Name: 改良四支血管闭塞诱导的脑缺血性昏迷模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: 了解改良四支血管闭塞技术诱导大鼠脑缺血性昏迷模型的方法。该技术通过电凝椎动脉和暂时阻断颈总动脉，有效减少继发性创伤，为研究缺血性昏迷病理机制及开发新药物提供可靠的实验模型。

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本工作得到国家自然科学基金（82173781 和 82373835）、博士后科研项目（BKS212055）、佛山市科技局科技创新项目（2320001007331）、广东省基础与应用基础研究基金（2019A1515010806）、广东省普通高校重点领域项目（智能制造）（2020ZDZX2057）以及广东省普通高校科学研究项目（特色创新）（2019KTSCX195）的资助。

实验方案严格遵循佛山科学技术学院实验动物使用与管理伦理委员会的要求（记录编号：2023-643656）。本研究选用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重200 g ± 20 g，6-8周龄）。所有动物实验数据均按照ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南撰写。研究中所用试剂与设备的详细信息见《材料表》。
1. 脑电图电极的植入
<ol>
	<li>在麻醉前15分钟，皮下注射0.05 mg/kg的阿托品，以预防分泌物引起的呼吸道阻塞和窒息。通过肌肉注射给予20 mg/kg的唑拉西泮和5 mg/kg的赛拉嗪以麻醉大鼠14。使用镊子夹住大鼠脚趾以确认深度麻醉状态。</li>
	<li>使用剃毛器去除大鼠头部的毛发。使用非穿透性耳杆将大鼠头部固定于脑立体定位仪上。用无菌棉球以乙醇和聚维酮碘对术区皮肤进行三次消毒。</li>
	<li>使用手术刀沿矢状缝切开大鼠头部皮肤。剥离覆盖颅骨的肌肉组织，充分暴露颅骨。在整个过程中使用无菌棉签控制出血。</li>
	<li>使用洗耳球吹干颅骨表面，以利于牙科水泥牢固粘附。用黑色记号笔标记颅钉（直径1.2 mm，长度3 mm）的安装位置（图1，步骤1），具体位置包括前囟点及另外四个位点。</li>
	<li>使用10 mL注射器针头依次旋转钻孔四个区域，并依次将四枚颅钉植入颅骨，确保其与大脑皮层接触（图1，步骤2-3）。 
	注意：若出现出血，使用无菌棉签吸除血液，以防骨钉生锈。</li>
	<li>将脑电图电极的银丝缠绕在颅钉上。将肌电图电极植入肌肉组织中，并用6-0缝线固定。</li>
	<li>将义齿基托树脂与自凝义齿粉混合，将电极固定于颅骨上。使用洗耳球向牙科水泥表面吹气，以加速固化。</li>
	<li>注射10,000单位青霉素以预防感染。将每只大鼠单独饲养，防止相互撕咬导致电极损坏。连续三天每日皮下注射0.2 mg/kg美洛昔康，以缓解术后疼痛。给予3天恢复期，使大鼠伤口愈合并确保电极稳固固定（图1，步骤4）。</li>
</ol>
2. 脑缺血昏迷模型的手术过程
<ol>
	<li>三天后，重新麻醉大鼠并使其仰卧。使用无菌棉球&#160;通过碘伏重复消毒手术部位三次，随后进行酒精消毒&#160;酒精冲洗/擦拭。用手术刀从胸骨上缘沿颈部中线纵向切开约2-3厘米长的切口（图1，步骤5）。</li>
	<li>钝性分离皮下组织和胸骨舌骨肌，充分暴露气管以及气管两侧的颈长肌15. 
	注意：在整个操作过程中应避免刺激气管。</li>
	<li>钝性分离甲状腺水平以下的颈长肌，暴露第一和第二颈椎。使用大鼠组织扩张器扩大颈部区域，充分暴露手术部位。</li>
	<li>使用精细镊子仔细分离颈椎椎间隙中可见的肌肉和组织，暴露椎动脉进入第一颈椎的特征性位置。可观察到椎动脉穿过第一颈椎（图1，步骤6）。 
	注意：在颈部下方放置一支1 mL注射器可提供更清晰的手术操作空间。</li>
	<li>预热电凝笔，插入目标区域3-5秒，确保椎动脉被电凝并切断。沿胸锁乳突肌内侧缘分离肌肉和筋膜，暴露并游离双侧颈总动脉，打松结备用。 
	注意：电凝笔必须预先加热，否则无法快速凝固椎动脉，导致出血。需对两侧椎动脉进行电凝，并在颈总动脉（CCA）周围打松结。</li>
	<li>当大鼠恢复意识并出现肢体抽搐，且脑电图检测器检测到活跃的脑电图和肌电图信号时，迅速扎紧第一个松结以阻断颈总动脉（CCA）血流。大鼠将挣扎数秒，随后逐渐失去意识。图1，步骤7）。</li>
	<li>固定解除后，观察到大鼠四肢僵硬，翻正反射消失，但呼吸仍维持。此时肌电图（EMG）呈直线，脑电图（EEG）迅速受到抑制，表明4-VO诱导的脑缺血模型建立成功。16. 
	注意：部分大鼠在双侧颈总动脉结扎期间会出现呼吸抑制。快速机械刺激可使部分大鼠恢复自主呼吸。</li>
	<li>根据 &#34;针控结扎法16,&#34; 用6-0尼龙线在颈总动脉（CCA）分叉处（即颈内动脉ICA和颈外动脉ECA分叉点）约1.5 cm处，以直径0.5 mm的注射器针头为模具结扎CCA。小心抽出针头；此第二结将导致颈总动脉狭窄。图1，步骤8）。 
	注意：用于颈总动脉狭窄的结扎线必须由稳定的尼龙材料制成。尼龙线不受血液影响，不会发生肿胀；否则可能导致大鼠颈总动脉严重狭窄，并增加死亡率。</li>
	<li>缺血30分钟后，松开第一个结扎线，颈总动脉（CCA）将恢复灌注，但第二个结扎线将导致CCA狭窄，从而诱导持续性昏迷（图1，步骤9）。使用可吸收单丝缝线缝合皮下组织，使用不可吸收单丝缝线缝合皮肤。</li>
</ol>
3. 动物恢复
<ol>
	<li>将大鼠置于绝缘垫上，并注射 10,000 单位青霉素以预防感染。&#160;皮下注射&#160;0.2 mg/kg 梅洛昔康，连续三天，以缓解术后疼痛。</li>
	<li>再灌注 60 分钟后，确保大鼠逐渐恢复。</li>
</ol>

