Name: 建立用于大鼠循环死亡后肺的新型离体肺灌注系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 了解大鼠离体肺灌注系统的建立方法，用于研究循环死亡后供体肺的功能维持。该模型可稳定维持肺功能四小时，为移植生物学和缺血再灌注损伤研究提供简单、可重复且经济高效的平台。

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本工作得到了国家高水平医院临床科研基金和中日友好医院精英医学人才项目的资助（项目编号：[2022-NHLHCRF-LX-03-0303] 和 [ZRJY2021-GG07]）。

实验动物为体重250-400 g的SD雄性大鼠。大鼠饲养在18-22 °C的标准实验环境中，采用12 h光照-黑暗循环，可自由摄食和饮水。中国医学科学院北京协和医学院中日友好医院临床医学研究所动物护理与使用委员会批准了动物实验，并按照相关指南进行操作。所有手术均在全身麻醉下进行。图1提供了体外肺灌注（EVLP）系统的示意图和实际图像供参考。所用所有仪器和设备的具体品牌和型号详见材料表
1. 仪器装置的构建
注意：3D 打印塑料似乎是该装置的一个有前景的选择。然而，根据我们有限的经验，使用塑料材料打结时难以控制力度；力度过小可能导致管子滑脱，力度过大则可能堵塞塑料管路。金属硬质管可避免这些问题，且相对耐用，因此本实验中采用金属硬质管。
<ol>
	<li>将模块连接至塑料管道，并使用铁架台和可调升降平台将所有部件调整至适当高度。向液体储存罐中加入150 mL灌注液，打开蠕动泵，设定流速为20 mL/min，使灌注液充满管路。</li>
	<li>为气管插管研磨出一个环形凹槽。准备含有8% O2、6% CO2 和86% N2 的混合气体作为低氧气体。通过人工膜肺将低氧气体通入灌注液中。在进行血气测定前，先用纯氧通气5分钟。</li>
	<li>使用弯曲成适合大鼠解剖结构的空心304不锈钢管制作肺动脉和心房插管（图2A）。为动脉插管研磨出环形凹槽。在心房插管管壁远端打孔，并打磨外壁上的环形凹槽（图2C）。在管路接入肺动脉灌注管路前设置排气装置。</li>
	<li>将三通阀连接至水浴的外循环系统，调节储液罐、器官腔室和肺动脉灌注液的温度。尽量缩短非水浴部分的连接管长度，控制设备各点温度误差在±0.2 °C范围内。本实验设计的目标温度为37 °C。</li>
	<li>用生理盐水填充压力监测管路，将压力监测装置调节至与供体肺脏相同高度。打开阀门，连接压力监测管路与肺动脉及静脉灌注管路，启动数据采集器并设零点。实时监测动脉灌注压和静脉回流压。</li>
</ol>
2. 大鼠麻醉
<ol>
	<li>穿戴个人防护装备：在接触大鼠及大鼠组织前，佩戴外科口罩、手套和一次性防护服。</li>
	<li>称量大鼠体重并记录。用注射器抽取1000 U/kg的肝素，通过针头注入尾静脉。</li>
	<li>将大鼠放入密闭的诱导室中，用3%异氟烷气体进行麻醉。夹住大鼠脚趾；若无反应，表明大鼠已达到所需的麻醉深度；否则，继续延长麻醉时间。涂抹无菌眼膏以防止眼睛干涩。</li>
	<li>准备多根缝线（3-0或4-0）。将大鼠转移至手术台，仰卧位固定，用缝线固定后，以酒精喷雾消毒。</li>
</ol>
3. 供体肺的获取
<ol>
	<li>将大鼠头部置于麻醉面罩中，通过输送含1.5%异氟烷的空气维持麻醉状态。夹捏大鼠脚趾；若无反应，则表明大鼠已达到所需的麻醉深度。</li>
	<li>使用啮齿类动物手术剪在气管前方颈部正中做一2-3 cm的纵向切口，切开皮肤，分离气管前方的肌肉组织，充分暴露气管。</li>
	<li>游离气管后方间隙，穿过一根3-0缝线并打一松结备用。在结上方0.5 cm处用啮齿类动物手术剪于气管上做V形切口，将气管插管（14G）插入气管，拉紧缝线结扎，固定气管插管（图3A）。</li>
	<li>将气管插管连接至呼吸机，开启设备，开始肺通气。</li>
	<li>频繁监测并记录生命体征，以确保麻醉深度及生命体征变化，直至确认死亡。</li>
	<li>实施肺复张操作，以压力控制模式重新启动机械通气，通气5分钟。使用以下参数：PEEP 3 cmH2O，吸气:呼气（I:E）比1:2，呼吸频率40次/分钟，FiO2 0.5。</li>
	<li>夹闭气管，使肺经历1小时的温缺血时间（WIT）。温缺血期结束后，按以下方法取出肺脏，并随机分为三组：（1）直接取肺组，（2）4小时冷静态保存（CS）组，（3）4小时体外肺灌注（EVLP）评估组。</li>
	<li>对于直接取肺组，获取供体肺后不进行任何处理，直接取样用于各项检测。对于4小时冷静态保存（CS）组，将供体肺在4 °C冰箱中进行冷静态保存4小时后取样检测。对于4小时EVLP评估组，按步骤5操作。</li>
