后，使用 Chimera 和 Maestro 软件检测氢键。所选配体-受体对接复合物进一步进行分子动力学模拟。分子动力学（MD）模拟结果表明该复合物具有良好的稳定性，提示所选配体可用作癌细胞的药物抑制剂。结果中，结合位点内的活性氨基酸被鉴定为精氨酸 55（运动幅度为 1.53 Å）、天冬酰胺（Asn）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、赖氨酸（Lys）、异亮氨酸（Iso）、组氨酸（Hid）、苯丙氨酸（Phe）和半胱氨酸（Cys），其中氢键数量最多的配体为 45-羟基芒果酸，其与 1nmk 受体在格点盒坐标 X 38.86、Y 10.987、Z 40.734 处结合。在 Gromacs 软件中采用 CHARMM 36 力场对 1nmk 受体-配体复合物进行分子动力学（MD）模拟评估，结果显示其具有最优的构象稳定性。

如引言中所述，体内和体外研究表明，环孢素抑制剂在简化桑格灵菌素结构方面具有重要作用，从而通过干扰小鼠细胞周期抑制小鼠脾脏细胞增殖5。此外，环孢素A与灵芝醇F衍生物一起，通过其PPIASE活性在蛋白质折叠、免疫应答和细胞信号传导中发挥关键作用。其在多种癌症中的上调表达提示其可能作为治疗性靶点的潜力2,25。了解配体-受体相互作用对于认识特定疾病并开发更有效的药物至关重要。实现这一层次的细节需要快速且改进的分子可视化技术26,27。计算分子对接技术被用于配体研究，以预测小分子（如配体）与受体的结合方式。AutoDock 4.2.6软件使研究人员能够控制两个生物分子的对接，使其进入结合位点。当结合位点已知时，该方法尤为有用，并被认为适用于基于结构的药物设计（SBDD）。SBDD可在药物（配体）设计过程中整合专业知识与直觉判断<s...

本文介绍了一种基于结构指导的蛋白-配体结合相互作用设计方法，该相互作用涉及 Sanglifehrin A 与亲环素 A/灵芝醇-F，对于新药发现至关重要。通过分子动力学模拟评估了配体-受体复合物的稳定性。