Single-Step Surgery for Inducing Cerebral Ischemic Coma in Rats

<ol><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodiola+crenulata+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+by+maintaining+BBB+integrity+and+balancing+energy+metabolism+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction.</a> Phytomedicine. 128, 155529(2024).</li>
<li>Rong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+model+preparation+for+middle+cerebral+artery+occlusion+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A modified model preparation for middle cerebral artery occlusion reperfusion.</a> J Vis Exp. (207), e67060(2024).</li>
<li>Hoesch, R. E., Koenig, M. A., Geocadin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coma+after+global+ischemic+brain+injury%3A+Pathophysiology+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Clin%22%5BJournal%5D)">Coma after global ischemic brain injury: Pathophysiology and emerging therapies.</a> Crit Care Clin. 24 (1), 25-44 (2008).</li>
<li>You, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude-integrated+electroencephalography+predicts+outcome+in+patients+with+coma+after+acute+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosc+Bull%22%5BJournal%5D)">Amplitude-integrated electroencephalography predicts outcome in patients with coma after acute brain injury.</a> Neurosc Bull. 34 (4), 639-646 (2018).</li>
<li>He, F., Jiang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+naloxone+treatment+on+opioidinduced+side+effects+A+meta-analysis+of+randomized+and+controlled+trails%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28United+States%29%22%5BJournal%5D)">The effect of naloxone treatment on opioidinduced side effects A meta-analysis of randomized and controlled trails.</a> Medicine (United States). 95 (37), e4729(2016).</li>
<li>Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+coma+and+coma+arousal+therapy+in+Caraka+Sahit%C4%81+and+its+corollary+in+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+India%22%5BJournal%5D)">Description of coma and coma arousal therapy in Caraka Sahitā and its corollary in modern medicine.</a> Neurol India. 65 (2), 250-252 (2017).</li>
<li>Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+options+to+enhance+coma+arousal+after+traumatic+brain+injury%3A+State+of+the+art+of+current+treatments+to+improve+coma+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Therapeutic options to enhance coma arousal after traumatic brain injury: State of the art of current treatments to improve coma recovery.</a> Brit J Neurosurg. 28 (2), 187-198 (2014).</li>
<li>Li, J., Cheng, Q., Liu, F. K., Huang, Z., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+stimulation+to+improve+arousal+in+comatose+patients+after+traumatic+brain+injury%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensory stimulation to improve arousal in comatose patients after traumatic brain injury: a systematic review of the literature.</a> Neurol Sci. 41 (9), 2367-2376 (2020).</li>
<li>Pulsinelli, W. A., Levy, D. E., Duffy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+blood+flow+in+the+four-vessel+occlusion+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral blood flow in the four-vessel occlusion rat model.</a> Stroke. 14 (5), 832-834 (1983).</li>
<li>Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+bilateral+hemispheric+ischemia+in+the+unanesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.</a> Stroke. 10 (3), 267-272 (1979).</li>
<li>Plaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronounced+arterial+collateralization+was+induced+after+permanent+rat+cerebral+four-vessel+occlusion.+Relation+to+neuropathology+and+capillary+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Pronounced arterial collateralization was induced after permanent rat cerebral four-vessel occlusion. Relation to neuropathology and capillary ultrastructure.</a> J Neural Transm. 110 (7), 719-732 (2003).</li>