	<li>调整手术台至头高脚低45°倾斜位置。</li>
	<li>使用剃毛器去除大鼠胸腹部中段的毛发，用碘伏消毒3次，并用手术巾覆盖。</li>
	<li>使用啮齿类动物手术剪沿腹部正中线做6-7 cm纵向切口，切开皮肤，打开腹壁进入腹腔，暴露腹腔器官。用棉签轻轻将肠管推向腹腔右侧，以暴露其后方的下腔静脉。</li>
	<li>使用注射器将1000 U/kg肝素溶液注入下腔静脉。等待5分钟，确保血液充分肝素化。肝素可防止肺动脉内微血栓形成。</li>
	<li>用剪刀剪断大鼠下腔静脉，进行放血。开始以初始呼吸机参数进行机械通气，潮气量3 mL/kg，呼气末正压（PEEP）2 cmH2O，呼吸频率60次/分钟，I:E比1:2。</li>
	<li>用镊子提起剑突，从下至上沿胸骨做纵向切口。使用肋骨牵开器暴露胸腔。去除胸腺组织，暴露心脏及其下方的主要大血管。 
	注：大鼠肺组织脆弱，避免用金属器械接触肺或腹腔器官。为获得更好视野，可用棉签轻轻将肺组织拨开。</li>
	<li>游离大鼠主动脉及肺动脉后方间隙，穿过一根3-0缝线并打一松结备用。</li>
	<li>在右心室流出道前壁做2-3 mm的V形切口，通过切口将肺动脉插管插入肺动脉，并拉紧预先打好的缝线以固定插管（图3B）。</li>
	<li>剪开大鼠心尖，将止血钳插入左心室，破坏左心室与左心房之间的瓣膜，确保左心房流出道通畅。</li>
	<li>将肺动脉插管连接至灌注回路，使用15 mL低钾溶液以0.6-1 mL/min的速度冲洗残余血液。冲洗至肺组织变白或从左心室流出的灌注液变白为止。</li>
	<li>在心脏后方放置缝线并环绕心室；将左心室插管经左心室切口插入；拉紧预先打好的缝线以固定插管（图3C）。</li>
	<li>在气管插管上方剪断气管，提起气管，并用剪刀向下分离气管后方的结缔组织至膈肌水平。</li>
	<li>剪断膈肌上方的下腔静脉和主肺动脉；取出心脏和肺脏（图3D）。</li>
	<li>为保持肺膨胀状态，应在吸气末立即夹闭气管下三分之一段，取出心肺组织后迅速置于低钾溶液中保存。</li>
	<li>将心肺组织置于EVLP回路的指定位置，并将左心室插管连接至灌注回路（图4A）。</li>
</ol>
4. 初始化 离体 肺灌注系统
<ol>
	<li>组装EVLP回路：连接管路、氧合器、储液器、蠕动泵和器官腔室。</li>
	<li>在灌注前，向EVLP回路中加入120 mL肺灌注修复液，其中包含1000单位的肝素钠、50 mg头孢哌酮和50 mg甲泼尼龙。排除管路中的所有气泡，并在肺动脉灌注端使用排气装置。</li>
	<li>将水浴设置为室温，并开始循环温水以加热整个EVLP回路。</li>
	<li>打开计算机的数据采集程序，并将肺动脉压力传感器、肺重量传感器、泵速传感器和温度传感器连接至EVLP回路和记录仪。</li>
	<li>用生理盐水填充血压监测管路，调节操作台高度使其与供体肺高度一致，将压力监测管路连接至肺动脉和静脉灌注管路，打开阀门，启动数据采集器，并对系统进行调零。</li>
	<li>打开缺氧气体阀门，使缺氧气体通过膜肺持续10分钟，直至灌注液达到稳定的缺氧状态，随后关闭气体阀门，暂停蠕动泵，等待供体肺到达以进行离体肺灌注（ex vivo lung perfusion）。</li>
	<li>在小型动物EVLP平台附近准备手术台和外科器械，并通过高压蒸汽灭菌法预先进行灭菌处理。</li>
</ol>
5.&#160;离体肺灌注
<ol>
	<li>用足量的灌注液填充气泡捕集器，以防止气泡进入肺部（导致空气栓塞）。</li>
	<li>将心肺单元放入器官腔室，连接至EVLP设备，启动呼吸机和蠕动泵，并开始EVLP灌注（图4B）。</li>
	<li>以目标流速的20%开始灌注；在1小时内逐步将流速增加至目标流速；目标流速按心输出量的20%计算（75 mL/min/250 g供体体重）。</li>
	<li>将热交换器设置为40 °C，以维持肺组织温度为37.5 °C。在20分钟内，灌注液温度从25 °C升至37 °C。</li>
	<li>在灌注开始20分钟后移除气管插管夹。启动机械通气，呼吸频率（RR）为60次/分钟，呼气末正压（PEEP）为3 cmH2O，初始潮气量（VT）为4 mL/kg，并在10分钟内逐步增加至最大潮气量6 mL/kg。</li>
	<li>在通气的同时，开始通入低氧气体（8% CO2、6% O2 和 86% N2），以维持进入肺动脉的灌注液PCO2在35至45 mmHg之间。</li>
	<li>在灌注过程中持续监测灌注液流速、动静脉压力、气道峰压及肺功能参数。</li>
</ol>

