Name: 使用基于集合的对接分析将靶蛋白结构灵活性和动力学整合到计算药物发现中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 探索基于集合的对接分析方法，整合蛋白质结构灵活性与动力学模拟技术，提升计算药物发现的准确性。该方法利用分子动力学模拟生成多种蛋白质构象，结合Autodock和Chimera软件进行聚类分析与对接计算，为精准药物设计提供可靠支持。

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本工作由马来亚大学RMF资助项目（项目编号：RMF1392-2021）支持。

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

基于集合的计算药物发现应用涉及利用从晶体结构、核磁共振（NMR）研究或分子动力学模拟中获得的大量构象集合26。采用多种计算构象可使分析纳入蛋白质结构的动态性和柔性，从而提高识别潜在药物候选分子的准确性和可靠性。
进行基于集合的对接分析需要遵循几个关键步骤。首先，需要获取一组多样化的蛋白质构象，这些构象可来自实验数据，或在本研究中，由计算模拟生成。这些构象能够反映目标蛋白质固有的柔韧性及构象多样性。最近的一项研究还整合了分子动力学模拟方法，以捕捉构象变化并探索变构位点，从而发现新的结合口袋和潜在的药物靶点58。接下来，根据均方根偏差（RMSD）值对蛋白质构象进行聚类，聚类标准需满足协议部分所述的一系列条件。最后，利用分子对接或其他计算技术，将配体对接至这些构象集合。通过考虑模拟获得的多种可能结构，可扩大所鉴定出的结合配体的多样性。
尽管集成方法具有多种优势，包括提高预测性能和鲁棒性，但其也存在局限性。由于需要运行多个模型或算法，集成方...

在计算药物发现（CDD）中，计算机科学、化学、生物学和物理学的技术被整合起来，以探索庞大的化学空间，预测药物-靶点相互作用，并比单独使用传统实验方法更高效、更低成本地优化候选药物。这是一种强大的方法，利用计算方法和算法来加速新治疗化合物的发现与优化过程1,2,3。CDD 已经彻底改变了药物发现领域。然而，与蛋白质三维（3D）结构动力学相关的局限性可能会影响计算预测的准确性和可靠性4。在 CDD 中，蛋白质的三维结构被用作模板，基于靶蛋白-药物相互作用来设计或优化候选药物。尽管X射线晶体学提供的蛋白质结构模型为蛋白质提供了宝贵的结构信息，但必须认识到蛋白质结构具有动态特性，以及静态模型存在局限性5,6,7。此外，近年来冷冻电子显微镜（cryo-EM）以及AlphaFold等计算预测技术的进步，也极大地扩展了可用于捕捉蛋白质灵活性和动力学全谱的结构数据资源8,9,10,11,12。
分子动力学（MD）模拟通过模拟原子和分子随时间的运动与相互作用，揭示蛋白质三维结构的动态行为和柔性13,14。MD 模拟可用于生成代表多种构象状态的蛋白质三维结构，作为基于集合的对接分析的输入。通过采样多种蛋白质构象，基于集合的对接分析能够考虑生物靶标的固有柔性和动力学特性，从而更全面地探索配体的结合模式和相互作用3。
理解蛋白质的柔性至关重要，因为它影响药物发挥其生物学效应的方式，决定结合位点的位置和取向，并影响结合动力学、代谢和转运过程15,16。捕捉这种动态特性可显著提高分子对接预测的准确性和可靠性。1994年，Kearsley 等人提出了一种柔性对接技术，该框架可同时模拟配体和蛋白质的柔性。该方法允许蛋白质构象在对接过程中发生调整，通过考虑结构柔性来改进配体-受体相互作用的预测17。同样，1999年，Carlson 等人报道了集合对接（ensemble docking）方法，该方法将柔性药效团建模应用于HIV-1整合酶的静态和动态模型，进一步凸显了在对接研究中考虑蛋白质动力学的重要性18。此外，Cavasotto 等人也报告了通过在对接过程中引入受体柔性（使用常规模式分析方法），提高了配体对接的准确性19。近年来，基于集合的对接技术20,21,22,23,24,25,26,27通过识别潜在的新配体结合位点，并提供更精确的游离配体-受体结合能估算值，进一步拓展了药物发现的范围。这些进展已被应用于多种靶标，包括四链体-双链DNA20、血管内皮生长因子165（VEGF-165）21、SARS-CoV-2靶标酶22、人肝脏细胞色素P450酶23以及抗癌蛋白24。
黄樟素B（Flavokawain B，FB）属于黄酮类化合物，已被报道具有多种药理特性28,29,30。根据实验与计算分析，FB可与溶菌酶（lysozyme，LYZ）形成稳定的复合物31，LYZ是一种广泛认可具有抗菌活性的蛋白质，同时也被确认为一种配体转运蛋白32,33,34。本研究中，我们进一步采用基于集合的对接分析方法，研究FB与LYZ相互作用的性质，以纳入蛋白质柔性对FB-LYZ复合物形成的影响。该方法旨在为研究人员提供一种逐步、可重复的基于集合的对接分析流程。此外，建议研究人员在研究中选用来自目标生物体的蛋白质结构。