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<li>Song, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H-pyrrole-2%2C5-dione-based+small+molecule-induced+generation+of+mesenchymal+stem+cell-derived+functional+endothelial+cells+that+facilitate+rapid+endothelialization+after+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">1H-pyrrole-2,5-dione-based small molecule-induced generation of mesenchymal stem cell-derived functional endothelial cells that facilitate rapid endothelialization after vascular injury.</a> Stem Cell Res Ther. 6 (1), 174(2015).</li>
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<li>Konaka, K., Miyashita, K., Ishibashi-Ueda, H., Naritomi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hyperthermia+caused+by+four-vessel+occlusion+of+main+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Internal+Med%22%5BJournal%5D)">Severe hyperthermia caused by four-vessel occlusion of main cerebral arteries.</a> Internal Med. 48 (24), 2137-2140 (2009).</li>
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<li>Li, J., Takeda, Y., Hirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+of+ischemic+depolarization+for+neuronal+injury+following+four-vessel+occlusion+in+the+rat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Anesthesiol%22%5BJournal%5D)">Threshold of ischemic depolarization for neuronal injury following four-vessel occlusion in the rat cortex.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 12 (3), 247-254 (2000).</li>
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<li>Oruc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antioxidant+and+antiapoptotic+effects+of+crocin+pretreatment+on+global+cerebral+ischemia+reperfusion+injury+induced+by+four+vessels+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The antioxidant and antiapoptotic effects of crocin pretreatment on global cerebral ischemia reperfusion injury induced by four vessels occlusion in rats.</a> Life Sci. 154, 79-86 (2016).</li>
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<li>Idt-Kastner, R. S., Paschen, W., Ophoff, B. G., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+four-vessel+occlusion+model+for+inducing+incomplete+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20 (7), 938-946 (1989).</li>
<li>McBean, D. E., Kelly, P. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+global+cerebral+ischemia%3A+A+comparison+of+two-vessel+occlusion+and+four-vessel+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rodent models of global cerebral ischemia: A comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion.</a> Gen Pharmacol. 30 (4), 431-434 (1998).</li>
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<li>Toda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reproducible+rat+model+of+reversible+forebrain+ischemia+-+Modified+four-vessel+occlusion+model+and+its+metabolic+feature%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia - Modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature.</a> Acta Neurochir (Wien). 144 (12), 1297-1304 (2002).</li>
<li>Ma, R., Lu, D., Wang, J., Xie, Q., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+pharmacological+activity+and+safety+of+different+stereochemical+configurations+of+borneol%3A+L-borneol%2C+D-borneol%2C+and+synthetic+borneol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Comparison of pharmacological activity and safety of different stereochemical configurations of borneol: L-borneol, D-borneol, and synthetic borneol.</a> Biomed Pharmacother. 164, 114668(2023).</li>
<li>Ji, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+targets+for+protecting+against+hippocampal+cell+apoptosis+after+transient+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Potential targets for protecting against hippocampal cell apoptosis after transient cerebral ischemia-reperfusion injury in aged rats.</a> Neural Regen Res. 9 (11), 1122-1128 (2014).</li>
<li>Martínez-Alonso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+association+of+4E-BP2-interacting+proteins+is+related+to+selective+delayed+neuronal+death+after+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential association of 4E-BP2-interacting proteins is related to selective delayed neuronal death after ischemia.</a> Int J Mol Sci. 22 (19), 10327(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