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本研究介绍了一种经济高效且模块化的小动物体外肺灌注（EVLP）平台设计，并在心脏死亡后捐献（DCD）大鼠模型中验证了该平台的有效性。研究结果表明，EVLP可显著改善来自死亡供体肺脏的质量，从而扩大肺移植潜在供体的来源。供体肺脏的短缺仍是肺移植领域面临的关键挑战。为应对这一问题，一些国家已开始实施DCD项目28。该策略为增加可用器官移植物数量提供了重要途径。值得注意的是，多项研究表明，使用DCD供体器官进行肝移植后的长期生存率与使用脑死亡供体（DBD）器官相当29,30。然而，由于长时间缺血造成的严重损伤，DCD供体肺脏的利用率仍然有限31。高效评估并充分利用来自DCD供体的有限肺资源，有望显著缓解可移植肺脏短缺的问题。体外肺灌注（EVLP）是一种前景广阔的技術，能够提升肺脏质量，并延长移植前的器官保存时间。为验证EVLP相较于4 °C冷保存的有效性，我们采用了一种循环死亡大鼠模型。我们假设，本研究中的灌注技术可减轻缺血-再灌注损伤所致的肺组织损害，并改善循环死亡后的肺功能。实验结果与Wang等32和Hasenauer等33近期报道的研究发现一致。
在整个灌注回路中维持恒定的温度对于离体肺灌注（EVLP）功能的最优化至关重要。然而，许多现有的EVLP系统缺乏可靠且可调节的温度控制机制。单一的热交换系统通常需要进行调节，而这会改变特定位置的温度。温度的波动可能影响灌注液的成分，干扰氧合指数的测量，并最终损害实验结果的准确性。为克服这一难题，研究人员设计并构建了一套配备三个独立水浴热交换器的EVLP系统，分别置于储液罐、肺动脉灌注区和器官腔室内。此外，该系统采用最少化的管路设计，以减少热量散失，确保在4–40 °C范围内实现精确的温度控制。该配置可实现高度精确的温度调控，各回路区段的实测温度与设定值的偏差不超过±0.2 °C。该设计有效满足了EVLP实验对温度控制的严格要求。
由于器官较小，小型动物模型特别容易发生肺水肿和肺不张34。这些并发症显著阻碍了长时间灌注实验的进行。为应对这一挑战，并在灌注过程中确保最佳的肺保护效果，我们采用了目前临床实践中的金标准——多伦多方案。该方法在设定的时间范围内逐步增加灌注液流速和通气量35。灌注起始流速设定为目标流速的10%（心输出量的20% = 75 mL/min/250 g供体体重），并在1小时内逐步增加。同样，通气起始潮气量设为较低水平（4 mL/kg），并在10分钟内逐步将潮气量增加至最大6 mL/kg。本研究还强调了在灌注液中添加牛血清白蛋白（BSA）的优势。BSA的补充可提高胶体渗透压，从而减轻组织水肿36。在小型动物体外肺灌注（EVLP）中，根据心房插管方式可分为两种主要的灌注构型：闭环系统和开环系统。闭环系统可在心房内维持恒定且较低的压力，模拟生理状态，并有利于准确进行血气分析。Linacr 等人的研究已证明，在灌注过程中维持特定的心房压力可改善肺功能并减少水肿34。然而，若心房肌肉阻塞管路，则可能发生压力骤升。此外，心房固定牵拉以及气泡的存在可能因潜在的心肌纤维损伤和压力读数不稳定而影响实验结果7。为克服这些局限性并实现有效的闭环灌注，我们设计了一种特殊的心房插管。该插管尖端带有突出的支撑结构，可防止被心房肌肉阻塞；同时，插管主体上设有环形凹槽，便于牢固结扎固定。此外，该系统还集成了气泡捕获装置和预灌注技术，以消除空气栓塞风险，并维持稳定的灌注压力。
小型动物EVLP平台因其诸多优势而在科学研究中备受青睐：动物状态可控、成本效益高、可容纳大样本量，且灌注液消耗量低。此外，使用单一的小型动物品系（例如本研究中的大鼠，以及其他如豚鼠和家兔24,35,36）有助于对饮食和实验条件进行精细控制。该系统的多功能性可通过调整呼吸参数和灌注流速，适用于上述所有物种。配套视频详细展示了动物模型及EVLP操作流程，为研究人员提供全面的理解。遵循这些实验方案，研究人员可提高实验成功率，最大限度减少动物痛苦，并降低总体动物使用量。
尽管该研究已建立了一种经济实惠、模块化且用户友好的小型动物离体肺灌注（EVLP）系统，在稳定性、灌注质量和可调节性方面优于现有的商业系统，但仍需进一步研究以优化EVLP方案，包括灌注和通气参数，并确定最有效的肺保护药物。这一操作简便且高效的技術已借助现有基础设施成功应用于大量供体肺的测试。目前的研究重点集中在供体肺的修复与保护。