<table><tbody><tr><td>AutoDock</td><td>美国斯克里普斯研究所</td><td>版本 4.2.6</td><td></td></tr><tr><td>AutoDock Tools</td><td>美国斯克里普斯研究所</td><td>版本 1.5.6</td><td></td></tr><tr><td>Avogadro</td><td>Geoffrey R Hutchison，美国匹兹堡大学化学系</td><td>版本 1.95</td><td></td></tr><tr><td>Discovery Studio</td><td>Dassault Syst&amp;egrave;mes，美国马萨诸塞州</td><td>版本 2021</td><td></td></tr><tr><td>GROMACs</td><td>格罗宁根大学&lt;br/&gt; 皇家理工学院&lt;br/&gt; 瑞典乌普萨拉大学</td><td>版本 2023</td><td></td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>生物计算、可视化与信息学资源中心&lt;br/&gt; 加利福尼亚大学</td><td>版本 1.16</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于集合的对接分析在计算药物发现中整合靶标蛋白结构的柔性与动力学特性

Incorporating Target Protein Structure Flexibility and Dynamics in Computational Drug Discovery Using Ensemble-Based Docking Analysis

药物发现过程是一项严格、耗时且昂贵的工作。在药物发现中采用计算方法可使研究人员优先选择最有前景的化合物进行进一步测试，从而大幅减少所需资源，提高药物发现流程的整体效率。基于结构的药物发现是一种常见方法，需要以三维形式提供靶标蛋白的结构信息。然而，目前大多数计算机辅助药物发现策略的局限性在于，无法在配体-蛋白对接模拟过程中引入靶标蛋白结构的柔性和动态特性。尽管诱导契合对接和基于集合的对接均旨在解决对接过程中的蛋白柔性问题，但后者通过在模拟过程中整合多种构象，能够更全面地展现蛋白的动态行为。本报告中，我们演示并讨论了一种称为基于集合的对接分析技术的应用，该技术在分子对接过程中间接引入了靶标蛋白结构的柔性和动态特性。用于基于集合对接研究的蛋白和配体分别为溶菌酶和佛洛沃卡维B（FB）。已有文献报道FB具有与溶菌酶结合的活性。在水环境中对溶菌酶进行了分子动力学（MD）模拟，并分析了总能量、均方根偏差（RMSD）和均方根涨落（RMSF）。基于多个聚类截断值生成了构象聚类，并选取用于与FB的进一步对接分析。其中第2号聚类的结合能最低，为-29.37 kJ/mol。通过生成分子对接图像，预测了结合力的存在。通过整合蛋白的结构动态特性，基于集合的对接方法能够更准确地捕捉可能的结合情景范围，从而实现对结合结果更可靠的预测。

