植入物表面 M1 和 M2 人单核细胞衍生巨噬细胞的极化和表征

在这里，我们提出了一个详细的方案，用于评估植入物表面在 体外的免疫调节潜力，旨在提高当前方案的可靠性和可重复性并促进进一步的研究。使用血液单核细胞衍生的巨噬细胞监测分泌细胞因子谱、 mRNA 表达和细胞表面标志物，以研究在钛上培养的巨噬细胞极化。

该程序的主要目标是实施一个全面的方案，用于在不同植入体表面培养和表征微噬细胞的亚型以及微噬细胞亚型的表征。作为该表征的一部分，采用了多种方法，包括 qRT-PCR、EISA 和 CLSM，以确定基因表达谱、分泌蛋白和细胞表面标志物。结果显示了所实施的方案在极化微噬细胞和植入物表面方面的实用性和有效性，并根据基因表达、分泌蛋白和细胞表面标志物准确识别它们。

此外，这些标志物描述了反抗一致和特异性的表达模式，可用于区分 MDM 的不同亚型。总体而言，该研究将有助于免疫调节材料的开发和设计，以改善和促进成功的组织再生过程，防止与植入物相关的慢性炎症，并增强成功的植入物整合。首先，将分离的人外周血单核细胞重悬于 15 mL 预热的单核细胞附着培养基中，并将它们转移到 T-75 细胞培养瓶中。

将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 90 分钟以进行粘附。孵育后，弃去上清液，用预热的 RPMI 1640 培养基洗涤细胞一次，其中补充有 10% FBS 和 1% 青霉素和链霉素，轻轻倾斜培养瓶以去除非贴壁或松散粘附的细胞。向贴壁细胞中加入 15 mL，每毫升含有 10 ng 巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基。

并孵育 6 天以促进分化。分化后，从培养瓶中取出培养基，用 10 mL PBS 洗涤细胞 5 分钟。要分离贴壁细胞，请加入 10 mL 预热的细胞分离溶液并孵育 30 分钟。

然后，轻轻敲击培养瓶以释放细胞并将其转移到 50 mL 试管中。要分离剩余的细胞，请在培养瓶中加入 10 ml PBS 并刮除细胞。将分离的细胞转移到 50 毫升试管中。

将分离的细胞悬液以 300 g 离心 10 分钟，弃去上清液，然后将细胞重悬于 5 mL 预热的完全培养基中。使用台盼蓝染色，在血细胞计数器上计数细胞以确定细胞数量和活力。通过将细胞数量调整为每 1 毫升完全培养基 160， 000 个细胞来制备细胞悬液。

接下来，在 70% 乙醇中超声清洁生物材料光盘 5 分钟，然后在 70% 乙醇中灭菌 30 分钟。干燥钛盘后，将它们置于未经处理的 24 孔板中，并向每个孔中加入 1 毫升制备的细胞悬液。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时，以获得 M0 巨噬细胞。

为了获得 M1 极化巨噬细胞，将干扰素 γ 和脂多糖添加到 24 孔板的孔中。对于 M2 极化，添加白细胞介素 4 和白细胞介素 13。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时以诱导极化。

从人外周血单核细胞获得极化单核细胞衍生的巨噬细胞后，将细胞上清液收集在 1.5 毫升试管中。将钛盘转移到新的 24 孔板上。将细胞上清液以 300 g 离心 5 分钟，然后将上清液转移到新试管中。

根据制造商提供的具体说明，在 450 纳米处测量细胞因子和趋化因子。使用标准曲线计算分泌的细胞因子或趋化因子的浓度。使用二辛可宁酸蛋白测定试剂盒测量总蛋白量。

将分泌蛋白的浓度标准化为毫克总蛋白。在 800 微升 PBS 中洗涤极化巨噬细胞两次。将圆盘在 400 μL 固定缓冲液中于室温下孵育 20 分钟。

去除固定缓冲液后，在 400 微升 PBS 中洗涤圆盘 3 次。现在，将圆盘与 400 μL 封闭缓冲液一起孵育 30 分钟，以封闭非特异性结合位点。弃去封闭缓冲液，用在 400 μL 染色缓冲液中稀释的一抗孵育圆片 1 小时。

1 小时后，去除一抗，并用 400 μL 洗涤缓冲液洗涤圆盘 3 次。为用染色缓冲液稀释的标记二抗添加荧光，并在室温下避光孵育 1 小时。孵育后，在洗涤缓冲液中洗涤样品 3 次，每次 3 分钟。

加入 10 毫摩尔 DRAQ5 的 PBS 溶液，并在避光中孵育 15 分钟。然后，去除上清液并用 PBS 洗涤圆盘一次。加入一滴封固剂，五分钟后，盖上盖玻片，让样品干燥 1 小时。

干燥后，用透明指甲油密封边缘。为了获得细胞的概览，请在 25 倍放大倍率下在共聚焦激光扫描显微镜上对样品进行成像。将放大倍数更改为 63X 以确定表面标记的结构和定位。

原代单核细胞衍生的巨噬细胞在钛表面成功极化为 M1 和 M2 巨噬细胞，其中 CCR7 在 M1 巨噬细胞中表达更强烈，CD209 在 M2 巨噬细胞中表达更强烈。qRT-PCR 分析显示，原代单核细胞衍生的巨噬细胞在钛和盖玻片表面上成功极化，M1 的 CCR7 和 TNF-α 高表达，M2 的 CD209 和 CCL13 高表达。高水平的炎性 TNF-α 细胞因子和 CCL13 趋化因子证实了蛋白质水平的 M1 和 M2 极化。