使用定量不可逆栓系测定法进行共价片段筛选
February 28th, 2025
定量不可逆栓系 （qIT） 测定是一种基于荧光的方法，用于识别选择性地与靶蛋白结合的共价片段。这里概述了描述 qIT 检测的详细方案，并包括示例结果。
我们在化学和生命科学系之间合作，为一系列抗癌药物靶点开发新型辅助反应性共价配体。希望这些分子将来能被用作治疗剂或可能用作化学探针。因此，有几种技术可用于筛选共价配体。
这些技术可以大致分为蛋白质组学技术，其中化合物与培养细胞一起孵育，质谱法用于确定分子标记的蛋白质，以及基于靶标的方法，其中亲电试剂库与单个蛋白质一起孵育。一个重大的实验挑战与共价配体的反应性有关。过度反应性分子在筛选分析中通常表现为命中，但并不合适，因为它们会非选择性地标记细胞中的许多不同蛋白质。
因此，在共价药物发现的每个步骤中，都要考虑活性化合物。因此，Imperial 的 Mann 和 Armstrong 小组开发了一种针对蛋白质靶标筛选亲电试剂的新方法，称为定量不可逆栓系或 qIT 检测。我们的方案提供了一种急需的新方法来针对蛋白质靶标筛选亲电试剂，该方法具有可扩展性，不需要质谱法，并控制化合物内在反应性。
首先，准备所有必需的储备溶液，并在实验前将它们在室温下放置 2 小时。用氩气对定量、不可逆栓系或 qIT 分析缓冲液进行脱气约 30 分钟。为了进行缓冲液置换，在离心过滤器装置中稀释过量脱气的 qIT 分析缓冲液的蛋白质溶液，并在 4 摄氏度下以 4， 000 G 离心 15 分钟以浓缩蛋白质。
然后在脱气的 qIT 检测缓冲液中将目标蛋白溶液稀释至 15 微摩尔的浓度，以制备 9 毫升溶液。将 TCEP-agraose 溶液、qIT 缓冲液和谷胱甘肽原液分配到 384 孔板的相应孔中。从片段文库板的每个相应孔中转移 1.8 μL，以制备化合物稀释板，将每种化合物在 qIT 检测缓冲液和 3% DMSO 中稀释至 1.5 毫摩尔。
使用 384 移液站将 20 μL 化合物溶液从化合物稀释板的每个孔转移到两个反应板中。首先，使用所需的蛋白质和谷胱甘肽设置定量不可逆栓系或 qIT 检测。将 500 微摩尔 CPM 原液分配到微量离心管中的 111.2 微升等分试样中，并在 20 摄氏度下储存。
解冻 CPM 原液后，将其添加到 40 mL qIT 检测淬灭缓冲液中，制备 1.4 μmol 溶液将 27 μL CPM 淬灭溶液分配到两个新鲜 384 孔板的每个孔中。将蛋白质反应板以 200 G 离心 3 分钟，以沉淀 TCEP 琼脂糖。在预定的时间点，使用 384 移液站将 3 μL 样品从蛋白质反应板的每个孔转移到 CPM 淬灭板。
从孔顶部取出样品，避免在底部吸出 TCEP-琼脂糖。将 CPM 淬灭板在室温下孵育 1 小时，并在 384 纳米激发和 470 纳米发射下测量荧光强度。首先，用所需的蛋白质进行定量不可逆的栓系或 qIT 测定，并在 CPM 板中淬灭样品。
对于每个淬灭，计算 Z prime 作为测定质量的量度。然后计算第 1 列和第 2 列中的阴性对照孔以及第 23 列和第 24 列中的阳性对照孔的平均荧光值。将每个反应很好地归一化为阳性和阴性对照的平均荧光值，并分别绘制与谷胱甘肽和目标蛋白反应的每种化合物的修饰百分比与时间的关系。
使用 GraphPad，使用方程将标准化修饰百分比与时间数据拟合到两个反应的单相指数衰减模型中，AE 与 KT C 的幂一起使用片段与蛋白质和谷胱甘肽反应的速率来计算每个片段的速率增强因子或 REF 值。最后，要选择 Hit fragments（点击片段），请设置 REF 阈值、任意 Hit rate（点击率），或选择 REF 比几何平均值大三个标准差的片段。化合物 1 与靶蛋白上的半胱氨酸残基反应的速率是谷胱甘肽的 6 倍，满足 REF 大于 3 的 Hit 标准。
与谷胱甘肽相比，化合物 2 与目标半胱氨酸残基的反应速率未加快，表明缺乏有效的非共价相互作用，因此未被选为苗头化合物。
概览
定量不可逆系留（qIT）分析是一种基于荧光的方法，旨在识别与目标蛋白选择性结合的共价碎片。本文概述了qIT分析的详细协议，包括示例结果以说明其应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 共价药物发现
- 基于荧光的分析
- 蛋白-配体相互作用
背景
- 开发用于抗癌靶标的反应性共价配体。
- 由于反应性而导致的共价配体筛选挑战。
- 现有方法包括蛋白质组学技术和基于靶标的方法。
- 需要一种可扩展的方法来控制化合物反应性。
研究目的
- 引入qIT分析作为筛选亲电试剂针对蛋白质靶标的新方法。
- 提供不需要质谱的协议。
- 提高药物发现中共价配体的选择性。
使用的方法
- 准备原料溶液和qIT分析缓冲液的脱气处理。
- 蛋白浓度和在qIT分析缓冲液中稀释。
- 使用384孔板进行化合物稀释和反应设置。
- 测量荧光强度以评估化合物反应性。
主要结果
- 根据其与目标蛋白的反应速率识别命中碎片。
- 计算速率增强因子（REF）以确定选择性。
- 示例结果展示了qIT分析的有效性。
- 比较化合物与谷胱甘肽和目标蛋白的反应性。
结论
- qIT分析为筛选亲电试剂提供了一种稳健的方法。
- 它允许识别选择性共价配体。
- 该方法可以推进共价药物发现领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Covalent fragment screening using the quantitative irreversible tethering (qIT) assay addresses a critical challenge in early drug discovery: distinguishing selective covalent binders from broadly reactive compounds. By normalizing for intrinsic compound reactivity and providing quantitative selectivity metrics, qIT enhances predictive confidence at the hit identification and triage stage. This capability supports risk-adjusted portfolio advancement and reduces downstream attrition due to non-selective reactivity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of covalent ligand selectivity for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying target-specific reactivity versus off-target background.