优化后FB的化学结构及其三维结构表示如图8A所示。图8B展示了初始状态下溶菌酶（PDB编号：1LYZ）的三维结构。为了研究溶菌酶三维结构的动力学和柔性，进行了100 ns的分子动力学（MD）模拟。模拟过程中蛋白质结构的总能量保持稳定，如图9A所示。MD模拟的前20 ns内，RMSD值有所增加，随后趋于稳定（图9B）。RMSF分析显示，在MD模拟期间发生较大波动的残基区域为第40至50位、60至80位以及100位至蛋白末端的残基（图9C）。每10 ps保存一次MD轨迹的构象，共获得10,001条轨迹用于进一步分析。由于MD模拟表明在100 ns的模拟期间各项参数已达到稳定，因此将所有MD轨迹的三维构象采用Gromos聚类算法进行聚类分析。然而，更长的模拟时间可能有助于采样更多替代...

计算方法在加速药物发现方面具有广阔前景，但这些方法常常忽略了蛋白质结构的动态特性。本文讨论基于集合的对接分析方法，该方法可间接地纳入蛋白质的柔性特征，从而可能提高药物发现工作的准确性和可靠性。

药物发现过程是一项严格、耗时且昂贵的工作。药物发现中的计算方法使研究人员能够……

我们的研究致力于应用计算技术设计更有效的药物，旨在加速药物发现进程，最终改善治疗效果和患者的生活质量。目前的计算机辅助药物设计通常忽略了靶标蛋白的柔性。本研究所讨论的方案通过引入来自分子动力学模拟的多种蛋白构象，弥补了这一不足。基于集合的药物设计通过考虑蛋白柔性，提高了设计的准确性。未来，我们旨在整合人工智能技术，以实现更快速、个性化且更高效的药物发现。[Presenter] 首先，在计算机系统上启动 Avogadro 软件。进行聚类分析时，输入屏幕上给出的命令。当系统提示时，输入 1 选择蛋白质组以计算最小二乘拟合和均方根偏差（RMSD）。然后再次输入 1 以输出系统结果。打开 cluster-size.xvg 文件。如果聚类数量较低，则提高 RMSD 截断值；反之，若数量过高，则降低截断值。根据需要，使用屏幕上显示的命令进行 grace 分析，并尝试不同的 RMSD 截断值。现在打开 Chimera 软件，搜索 cluster.pdb 文件。点击 Presents 和 Publication 1，选择 silhouette、rounded ribbon 以进行可视化呈现。依次点击 Select、Chain、No ID，然后选择 cluster.pdb 中的 #10，接着选择并反向选中模型。进入 Actions，点击 Atoms/Bonds，再点击 Delete，以分离该肽链。随后选择 File，点击 Save PDB，将文件命名为 cluster1.pdb，然后点击 Save 保存文件。对于基于集合的分子对接，启动 Autodock 工具软件。将文件 cluster1.pdb 和 ligand.pdb 放入一个新文件夹中。点击 File、Preferences 和 Set。在弹出窗口中，将文件夹路径粘贴到启动目录字段中，然后点击 Set。点击蓝色文件夹图标，选择 cluster1.pdb，再点击 Open。进入 Edit，点击 Charges，选择 Add Kollman Charges，然后点击 OK。点击 Grid，Macromolecules，选择 Choose。在 Choose Macromolecules 对话框中选择 cluster 1，然后点击 Select Molecules。点击 OK 以生成修改后的 AutoDock4 大分子文件。将其保存为 cluster1.pdbqt。接下来，清空工作区：点击 Edit，然后点击 Delete，删除所有分子后点击 Continue，再点击 Ligand、Input、Open。当出现用于 Autodock4 的配体文件时，选择 ligand.pdb，点击 Open，然后点击 OK。现在选择 Ligand、Torsion Tree，点击 Detect Root，以定义配体的扭转柔性。进入 Ligand、Output，选择 Save as PDBQT，将格式化后的 Autotors 分子文件夹保存为 ligand.pdbqt。在清空工作区后，通过点击 Grid、Macromolecules 和 Open 来打开 cluster1.pdbqt 文件，然后点击 Yes 和 OK。