肺移植（LTx）仍是终末期肺病患者的唯一确定性治疗手段。肺移植的成功取决于具有足够功能的高质量供体肺的可获得性。然而，由于供体肺严重短缺，全球肺移植等待名单正不断延长1许多等待移植的患者在合理的时间范围内等待合适供体肺源期间，健康状况会恶化，甚至死亡。2因此，扩大潜在供体器官的来源以满足移植等待名单上患者的需求至关重要。心脏停搏后捐献（DCD）1,3 和 离体 肺灌注（EVLP）4,5 是增加可用于移植肺脏数量的两种有前景的策略。目前，脑死亡后捐献（DBD）6 是肺移植的主要供体来源。然而，由于目前供体器官短缺，DCD（心脏死亡后捐献）正逐渐受到重视。这一转变源于DBD（脑死亡后捐献）供体的局限性，例如血流动力学改变、机械通气、感染和误吸等因素可能损害供体肺的质量。供体器官的质量直接影响移植术后患者的预后及长期生存率。 离体 肺灌注（EVLP）过程通过重新评估心脏死亡后供体（DCD）的肺移植物，有效增加了可利用的肺移植数量，使得短期和长期结果均与传统移植相当7,8本研究旨在建立一种针对循环性死亡后大鼠肺脏的体外肺灌注系统，并对心脏死亡后捐献（DCD）供体进行精确评估。为降低原发性移植物功能障碍（PGD）的发生风险，减少对DCD供体肺脏的损伤9 可通过使用分子诊断技术来减少10 并采用特异性的靶向治疗。
体外肺灌注（EVLP）是一种在体外模拟肺脏自然环境并维持正常生理温度的技术。该技术可实现对肺脏的持续监测与评估11,12，延长移植器官的保存时间13，并通过体外灌注、通气和药物干预来改善边缘性肺脏的质量，使其达到可移植标准14。2007年，Steen 等首次报道了利用EVLP技术成功将边缘性供体肺用于肺移植的案例15。此后，EVLP技术逐步融入临床实践16,17。多伦多团队随后对该技术进行了改进，采用低潮气量通气和低灌注流速，并结合离心泵实现理想的肺保护策略，从而实现了长达12小时的稳定灌注18。
EVLP 具有多项优势，包括降低原发性移植物功能衰竭的风险、减轻肺水肿、缓解与脑死亡相关的炎症反应、为受体的免疫系统做好移植准备，以及预防肺部感染、误吸、肺栓塞和缺血-再灌注损伤14,19,20。尽管 EVLP 具有显著优势，但仍需改进方法以进一步提高移植物质量。
目前，关于大鼠体外肺灌注（EVLP）平台中灌注和通气的具体参数设置尚无统一标准。Ohsumi 等人21 设计了一种新模型，用于研究供体肺在经历长时间冷缺血时间（CIT）后，如何在期间维持其肺功能 离体 肺灌注（EVLP）过程及移植后。国际上已有多项研究致力于建立大鼠 离体 肺灌注（EVLP）模型22,23,24,25,26,27 为了实现更可靠和精确的灌注，开发一种经济高效、高度可重复且严格控制的小动物离体肺灌注（EVLP）系统，对于推动该领域的进一步研究至关重要。现有的小动物EVLP系统通常成本较高，且在针对不同研究需求调整操作条件方面灵活性有限。本文提出了一种经济高效且可灵活调整的EVLP系统设计，并详细阐述了其技术与手术实施步骤。我们采用循环停止后死亡的大鼠模型，证明EVLP可改善心脏死亡后捐献（DCD）肺脏的质量，从而扩大可用于移植的肺供体数量。我们旨在分享成功经验，以帮助其他研究人员建立适用于心脏循环死亡后小动物的便捷可用的EVLP平台。