四血管阻塞可诱导全脑缺血和缺氧性脑损伤，能够模拟临床上由脑缺血引起的急性昏迷、心脏骤停、窒息、休克、严重心律失常等危重临床状况。同时，四血管阻塞主要导致海马区损伤17,18，而海马是负责认知记忆功能的主要脑区19,20,21。因此，四血管阻塞也可用于模拟血管性痴呆模型22,23。综上所述，四血管阻塞诱导的全脑缺血模型已被广泛用于模拟上述临床疾病。
1979年，Pulsinelli等人10通过阻断双侧颈总动脉和双侧椎动脉，实现了全脑缺血与再灌注。自此以后，该模型逐渐成为国际公认的全脑缺血模型的经典制备方法24,25,26。然而，该方法存在一些问题，例如第一颈椎横突及其横突孔存在个体差异，包括孔径较小、形态不规则以及孔道弯曲等，导致电凝不完全。此外，长时间电凝或电流过大可能对延髓和脊髓造成损伤风险。椎动脉电凝不充分还可能导致明显出血等其他问题15,16,27。
因此，学者们不断改进方法，以确保椎动脉电凝的完整性并降低模型的变异性28,29。由于经椎间孔电凝椎动脉无法直视，Todd 等人30通过磨开寰椎孔，完全暴露椎动脉并在直视下进行烧灼，从而提高了电凝的准确性。然而，该手术方法侵入性较高，可能损伤颈椎。翼突孔壁较薄，容易损伤椎动脉，导致大出血，因而死亡率相对较高。Sugio 等人12通过将电凝针插入第二颈椎左右椎间孔，实现了对椎动脉的可视化并将其永久切断。Toda 等人31和 Lu 等人27则基于该解剖结构，在寰椎关节外侧第一和第二横突之间暴露椎动脉，并实施电凝。这些研究者通过在颈部后方暴露椎动脉并进行电凝，解决了因椎动脉不可见而导致电凝操作不稳定的问题。
然而，同时在腹部和背部接受手术的大鼠感染风险仍然增加，因此一些学者尝试从颈部前方进行手术。孙伟等人15通过从颈前部暴露椎动脉、结扎或夹闭小动脉，并持续或间歇性夹闭颈总动脉（CCA），实现了全脑缺血-再灌注。该步骤要求操作精细，因为椎动脉结构细小，分离难度较大。此外，小型动脉夹难以准确夹闭椎动脉。如果分离不够清晰彻底，将导致夹闭或结扎不完全，无疑会增加模型的不稳定性。
本研究提供了一种简单且可行的椎动脉电凝方法。关键步骤不是分离椎动脉，而是定位椎动脉穿行并进入第一颈椎横突孔的位置。该位置是椎动脉的入口，具有弯曲的特征，便于初学者快速定位。将电凝笔预热后，插入该弯曲处，快速凝固椎动脉，持续3-5秒，以确保完全闭塞。椎动脉电凝与颈总动脉结扎在一次手术中完成，降低了感染风险并缩短了实验时间。
我们还发现，模型动物的死亡主要由负责脑部供血的四条血管完全阻塞所致，而与手术操作次数无关。然而，在一次手术中完成全部操作确实可以缩短实验周期。此外，该改良方法也可用于制备全脑缺血-再灌注模型。四血管阻塞诱导的脑缺血昏迷模型还可模拟传统医学中的&#34;闭锁综合征&#34;模型32。因此，本研究建立的模型也可为中医从业者提供参考。
既往文献16,33,34中，颈总动脉（CCA）狭窄结扎术是在缺血30分钟后进行的。然而，缺血30分钟后，部分大鼠因代偿作用出现轻度意识恢复，机械刺激可导致这些大鼠苏醒，从而导致昏迷模型失败。因此，在本研究中，我们在大鼠昏迷发生后立即进行CCA狭窄处理。此时昏迷深度较深，难以通过刺激使其苏醒，从而保证了模型的稳定性。在该处理过程中，CCA处于夹闭状态，狭窄操作不会影响血流。
此外，在大鼠颈部切口的操作中观察到，三个脊椎节段内的椎动脉可通过电凝或结扎方法阻断。然而，第一脊椎处存在椎动脉进入的特征性标志，因此非常适合采用电凝阻断。由于第二与第三脊椎之间以及第三与第四脊椎之间缺乏明显的解剖标志，更适合采用缝线结扎。但结扎存在结扎不充分的缺点。因此，本研究选择使用电凝法切断第一与第二脊椎之间的椎动脉。
此外，应注意该模型的成功与大鼠的体重密切相关。据报道，体重在180-200 g之间的大鼠更适用于诱导昏迷。本研究也发现，体重低于180 g的大鼠难以同时耐受四条血管的损伤，导致死亡率较高；相反，若体重超过220 g，大鼠会迅速苏醒，无法维持足够长时间的昏迷状态以达到模型标准。
此外，用于缩窄颈总动脉（CCA）的针孔直径是影响大鼠昏迷持续时间的另一个因素。研究表明，0.6 mm的针孔直径可诱导大鼠持续昏迷6–8小时，且存活率较高。0.45 mm的针孔直径会导致大鼠出现严重的动脉狭窄，致使重度损伤的大鼠无法恢复；而0.7 mm的针孔直径仅能引起1–3小时的昏迷，且个体差异显著16。
然而，在预实验中，直径为0.6 mm的针孔无法诱导昏迷超过60分钟，而直径为0.5 mm的针孔可诱导昏迷1-2小时。这与夏兵等人的研究结果存在差异，可能源于麻醉剂和造模方法的不同。未来需要进一步研究以阐明这些差异。
综上所述，本研究提出了一种简单、可行且适合初学者的四血管阻断方法，可为研究脑缺血性昏迷或全脑缺血的实践者提供有价值的参考。