基于结构指导的新型亲环素A抑制剂与灵芝醇-F衍生物的设计与开发：一种计算机模拟方法

细胞周期蛋白D-CDK轴（亲环素A（Cyp/灵芝醇F））通过调控增殖等多种过程在癌症中发挥关键作用……

本研究旨在设计新型的亲环素A抑制剂，并通过靶向亲环素A-CDK轴发挥抗增殖作用，从而抑制癌细胞增殖。关键挑战包括实现配体-受体之间最佳的几何相互作用，以及在动态的实验和生理条件下维持稳定的配体-蛋白复合物。首先，打开1NMK文件。在第55位点找到氨基酸精氨酸，记录AutoDock界面中的X、Y和Z坐标。打开“文件”菜单，选择“读取分子”，选中文件1NMK并点击“打开”。通过选择“编辑”，点击“氢原子”，然后点击“添加”来添加氢原子。然后选择“仅极性”，并点击“确定”确认。接着再次进入“编辑”菜单，选择“原子”，并指定AD4原子类型。接下来，选择“电荷”，并选择Kollman电荷。通过选择“文件”，点击“保存”，设置文件类型并确认保存位置，将准备好的受体保存为 1NMK.pdbqt。接下来，打开“配体”菜单，选择“输入”。单击“打开”，选择PDB文件，然后再次单击“打开”。当信息窗口出现时，查看配体详细信息。为检测配体根节点，选择“配体”，然后选择“扭转树”，并单击“检测根节点”。通过选择配体，点击输出，然后选择“另存为 PDBQT”来保存配体。通过选择网格，点击大分子，选择 1NMK，然后点击分子来准备受体网格。确认警告信息，并将文件保存为 1NMK.pdbqt。设置图谱类型时，选择“Grid”，然后选择“Set Map Types”，再选择“Ligand”。选择“Ligand”后，再次点击“Ligand”。随后通过选择“Grid”、点击“Grid Box”并点击“Center”来定义网格盒的中心。然后选择一个原子并输入网格框的坐标。将网格参数保存为 GPF 文件。通过选择“对接”，然后选择“大分子”和“设置刚性文件名”来配置对接。导航至所需文件夹，点击 1NMK.pdbqt. 以打开该文件，选择对接（Docking），选择输出（Output），点击 Lamarckian GA，将对接参数文件保存为 1NMK.dpf。在 Cygwin 终端中，输入 cd C: 并按回车；然后输入 cd project 并再次按回车。接下来，输入 cd molecules，然后按回车键。接着输入 cd 3，然后按回车键。输入 AutoGrid 命令以生成网格图，然后按回车键执行 AutoGrid。运行完成后，输入命令“tail -f 1NMK.glg”并按回车键以查看日志进度；输入分子对接模拟的命令，生成对接日志文件，然后按回车键启动 AutoDock。然后，输入“tail f 1NMK.dlg”并按回车键以监控对接过程。在生成所有 DLG 文件后，进入文件夹 1，在 WordPad 中打开 DLG 文件，按下 Ctrl+F。输入搜索关键词，然后按三次回车键以进入 RMSD 表格。从 RMSD 表格中复制每种分子的结合能及对应的运行信息，将排名前 20 的分子整理到电子表格中，电子表格的列标题分别为序号、最低结合能和运行编号。在 Cygwin“终端中，导航至项目目录下的特定分子文件夹。输入命令以从 DLG 中提取对接配体的坐标并修剪数据。再次按回车键以完成操作，确认生成 1NMK run PDBQT 文件。验证 1NMK run PDB 文件是否已在同一文件夹中创建。接下来，从桌面打开 PyMOL 2.5 软件和 AutoDock，打开受体文件以选择受体结构进行可视化。打开所选分子对应的配体构型文件，并在 3D 工作区中显示已加载的配体。从菜单中选择“隐藏所有内容”，将文件导入 Maestro 以可视化结构，然后点击“配体相互作用”以获得配体相互作用图。从桌面打开 UCSF Chimera 软件。依次选择 文件，然后选择 打开。浏览至 C 盘、project 文件夹和 molecules 文件夹。选择文件 1NMK.pdb 并点击打开。在菜单中选择“残基”，然后选择“UNL 缩放”，以聚焦于 UNL 残基区域。选择区域，然后按“确定”以确认。接下来，选择操作。选择“标签”，然后选择“残基”并选择“名称加说明符”来标记残基。打开“工具”，选择“结构分析”，然后点击“FindHBond”。在默认的“FindHBond”设置窗口中，勾选“对不符合精确标准的氢键进行着色”和“仅查找选定部分之间的氢键”。清除区域选择以开始新的分析。然后选择区域参数并放大分子显示，观察代表氢键的蓝色和橙色线条。最后，检查可视化结构并统计可见氢键的总数。使用 PyMOL 2.5 可视化了配体-受体复合物的对接结果，显示 109 个羟基己基羟乙基结合在 1NMK 受体的活性口袋内。4-羟基扁桃酸配体与 1NMK 受体形成氢键，特别是与精氨酸 55 在 1.53 埃的距离上相互作用。二维结构分析展示了配体通过氢键相互作用的氨基酸残基。分子动力学模拟通过分析1000皮秒内的回转半径，证实了配体-受体复合物的稳定性。RMSD曲线显示，在模拟1纳秒后，该复合物达到持续稳定状态，表明蛋白质-配体结合稳定。系统的平均密度约为1019千克/立方米，符合NVT条件下的平衡状态，且在100皮秒的NPT平衡过程中系统压力保持稳定。在NVT阶段，温度稳定在约300开尔文，表明热平衡已成功达到。模拟结束后对配体-蛋白质复合物的轨迹框进行了可视化，展示了围绕对接复合物的水分子分布情况。目前很少有研究将gan-it-rol抗增殖作用作为致癌治疗靶点进行探讨。本方案通过分子对接和动力学分析设计并验证抑制剂，以解决上述空白。我们的方案将多种计算工具整合为统一的工作流程，确保对配体-蛋白质或受体进行全面分析。我们未来的研究将聚焦于在体外和体内验证这些抑制剂，并探索亲环素A抑制剂在多种癌细胞类型中的更广泛应用。

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