酵母全细胞中线粒体呼吸的定量分析

线粒体呼吸在大多数情况下是细胞能量的主要来源，也是细胞代谢和功能状态的重要指标。因此，线粒体功能界定了细胞的生物能量状态。本方案描述了一种将活细胞中线粒体呼吸作为生物能量参数进行定量的技术。

本方案中描述的技术有助于我们阐明某些多酚类物质（如白藜芦醇和柯伊利素）的生物能量学机制。该技术也可作为测量戊糖代谢的工具，包括PTSPTs的代谢，并揭示“cab树”和“ground work”效应背后的生物能量学变化。我们致力于解析细胞如何获得某些表型特征（如“cab树”和“ground work”效应），这些特征伴随着细胞生物能量学的显著改变。

线粒体呼吸是阐明这一代谢现象背后分子机制的重要工具。首先，取一支含有3毫升YPD培养基的10毫升玻璃试管，接入250微升甘油保存的酵母细胞。将试管置于30摄氏度条件下，以每分钟200转的恒定振荡速度过夜培养。

然后，使用无菌接种环，将10毫升玻璃试管中培养的酵母菌在YPD琼脂平板上划线。将培养皿置于30摄氏度培养，直至出现单菌落。为制备预接种培养物，取2至3个单菌落酵母接种于3毫升含2%葡萄糖的YPD培养基中，并进行培养。

然后在500毫升锥形瓶中加入100毫升无菌合成完全培养基。以600纳米处初始光密度为0.1的条件，将过夜预接种的酵母培养物接种至培养基中。加入化学处理物（如100 µM白藜芦醇），以检测线粒体呼吸作用。

接下来，将处于对数中期的细胞倒入一个预先称重的空的15毫升锥形管中，在4,000 G条件下离心5分钟。弃去上清液后，用25毫升去离子水将沉淀洗涤三次。称量含有洗涤后沉淀的锥形管，通过减去空管的重量获得湿重。

然后将洗涤后的沉淀重悬于2毫升去离子水中。首先，获取经适当药物（如白藜芦醇）处理的酵母细胞。将5毫升10毫摩尔MES-TEA缓冲液和50毫克湿细胞加入到偏振接枝室中。

轻柔地放置克拉克型氧电极，确保不产生气泡。打开YSI 5300A监测仪和数据采集计算机。将通道一的设置旋钮调至“空气”位置，并使用通道一校准旋钮将通道一调整至100%。

开始记录数据，并使用计时器开始计时。使用色谱注射器将可氧化底物加入至终浓度为 10 毫摩尔，保持密闭室封闭并持续搅拌。然后，使用色谱注射器加入寡霉素，使其在氧电极室中的终浓度为 0.01 毫摩尔，并记录氧气百分比消耗量。

类似地，在氧电极室中加入CCCP，使其终浓度为0.015毫摩尔，以测定最大呼吸能力。接着，加入电子传递链抑制剂——丁氧基三氟丙酮（tooth and oil triflurositone）或TTFA，浓度为1毫摩尔，随后加入抗霉素A，浓度为1毫克/毫升。在进行下一个碳源实验前，依次用70%乙醇和去离子水各清洗氧电极室三次。

首先，使用不同碳源和对照组对酵母细胞进行耗氧量测定。在统计分析软件中创建一个新的项目文件，在创建部分选择 XY。然后在数据表部分选择输入或导入数据到新表格中。

在选项部分，选择 X 子部分和 Y 子部分中的数值。单击以在并列的子列中输入三个重复值。将时间数据输入 X 列，将空气百分比数据输入 Y 列。

要执行线性回归分析，请点击菜单栏中的“analyze”（分析），在“analysis”（分析）下选择“XY analysis”（XY 分析）中的“simple linear regression”（简单线性回归），然后点击“okay”（确定）。从数据表的结果部分获取斜率值。将计算得到的斜率值复制到数据表中。

用可氧化底物、寡霉素和CCCP的斜率值减去呼吸抑制剂混合物的斜率值，以排除其他耗氧来源。然后将斜率值乘以237微摩尔氧气，该数值代表在此条件和缓冲液中氧气的溶解度。根据时间轴的绘图比例，将结果转换为每分钟微摩尔氧气。

将结果除以50，代表实验中使用的细胞毫克数。最终，氧消耗量表示为每分钟每毫克细胞所消耗的氧微摩尔数。在0.5%葡萄糖中培养的细胞，其基础呼吸、ATP偶联呼吸和最大呼吸能力的氧消耗量均显著高于在5%葡萄糖中培养的细胞。

在0.5%葡萄糖培养的细胞中，槲皮素显著降低了线粒体呼吸作用，影响了基础呼吸、ATP偶联呼吸以及最大呼吸。另一方面，在5%葡萄糖培养的细胞中，槲皮素对线粒体呼吸作用无显著影响。