<table><tbody><tr><td>3.0 mm 医用无菌导管</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, China</td><td>3.0mm</td><td>用于血液循环，而非血管本身</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich Trading Co.Ltd, Shanghai, China</td><td>BSAV-RO</td><td>增强灌注液的胶体渗透压</td></tr><tr><td>BP-100/102 血管内血压传感器</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USA</td><td>BP-100/102</td><td>记录大鼠肺血管压力</td></tr><tr><td>头孢唑林</td><td>北京赛通生物科技有限公司，北京，中国</td><td>PHR1291</td><td>抗细菌感染</td></tr><tr><td>脱氧器</td><td>东莞科威医疗器械有限公司，广东，中国</td><td>无型号说明</td><td>替代大鼠肺功能进行血液气体交换</td></tr><tr><td>F500 小动物通用麻醉机</td><td>北京易泽佳科技有限公司，北京，中国</td><td>F500</td><td>提供气体麻醉</td></tr><tr><td>气体混合物（6% O₂, 8% CO₂, 86% N₂）</td><td>北京东方医疗气体有限公司，北京，中国</td><td>无型号说明</td><td>维持血液酸碱平衡，模拟肺血管生理状态</td></tr><tr><td>热交换器</td><td>长虹精密仪器中心，深圳，中国</td><td>DHC-05-B</td><td>控制灌注回路温度</td></tr><tr><td>肝素</td><td>北京赛通生物科技有限公司，北京，中国</td><td>H0200000</td><td>抗微血栓形成</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd, 深圳，中国</td><td>R510-22</td><td>用于大鼠麻醉</td></tr><tr><td>隔离腔室</td><td>上海雷盾工业有限公司手工制作，上海，中国</td><td>无型号说明</td><td>用于储存大鼠肺脏</td></tr><tr><td>i-STAT 1 便携式临床分析仪</td><td>Abbott point of care, Inc, NJ, USA</td><td>300G</td><td>分析灌注液中的血气</td></tr><tr><td>iWorx RA-834 记录仪</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USA</td><td>RA-834</td><td>输出肺血管压力信号</td></tr><tr><td>多通道蠕动泵 LabMate</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, China</td><td>LabMate2</td><td>为灌注循环过程提供动力</td></tr><tr><td>PERFADEX Plus</td><td>XVIVO Perfusion, Gothenburg, Sweden</td><td>NA</td><td>用于大鼠供体肺的预灌洗；低钾溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肺动脉插管</td><td>不锈钢制成</td><td>304 不锈钢/SUS304</td><td>2.0/2.5 mm</td></tr><tr><td>肺静脉插管</td><td>不锈钢制成</td><td>304 不锈钢/SUS304</td><td>4.0 mm</td></tr><tr><td>QAH-INF-1 检测试剂盒</td><td>Innopsys, Parcd'Activit&amp;eacute;s Activestre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R415 小动物呼吸机</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd, 深圳，中国</td><td>R415</td><td>对大鼠肺进行通气</td></tr><tr><td>储液器</td><td>上海雷盾工业有限公司，上海，中国</td><td>容量 1 L</td><td>用于灌注液储存</td></tr><tr><td>SOLU-MEDROL</td><td>北京赛通生物科技有限公司，北京，中国</td><td>M0639</td><td>NA</td></tr><tr><td>温度传感器（TM-100）</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USA</td><td>TM-100</td><td>记录肺灌注温度</td></tr></tbody></table>