缺血性脑损伤是临床实践中最常见的脑损伤，约占脑血管疾病病例的75%。缺血可导致严重的继发性脑损伤和疾病1,2，而昏迷是缺血缺氧性脑损伤引起的最严重症状，也是多种危重病症的最终通路3。昏迷是临床实践中一种危重且难以处理的严重病症4。昏迷持续时间越长，潜在危险越大。及时促醒是防止病情恶化和进展的首要目标。尽管纳洛酮注射液在促醒方面具有广泛的临床应用，但仍存在一些副作用5。因此，开发安全有效的促醒药物是一个亟待解决的重要问题。建立一种简便易行的脑缺血性昏迷模型，对于阐明缺血性昏迷的发病机制以及新药研发至关重要6,7,8。
本研究旨在介绍一种通过电凝双侧椎动脉（VA）和暂时性结扎双侧颈总动脉（CCA）来诱导全脑缺血性昏迷的模型，该模型操作简便，适合初学者使用。先前的方案涉及在第一次手术中暴露第一颈椎后方的双侧翼孔，并通过电灼翼孔以阻断双侧椎动脉；24小时后进行第二次手术，通过结扎双侧颈总动脉诱导完全性缺血性昏迷9,10,11,12。然而，由于解剖结构不可见，存在电凝不完全、出血、脑干及脊髓损伤的风险，且实验周期较长。因此，有必要解决上述问题。
本文介绍了一种改进的缺血性昏迷建模方法。主要操作步骤包括：在颈部前正中线做切口，在直视条件下进行双侧椎动脉的电凝切除，并在单次手术中短暂结扎双侧颈总动脉，以阻断全脑血供，导致脑电图（EEG）迅速抑制，从而诱发昏迷。该方法在再灌注后还可诱导短暂的持续性昏迷。该手术操作简便，易于掌握，对初学者友好，且可降低实验动物继发性创伤感染的风险，从而缩短实验周期。
该方案适用于研究由心脏骤停引起的全脑缺血性昏迷。同时，它也非常适合用于缺血性痴呆的研究，主要因为海马脑区对缺血极为敏感；因此，短暂性脑缺血可导致海马神经元的损伤甚至丢失13，进而引发认知功能障碍。因此，本方案可为从事脑缺血、缺血性昏迷及缺血性痴呆研究的科研人员提供参考。

