使用定量不可逆拴系实验进行共价片段筛选

我们在化学与生命科学系之间开展工作，致力于为多种抗癌药物靶点开发新型辅助反应性共价配体。希望这些分子未来可被用作治疗药物，或可能作为化学探针。目前已有多种技术可用于共价配体的筛选。

这些方法大致可分为蛋白质组学技术，即化合物与培养细胞共同孵育，然后利用质谱分析确定分子标记和靶向的蛋白质；以及基于靶点的方法，即电泳化合物库与单个蛋白质进行孵育。一个重要的实验挑战与共价配体的反应性相关。反应性过强的分子在筛选实验中常会呈现为阳性结果，但由于其会非选择性地标记细胞中多种不同的蛋白质，因而并不适用。

因此，在共价药物发现的每一步中，化合物的活性都至关重要，必须予以考虑。为此，帝国理工学院的 Mann 和 Armstrong 团队开发了一种新的方法，用于针对蛋白质靶点筛选亲电试剂，称为定量不可逆锚定（quantitative irreversible tethering, qIT）检测法。我们的实验方案提供了一种亟需的、全新的针对蛋白质靶点的亲电试剂筛选方法，该方法具有可扩展性，无需质谱分析，并能控制化合物的本征反应活性。

首先，配制所有必需的储备溶液，并在实验前于室温下放置两小时。用氩气对定量不可逆拴系（qIT）检测缓冲液脱气约30分钟。进行缓冲液置换时，将蛋白质溶液加入过量的已脱气qIT检测缓冲液中，置于离心过滤装置内，在4摄氏度条件下以4,000 G离心15分钟，以浓缩蛋白质。

然后将目标蛋白溶液用脱气的qIT检测缓冲液稀释至15微摩尔浓度，制备9毫升该溶液。将TCEP-琼脂糖溶液、qIT缓冲液和谷胱甘肽储备液分别加入384孔板的相应孔中。从片段文库板的每个对应孔中转移1.8微升至新的化合物稀释板中，使每种化合物在qIT检测缓冲液中稀释至1.5毫摩尔浓度，并含有3% DMSO。

使用384通道移液工作站，将化合物稀释板中每个孔内的20微升化合物溶液转移至两个反应板中。首先，使用目标蛋白和谷胱甘肽建立定量不可逆锚定（qIT）检测。将500微摩尔的CPM储备液分装为111.2微升的等分试样，置于微量离心管中，并在20摄氏度下保存。

解冻CPM储备液后，将其加入40毫升qIT测定淬灭缓冲液中，配制1.4微摩尔浓度的溶液。将27微升CPM淬灭溶液分别加入两个新的384孔板的每个孔中。将蛋白质反应板在200 × g下离心3分钟，使TCEP-琼脂糖沉淀。在预定的时间点，使用384通道移液工作站将蛋白质反应板中每孔3微升样品转移至CPM淬灭板中。

从孔板上部移除样品，避免吸到孔底的TCEP-agarose。将CPM淬灭板在室温下孵育一小时，用激发波长384纳米、发射波长470纳米的条件测定荧光强度。首先，使用目标蛋白进行定量不可逆拴系（qIT）实验，并将样品在CPM板中淬灭。

针对每次淬灭反应，计算Z'因子以评估检测的质量。然后计算第1列和第2列阴性对照孔以及第23列和第24列阳性对照孔的平均荧光值。将每个反应孔的荧光值相对于阳性和阴性对照的平均荧光值进行归一化，并分别绘制每种化合物与谷胱甘肽以及靶蛋白反应时修饰百分比随时间变化的曲线。

使用 GraphPad 将归一化的修饰百分比随时间变化的数据，按照公式 AE 的 KT C 次幂，对两个反应均拟合为单相指数衰减模型。利用各片段与蛋白质和谷胱甘肽反应的速率，计算每个片段的速率增强因子（REF）值。最后，为筛选命中片段，可设定 REF 阈值、任意的命中速率，或选择 REF 超出几何平均值三个标准差的片段。化合物 1 与靶蛋白上的半胱氨酸残基反应速率比与谷胱甘肽的反应速率快六倍，满足 REF 大于 3 的命中标准。

化合物二与谷胱甘肽相比，未表现出对目标半胱氨酸残基的加速反应速率，表明其缺乏有效的非共价相互作用，因此未被选为阳性命中化合物。