建立一种用于循环死亡后大鼠肺脏的新型离体肺灌注系统

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

供体肺脏在移植中的日益短缺，激发了人们对从心脏死亡后捐献者（DCD）获取器官利用的广泛关注。然而，如何最大限度地增加符合严格临床使用标准的可移植肺脏数量，仍是一项关键挑战。离体肺灌注（EVLP）作为一种颇具前景的技术，可用于评估并可能改善捐献肺脏的功能。本文介绍了一种专为EVLP研究设计的、经济高效且可重复的小型动物实验平台的建立。该平台具有高度可定制性，使研究人员能够根据EVLP领域的特定科学问题灵活调整实验参数。研究团队建立了一种模拟DCD的大鼠模型，并采用两阶段保存策略：肺脏首先在4 °C条件下使用灌注液进行4小时的静态冷保存，随后进行4小时的常温EVLP。研究人员评估了多项肺功能参数，包括肺血管阻力、肺动态顺应性、灌注液的血气分析结果以及肺组织中的细胞凋亡情况。研究表明，与单纯的4 °C冷保存相比，EVLP可显著改善DCD肺脏的功能表现，提示EVLP有望减轻缺血-再灌注损伤，并提升循环死亡后肺移植物的功能，从而扩大可供移植的肺脏来源。

为了评估EVLP对DCD供体肺的保护效果，有必要检测各组心跳供体肺中通过TUNEL染色检测到的凋亡细胞数量、灌注液中炎症标志物水平（使用QAH-INF-1检测试剂盒检测）以及总体病理形态学表现（苏木精-伊红（H&amp;E）染色）。所有DCD供体肺均接受了4小时的灌注。大多数肺的顺应性保持稳定，在4小时期间仅出现逐渐下降（图5B）。DCD供体肺之间的血管阻力和肺移植物氧合水平未见显著差异（图5A、C）。灌注液中的葡萄糖水平随时间逐渐下降，各大鼠之间无显著差异（图5D）。灌注液中电解质水平在各组间保持相似（图5E–F）。
采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术，结合细胞凋亡检测试剂盒，按照制造商提供的凋亡核检测说明进行TUNEL染色，用于定量分析不同保存条件下DCD供体肺中肺泡上皮细胞的凋亡（程序性细胞死亡）。在对凋亡细胞数量进行盲法分析时，发现供体组的阳性细胞数量显著高于其他组。此外，冷保存组的阳性细胞数量高于经EVLP灌注的DCD供体肺组(图6)。采用五个独立变量对H&amp;E染色的病理切片进行评分：1）肺泡腔内炎性细胞浸润，2）肺泡隔增厚，3）肺泡内和肺泡外出血，4）肺泡内水肿，5）透明膜形成。各变量评分范围为0–4分：0 = 无，1 = 轻度，2 = 中度，3 = 重度，4 = 极重度。各项评分之和即为总肺损伤评分。EVLP组的肺损伤评分显著低于冷静态保存组和对照组(图7A)。在冷静态保存4小时组中可见肺泡壁增厚和肺泡出血现象（图7B）。EVLP组则保持了正常的肺泡结构(图7C)。
<img alt="体外循环装置设置、膜式氧合、示意图、实验方法" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小型动物的示意图与照片 离体 肺灌注（EVLP）回路 图中的字母与照片中的字母相对应，用于说明各个组件的功能。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱系统组件；金属连接件、接头和管路部件示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2定制的套管针 (A肺动脉导管。B气管插管。C左心房插管。D一组大鼠 离体 肺灌注导管 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示心血管解剖和器官暴露步骤的啮齿类动物手术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：大鼠肺组织分离。（A）将气管插管置入并用丝线缝合固定。（B）对肺动脉进行插管，并用先前放置的丝线结扎。（C）用丝线缝合固定左心房插管。（D）钝性分离结缔组织以取出心肺组织块。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="器官灌注实验装置；A：管路连接，B：置于保存室中用于研究的器官" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4大鼠肺灌注装置 (A心脏-肺组织块被放入 离体 肺灌注回路。 (B与EVLP回路相连的肺脏具有适当的通气和灌注功能。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的生理参数图：PaO2/FiO2、Cdyn、PVR、葡萄糖、钠、钾。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：大鼠EVLP过程中肺功能的变化。（A-F）供体肺在经历1小时热缺血时间（WIT）后进行体外肺灌注（EVLP）期间的肺功能及血气分析结果。（A）肺氧合指数。（B）动态肺顺应性（Cdyn）。（C）肺血管阻力（PVR）。（D）EVLP 4小时后灌注液中的葡萄糖水平。（E）EVLP 4小时后灌注液中的钠水平。（F）EVLP 4小时后灌注液中的钾水平。误差线表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TUNEL 检测示意图结合 DAPI 染色，比较 DCD、DCD+COLD、DCD+EVLP 条件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6不同病例的TUNEL检测代表性图像。 TUNEL阳性细胞：绿色荧光显示凋亡细胞；DAPI：蓝色荧光代表细胞核；Merge：所有细胞，包括发生程序性细胞死亡（凋亡）的细胞；DCD指直接肺脏获取组；DCD+COLD指4小时冷静态保存组；DCD+EVLP指4小时体外肺灌注组 离体 肺灌注（EVLP） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肺损伤评分柱状图与肺组织病理学分析，实验结果示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：肺损伤评分与组织病理学结果。（A）对照组、冷静态保存（SCS）组和体外肺灌注（EVLP）组的肺损伤评分（*，p &lt;0.05）。（B）冷静态保存（SCS）供体的代表性苏木精-伊红（H&amp;E）染色切片。黑色箭头指示肺毛细血管上皮破裂，蓝色箭头指示肺泡壁增厚。（C）EVLP供体的代表性H&amp;E染色切片。红色箭头指示炎性细胞浸润。（D）直接获取供体（对照组）的代表性H&amp;E染色切片。黑色箭头指示肺毛细血管上皮破裂及出血。误差线表示标准差，显著性分析采用单因素方差分析（ANOVA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