<table><tbody><tr><td>16通道微纤维光电极阵列</td><td>Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>4-0外科缝合线</td><td>Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd.</td><td>B-104</td><td></td></tr><tr><td>6-0外科缝合线</td><td>Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.</td><td>JM1216-742417</td><td></td></tr><tr><td>脑电图电极</td><td>Kedou Brain machine Technology Co., LTD</td><td>KD-EEGEMG</td><td></td></tr><tr><td>电凝笔</td><td>CONPUVON Company</td><td>465</td><td></td></tr><tr><td>Lunion Stage自动睡眠分期系统</td><td>上海 lulian 智能科技有限公司</td><td>1336</td><td></td></tr><tr><td>微型手持式颅骨钻</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>87001</td><td></td></tr><tr><td>青霉素钠</td><td>成都科龙化工有限公司</td><td>17121709-2</td><td></td></tr><tr><td>SD大鼠</td><td>SPF (北京) 生物技术有限公司</td><td>180-220g</td><td></td></tr><tr><td>颅骨钉</td><td>GLOBALEBIO,LTD</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>68801</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50</td><td>Vic Trading (Shanghai) Co., LTD</td><td>BN 88SHA</td><td></td></tr></tbody></table>

改良四血管阻塞法诱导的脑缺血昏迷模型

Cerebral Ischemic Coma Model Induced by Modified Four-Vessel Occlusion

由脑缺血引起的昏迷是脑缺血最严重的并发症。四血管阻塞法可用于建立脑缺血性昏迷模型，服务于疾病研究和药物开发。然而，传统的四血管阻塞方法主要通过将电凝笔插入颈部后方第一颈椎两侧的翼状孔，对椎动脉进行电凝。该操作存在电凝不完全、出血以及损伤脑干和脊髓的风险。术后24小时，需对大鼠再次麻醉，并在颈部前方进行颈动脉结扎。两次手术使大鼠感染风险升高，且延长了实验周期。本研究中，在一次手术过程中采用颈前入路，定位椎动脉穿入第一颈椎的关键部位，在直视下对双侧椎动脉进行电灼，并分离双侧颈总动脉以预先置入松结。当大鼠四肢开始抽搐时，迅速结扎双侧颈总动脉，从而诱导缺血性昏迷。该方法可避免因两次手术带来的感染风险，操作简便且成功率高，为相关研究人员提供了有价值的参考。

