利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

在软骨组织工程与再生医学领域，仍需进一步改善生物学和功能学效果，以优化现有治疗方案并开发新的治疗策略。目前的临床前研究显示，来源于软骨的软骨祖细胞在促进软骨修复方面具有潜在应用价值。当前的研究包括利用额外的生长因子和基因重组技术，进一步增强其软骨形成潜能，同时维持较低的肥大化倾向。

软骨祖细胞面临诸多实验挑战，包括命名缺乏共识、分离技术多样、鉴定困难、培养条件差异大以及对潜在机制的理解有限。在临床上若能证明软骨祖细胞相较于常用细胞可产生更优疗效，则有望显著减轻全球范围内与软骨相关疾病带来的负担。通过采用无细胞替代策略（例如来源于祖细胞的细胞外囊泡）以及重组技术，有望推动真正类透明软骨的再生，从而促进治疗手段的进一步发展。

首先，在无菌条件下，用 1X PBS 从人源供体获取胫股关节或膝关节，然后将收获的关节转移至生物安全柜内的无菌垫上。为稳定关节，用手握住软骨下骨，使软骨面朝上。使用 22 号手术刀片，从非负重区域切取矩形软骨碎片。

从浅层至深层将软骨切成8毫米×10毫米的组织片。用PBS洗涤组织片后，将其置于含有1至2毫升普通达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）的培养皿中。接着，使用22号手术刀片将软骨组织切碎至体积小于1立方毫米。

首先，从切除的人膝关节中获取切碎的软骨组织。将切碎的软骨放入含有10毫升无血清DMEM/F-12培养基的直立T25培养瓶中，培养基中加入0.15% II型胶原酶，用于酶消化。将培养瓶静置于二氧化碳培养箱中，孵育12至14小时。

过夜消化后，将含有释放出的软骨细胞的培养基转移至新的无菌离心管中。使用细胞滤网将细胞与碎片分离。加入等体积的含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12培养基。

在37摄氏度下，以1,200 G离心过滤后的细胞5分钟。弃去上清液后，用1毫升培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝排斥法计数活细胞。

接下来，将软骨细胞以每平方厘米10,000个细胞的浓度接种至T25培养瓶中。使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12培养基将细胞扩增至所需的传代次数。在细胞达到亚汇合状态前，每三天更换一次培养基，然后使用含EDTA的0.125%胰蛋白酶消化收集细胞。

软骨细胞在接种后迅速贴壁，并随着细胞扩展，形态由圆形的鹅卵石状逐渐转变为成纤维细胞样外观。首先，从切除的人体胫股关节或膝关节获取软骨碎屑。将软骨碎屑进行连续的过夜酶消化处理：先在37摄氏度的摇床水浴中用0.2%蛋白酶消化3小时，随后用0.04% II型胶原酶在37摄氏度的摇床水浴中消化12小时。

然后，用1.5毫升PBS纤维连接蛋白溶液包被六孔板中所需数量的孔。密封板后，在4°C下冷藏过夜。次日，从冰箱中取出已包被纤维连接蛋白的六孔板。

去除多余的纤连蛋白后，向包被的孔中加入两到三毫升无血清的DMEM/F-12培养基。将释放的软骨细胞以每孔4,000个细胞的密度接种至包被的孔中，并将培养板静置20分钟。孵育后，吸除多余的培养基和未贴壁的细胞。

向孔中加入 2 至 3 毫升含 10% 胎牛血清的 DMEM/F-12 培养基。将贴壁细胞在标准培养条件下维持 10 至 12 天，以获得软骨形成祖细胞（chondrogenic progenitor cell，CPC）克隆，然后使用 0.125% 胰蛋白酶 EDTA 处理 180 秒分离 CPC 克隆，再以每 5 平方厘米接种一个克隆的比例重新接种。将富集后的多克隆 CPC 扩增至所需的汇合度。

在进行纤维连接蛋白黏附实验时，软骨细胞表现出克隆性生长，到第10天时群体倍增数达到5次。首先，从收获的关节中获取置于添加补充物的DMEM/F-12培养基中的去毛软骨外植体。将含有外植体的培养板放入二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育48小时。

两天后，将外植块转移至含有10毫升0.1%胶原酶溶液的离心管中进行酶消化。将离心管在37°C下孵育2小时。消化完成后，用1×PBS冲洗外植块，并将其返回至含有新鲜添加物的DMEM/F-12培养基的同一孔板中。

将培养板置于标准培养条件下孵育，并在随后几天内监测软骨祖细胞的迁移情况。当组织块达到亚汇合状态时，使用 0.125% 胰蛋白酶 EDTA 溶液收集间充质软骨祖细胞（MCPs）。使用添加补充物的 DMEM/F-12 培养基扩增 MCPs。

到培养第10天，软骨祖细胞开始从外植体边缘迁移，呈现纺锤形生长模式，并进一步扩展。