目标是开发一种新的 离体 大鼠离体肺灌注（EVLP）模型，可在4小时内维持稳定的肺功能，并为行业提供具体实施细节，从而为将EVLP技术应用于啮齿类动物模型建立一种可靠的方法。

供体肺脏用于移植的日益短缺，已促使人们高度关注利用来自心脏死亡后供体所获取的器官……

提高供体肺的质量是提升肺移植成功率的关键。我们希望建立一种简单且可重复的动物模型，用于研究离体肺灌注（EVLP）对改善供体肺质量的作用。EVLP 已被证实为一种有效改善供体肺质量的技术手段，但 EVLP 仍存在诸多问题有待进一步研究和阐明。灌注条件仍需进一步探索，EVLP减轻缺血-再灌注损伤的能力也有待进一步验证。与其他技术和模型相比，我们建立的大鼠EVLP平台最为简单、可操作性强、可重复性高、成本低廉且性价比更高，为EVLP相关研究提供了高效的科研平台。应关注体外肺灌注技术对边缘供体肺的治疗作用，这在中国与DCD情况类似。同时，该技术可为未来的研究提供一个平台。首先，将麻醉后的大鼠仰卧位固定于手术台上，并用缝线固定。使用啮齿类动物手术剪，在气管前方的颈部中线处做一个2至3厘米长的纵向切口。切开皮肤并解剖气管前方的肌肉组织，充分暴露气管。随后，使用注射器经尾静脉注射每千克体重1,000单位的肝素，等待5分钟，以确保血液充分肝素化。游离气管后方的空间。用3-0缝线穿过气管并打一个松结，以备后续使用。在气管上的结上方做一处0.5厘米的V形切口。将14号气管插管插入气管。扎紧缝合线结以固定插管。将气管插管连接至呼吸机。打开呼吸机以开始肺部通气。每5分钟监测一次大鼠的生命体征，并暂停通气。在通过以下参数确认大鼠因心脏骤停死亡后，重新启动呼吸机并以压力控制模式进行机械通气，持续通气5分钟。夹闭气管，并将供体肺置于室温下，保持一小时的热缺血时间。接下来，在收获肺脏时，将手术台调整为头高脚低、倾斜45度的体位。使用剃毛器，去除大鼠胸部和腹部中段的毛发。用碘液对术区消毒三次，并用手术巾覆盖。使用啮齿类动物手术剪沿腹部正中线做一个6至7厘米的纵向切口。剪开皮肤，切开腹壁进入腹腔，暴露器官。使用注射器，向下腔静脉注入每千克1,000单位的肝素，等待5分钟，以确保血液充分肝素化。然后，用剪刀剪开大鼠的下腔静脉，开始对肺部进行机械通气。通气完成后，用镊子提起剑突，并沿胸骨从下至上做纵向切口。使用肋骨撑开器暴露胸腔，随后移除胸腺组织以暴露心脏及其下方的主要血管。游离大鼠的主动脉及肺动脉后方的间隙。将一根3-0缝线穿过肺动脉并打一个松结，以备后续使用。在右心室流出道的前表面做一个2至3毫米的V形切口。通过切口将肺动脉插管插入肺动脉，并收紧预先打结的缝线以固定插管。剪除大鼠心脏心尖部分，并将止血钳插入左心室。破坏左心室与左心房之间的瓣膜，以确保左心房流出道通畅。接下来，将肺动脉插管连接至灌注回路，并使用15毫升低钾溶液以0.6至1毫升/分钟的流速冲洗残留血液。在心脏后方放置缝线，并环绕心室。将套管经左心室切口插入，并拉紧预先打好的缝线以固定套管。随后，剪断气管插管上方的气管。提起气管，用剪刀向下分离气管后方的结缔组织直至膈肌。然后，在膈肌上方切断下腔静脉和主肺动脉。分离心脏和肺。为保持肺部膨胀，应在吸气末立即夹闭气管下三分之一处。取出心脏和肺脏，并将其置于低钾溶液中以进行保存。将心脏和肺脏放置在离体肺灌注（EVLP）回路的指定位置，并将左心室插管连接至灌注回路。组装好EVLP装置后，向除泡阱中加入足量的肺灌注修复液，以防止气泡进入肺脏。将心肺单元放入器官腔室，并连接至EVLP设备。随后启动呼吸机和蠕动泵。以目标流速的20%开始肺灌注。计算出目标流速后，在一小时内逐步将流速增加至目标值。将热交换器设置为40摄氏度，以维持肺脏温度在37.5摄氏度。灌注20分钟后，移除气管插管夹，并根据以下参数开始机械通气。然后，开始通入低氧气体。在通气过程中，通过肺动脉维持灌注液的二氧化碳分压在35至45毫米汞柱之间。灌注期间，持续监测灌注液流速、动静脉压力、气道峰压及肺功能参数。DCD供体肺的肺移植物氧合水平和血管阻力保持稳定，在四小时灌注期间无显著差异。DCD供体肺的动态顺应性在四小时灌注期间逐渐下降。DCD供体肺灌注液中的葡萄糖水平在四小时灌注过程中持续降低。在四小时灌注期间，各组的电解质水平（包括钠和钾）保持稳定。与其它组相比，DCD供体组检测到显著更多的凋亡细胞，其中冷保存组的阳性细胞数多于EVLP组。与冷静态保存组和对照组相比，EVLP组的肺损伤评分显著更低。在冷静态保存四小时组中，肺泡壁增厚和肺泡出血较为明显，而EVLP组则保持了正常的肺泡结构。