由于电极植入引起的炎症及其他刺激，脑电图（EEG）可能不稳定，因此大鼠需要恢复3天。3天后脑电图和肌电图（EMG）正常的大鼠方可用于昏迷模型的制备。麻醉状态下，大鼠的脑电图和肌电图活动轻度受抑，但仍保持平稳。双侧椎动脉电凝阻断后，脑电图和肌电图活动无明显变化。约30分钟后，药物代谢完毕，大鼠逐渐恢复意识，脑电图和肌电图活动增强。当大鼠出现肢体抽动，且脑电图与肌电图信号活跃、不再呈直线时，迅速结扎颈总动脉（CCA）。此时，负责脑部供血的四条血管均被阻断，导致全脑缺血。脑电图和肌电图活动迅速受到抑制，几乎呈直线，大鼠不再挣扎，眼球呈现灰白色（图2A）。若大鼠无法进入昏迷状态，则表明模型制备失败。
30分钟后，释放颈总动脉（CCAs）的第一根结扎线以恢复灌注，但保留在颈总动脉前方的第二根结扎线仍维持较低的灌注水平，从而使大鼠持续处于昏迷状态约60分钟。随着机体逐渐代偿和血液灌注的恢复，大鼠逐渐苏醒（图2B）。大鼠苏醒后，脑电图（EEG）和肌电图（EMG）几乎完全恢复正常。
<img alt="用于诱导脑缺血性昏迷的电极植入和动脉结扎手术示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67161/67161fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：电凝椎动脉位置示意图。 步骤1-3概述了电极植入的操作流程，步骤4用于检测电极是否正常工作。步骤5-6详细描述了在颈部前方进行手术切口及双侧椎动脉（VAs）电凝的手术过程。黄色箭头和弧线标示了电凝操作的关键部位。使用丝线模拟椎动脉穿过脊柱的走行路径，以更清晰地显示电凝后椎动脉的典型位置。步骤7-9描述了结扎双侧颈总动脉（CCAs）以诱导昏迷的操作方案。所有操作均遵循动物使用指南。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67161/67161fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑电图、肌电图和均方根波形；睡眠图；CCA结扎；脑缺血；神经活动示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67161/67161fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：从昏迷到恢复期间的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）变化。（A） 大鼠脑缺血性昏迷期间的脑电图、肌电图及活动水平波形。B大鼠从昏迷到苏醒过程中脑电图（EEG）、肌电图（EMG）及活动水平的变化示意图。整个过程持续约90分钟。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67161/67161fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了采用改良的四血管阻塞法诱导脑缺血性昏迷模型的过程。

由脑缺血引起的昏迷是脑缺血最严重的并发症。四血管阻塞可建立脑缺血性昏迷模型……

本研究的目的是介绍一种由电凝椎动脉和暂时性凝固颈总动脉同时诱导的全球性缺血性昏迷模型，该模型操作简便且实用，对设备要求友好。我们提出并改进了现代缺血性昏迷的治疗方法。该操作简便易行，可减轻动物的紧张情绪，提高亲和性，并降低继发性创伤效应的风险。动物可缩短实验周期。我们的方案使神经系统能更快地获取全脑缺血性昏迷的相关信息，有助于病理机制的探索以及新药的研发。首先，将植入脑电图（EEG）电极的麻醉大鼠置于仰卧位。使用手术刀，从胸骨上缘沿颈部中线纵向做一条2至3厘米长的切口。然后，钝性分离皮下组织和胸骨舌骨肌，充分暴露气管以及气管两侧的颈长肌。从甲状腺水平向下钝性分离最长的颈长肌，暴露第一和第二颈椎。使用大鼠组织扩张器扩大颈部区域，以充分暴露手术部位。用精细镊子仔细分离颈椎椎间间隙中可见的肌肉和组织，暴露椎动脉进入第一颈椎的位置。然后将预热的电凝笔插入该区域，电凝并切断椎动脉，持续三到五秒。沿胸锁乳突肌内侧缘分离肌肉和筋膜。暴露并游离双侧颈总动脉（CCA），并打一个松结。当大鼠恢复意识并出现搔抓反应时，迅速拉紧第一个松结以阻断颈总动脉（CCA）的血流。根据针控结扎法，使用直径为0.5毫米的注射器针头和6-0号尼龙线结扎CCA，然后小心抽出针头，使颈动脉变窄。缺血30分钟后，解开第一个结，使CCA恢复再灌注。解开第二个结以诱导颈总动脉（CCA）狭窄，从而引起持续性昏迷。最后，使用4-0缝线缝合切口。颈总动脉（CCA）的突然阻塞会导致脑电图（EEG）和肌电图（EMG）活动显著受到抑制，几乎呈直线状态，表明存在严重功能损害。随着机体代偿功能改善脑部血流灌注，大鼠逐渐恢复意识。苏醒后，其脑电图和肌电图读数几乎完全恢复正常，表明缺血效应已得到逆转。

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