- Facilitates prioritization of fragments with favorable selectivity profiles for further development.
Screening & Assay Development
- Delivers a scalable, fluorescence-based assay platform for high-throughput screening of electrophilic libraries.
- Standardizes quantitative measurement of reaction rates with both target proteins and glutathione controls.
- Enables reproducible identification of selective hits based on rate enhancement factor (REF) thresholds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early hit selection with translational requirements by excluding broadly reactive or promiscuous compounds.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by generating robust, quantitative selectivity data.
- Reduces risk of late-stage failure due to non-specific covalent modification in complex biological systems.
Pipeline & Workflow Integration
The qIT assay integrates at the hit identification and validation stage, bridging early discovery and lead optimization for covalent ligand programs.
- Discovery Biology: Quantifies selective covalent engagement, supporting hypothesis-driven target validation.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible, and quantitative outputs for compound triage.
- Analytics: Generates REF values and normalized kinetic data to compare compound selectivity.
- Translational Research: Informs preclinical candidate selection by excluding non-selective electrophiles.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse protein targets and electrophilic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hit selectivity and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes and scales covalent screening workflows without mass spectrometry.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by prioritizing selective hits.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage attrition from non-selective reactivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence-based assay setup and kinetic data analysis.
- Needs access to 384-well plate handling and compatible fluorescence plate readers.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and normalization procedures.
- Adaptable to various protein targets and electrophilic fragment libraries.
- Dependent on robust statistical analysis for hit threshold determination and data quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:16
Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
2:48
CPM-Quenching to Quantify the Amount of Unreacted Thiol Remaining in the Protein and Glutathione Reaction Plates of Quantitative-Irreversible Tethering Assay
4:18
Data Analysis and Hit Selection After the Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