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离体 肺可用于多种实验，以在排除混杂变量的情况下收集生理数据 体内 实验。商业设备通常价格昂贵，且在可收集的数据类型方面存在局限。我们描述了一种构建完全模块化装置的方法，可适应多种研究设计。...

大鼠的设计与构建 离体 肺灌注模型

本文描述了建立大鼠离体肺灌注（EVLP）模型所需的必要步骤，并展示了灌注肺组织相关的炎症特征。目的是传播有关大鼠EVLP模型的知识与经验，促进对这一革命性技术所涉及的生物学反应的全面理解。...

建立一种 离体 用于肺移植转化研究的大鼠肺灌注模型

热预处理期间 离体 移植前修复受损肺移植物的肺灌注技术

导致内膜增生（IH）和静脉移植物失效的机制仍不甚清楚。本研究描述了一种在可控血流和压力条件下灌注人静脉的ex vivo系统，并进一步评估了外部网状加固限制IH发展的有效性。...

人体大隐静脉操作步骤 离体 灌注与外部加固

肝脏供体严重短缺，因此肝脏供体标准已逐步放宽。常温 离体...

一种小型动物模型 离体 常温肝脏灌注

本方案展示了一种简单且灵活的方法，用于评估新的预处理药物或策略，以提高心脏在循环死亡后捐献的可行性。...

循环死亡后心脏捐献的临床前模型

在此，我们提出了一种优化的大鼠肺移植模型，可改善手术预后。我们根据体重提供了套管尺寸指南，以及一种用于确定4th...

一种用于研究热缺血/再灌注损伤的大鼠肺移植模型：改善预后的优化策略

了解大鼠离体肺灌注系统的建立方法，用于研究循环死亡后供体肺的功能维持。该模型可稳定维持肺功能四小时，为移植生物学和缺血再灌注损伤研究提供简单、可重复且经济高效的平台。

建立一种用于循环死亡后大鼠肺脏的新型离体肺灌注系统

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