再次进入 Grid，点击 Set Map Types，选择 Open Ligand，选中并打开 ligand.pdbqt。现在进入 Grid 下的 Grid Box 选项。在 Grid Options 对话框中，将 X、Y 和 Z 三个维度的点数均设置为 120，间距设为 0.375 埃，中心参数保持默认。然后点击 File，选择 Close Saving Current。进入 Grid，Output，点击 Save GPF。当出现 Grid Parameter Output 文件时，将文件名设为 grid.gpf，然后点击 Save。接下来，点击 Run，运行 AutoGrid。在 Parameter Filename 选项卡中，点击 Browse，打开 grid.gpf 文件。然后浏览程序路径，查找 autogrid4.exe，点击 Open 并 Launch。依次点击 Docking、Macromolecules 和 Set Rigid Filenames。当出现 PDBQT 大分子文件时，选择 cluster1.pdbqt，点击 Open。从 Docking 菜单中选择配体。当 Choose Ligands 对话框出现时，选择 Ligand，点击 Select Ligand，然后点击 Accept。现在进入 Docking 下的 Genetic Algorithm。当 Genetic Algorithm Parameters 对话框出现时，将 GA Runs 设为 100，然后点击 Accept。点击 Docking、Output，选择 Lamarckian GA 4.2。当出现 Autodock4.2 GALS Docking Parameter Output 文件时，将其命名为 docking.dpf，然后点击 Save。现在点击 Run，运行 Autodoc。此时将弹出 Run Autodoc 对话框。在 Parameter File Name 处点击 Browse。当出现 autodock4 Parameter 文件时，选择 docking.dpf，点击 Open。在 Program Pathname 处点击 Browse。将出现 autodock4 文件，查找 autodock4.exe，点击 Open，然后点击 Launch。按照前述方法删除所有分子，并对所有聚类文件重复上述过程。获得了分子动力学模拟前初始状态下黄酮卡瓦宁 B 与溶菌酶的化学结构及其三维结构表示。在模拟过程中，蛋白质结构的总能量保持稳定，均方根偏差在 20 纳秒后趋于稳定。均方根涨落分析显示，残基 40 至 50、60 至 80 以及 100 至末端区域具有较高的柔性。通过对 10,001 个轨迹帧进行基于均方根偏差的聚类分析，共获得 15 个结构聚类，其中最大聚类包含 5,818 个成员。所有聚类构象的叠加显示各轨迹之间存在明显的结构差异。黄酮卡瓦宁 B 与前四大聚类代表性结构的分子对接结果显示，在所有构象中均一致结合于相同位点，其中聚类 2 的结合能最低，为 -29.37 kJ/mol。静电表面映射证实，在所有聚类构象中，黄酮卡瓦宁 B 均结合于相同的口袋区域。详细的相互作用分析表明，黄酮卡瓦宁 B 的结合由多个周围残基稳定，包括丙氨酸 31（alanine 31）、谷氨酰胺 35（glutamine 35）、亮氨酸 56（leucine 56）、γ-羧基谷氨酸 57（gamma-carboxyglutamic acid 57）、异亮氨酸 58（isoleucine 58）、丙氨酸 95（alanine 95）、异亮氨酸 98（isoleucine 98）、色氨酸 108（tryptophan 108）、缬氨酸 109（valine 109）、丙氨酸 110（alanine 110）、色氨酸 111（tryptophan 111）以及精氨酸 114（arginine 114）。

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使用基于集合的对接分析将靶蛋白结构灵活性和动力学整合到计算药物发现中

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