Name: 基于琼脂糖的模型生态系统，用于在甲烷-氧反梯度中培养嗜甲烷菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 了解基于琼脂糖的模型生态系统培养嗜甲烷菌的方法，该方法模拟甲烷-氧反梯度自然环境。此技术可揭示标准实验室条件下缺失的细菌表型，并关联其遗传决定因素。

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本工作得到了犹他大学化学系启动资金以及美国国家科学基金会（NSF）CAREER 奖 #2339190 的资助。我们感谢 Puri 实验室成员提供的有益讨论。我们感谢犹他大学 Rachel Hurrell 在流式细胞术实验初期提供的指导。

本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。
1. 梯度注射器的制备与挤出
注意：梯度注射器的制备应采用无菌技术进行。
<ol>
	<li>取若干个在平板上新鲜培养的 Methylomonas sp. LW13 菌落，接种于 18 mm × 150 mm 玻璃试管中的 6 mL 硝酸盐矿物盐（NMS）培养基中。用血清瓶塞和铝制压盖密封试管，并用注射器向管内加入甲烷，使最终气相环境为 50%（v/v）甲烷与空气混合。在室温下以 200 rpm 振荡培养该悬浮液，直至出现浑浊（约一天）。</li>
	<li>将液体培养物按 1:10 比例传代至新鲜培养基中。继续培养甲烷氧化菌至对数生长期（OD600 约为 0.5），并调整菌液浓度至 OD600 = 1.0。</li>
	<li>准备注射器：取出配套活塞，并将其置于无菌容器中。在注射器上连接无菌聚四氟乙烯（PTFE）滤膜头，并将其倒置插入标准试管架中，使滤膜头朝下。</li>
	<li>对于每个 10 mL 注射器，在无菌锥形管中充分混合步骤 1.2 中的 1 mL 菌液、5 mL NMS 培养基和 4 mL 熔融琼脂糖（0.5% m/v，冷却至 55 °C）。上述体积可按比例放大，以同时填充多个注射器。</li>
	<li>缓慢倾倒或使用移液管将混合液加入各注射器中，至 8 mL 刻度线处。让注射器内的琼脂糖凝固（约 15 分钟），然后用无菌 20 mm 丁基橡胶塞封口。用实验室胶带将橡胶塞固定在注射器上，并标记注射器内容物。</li>
	<li>为向注射器顶空补充甲烷，先用一个大容量（60 mL）注射器吸取 100% CH4，并连接带有 PTFE 滤膜头（0.2 µm，25 mm）的无菌针头（23 G）。将大注射器刺穿橡胶塞，同时用另一根无菌针头刺穿塞子，作为气体出口。</li>
	<li>推动大注射器的活塞，使 20 mL 100% CH4 流经顶空进行冲洗；当大注射器中剩余 1–2 mL CH4 时，及时拔出出口针头，以防止氧气经出口针头倒吸入内。</li>
	<li>将注射器置于 18 °C 培养，每日重复步骤 1.6 和 1.7，以补充甲烷。</li>
	<li>为挤出琼脂糖，将 PTFE 滤膜头更换为无菌 23 G 针头，并将橡胶塞替换为配套的注射器活塞。缓慢推动活塞，以 1 mL 为增量，将琼脂糖逐份挤入独立的无菌 1.5 mL 微量离心管中。</li>
</ol>
2. 确定逆梯度气体浓度
<ol>
	<li>测量溶解氧梯度
	<ol>
		<li>使用剃刀刀片靠近聚四氟乙烯（PTFE）滤膜处横向切割已填充琼脂糖的注射器（按步骤1.1–1.8制备）。将切开的注射器固定在注射泵上，并朝向克拉克型微电极放置，使注射器开口端对准电极尖端。</li>
		<li>调节注射泵参数，使注射器以1 mL/min（0.6 cm/min）的速度向微电极移动；一旦注射泵开始移动，立即在Unisense Logger软件中开始记录溶解氧测量值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量甲烷梯度
	<ol>
		<li>挤出前立即用连接23 G针头的单向旋塞替换注射器滤膜端，并迅速将橡胶塞更换为注射器推杆。将八份1 mL琼脂糖等分试样加入预先抽真空的12 mL密封顶空瓶中，于室温下平衡1小时。</li>
		<li>通过短暂打开后立即重新密封顶空瓶，或穿刺后迅速拔出针头的方式使样品瓶内外压力与大气压平衡。使用气密注射器将500 µL顶空瓶上部气体注入配备火焰离子化检测器的气相色谱仪（GC-FID）中。利用CH4标准气体建立校准曲线，将峰面积（pA*min）转换为µmol/L。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 梯度注射器中的细胞计数
<ol>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>按照步骤1.9所述，从接种了野生型或突变型LW13的梯度注射器中挤出1 mL琼脂糖片段。同时，准备并挤出无细胞的无菌注射器中的琼脂糖，作为阴性对照。</li>
		<li>向所有挤出的琼脂糖样品中加入0.75 mL的0.85%（m/v）NaCl水溶液，并通过涡旋振荡均质化。进一步将样品按1:10稀释，即转移100 µL至新的微量离心管中，并加入900 µL盐溶液。</li>
		<li>加入3 µL SYTO9与碘化丙啶染料的1:1混合液，然后在室温避光孵育15分钟。为确定每毫升琼脂糖中的细胞数，将微球计数珠悬浮液在水浴中超声处理5分钟。然后，在流式细胞分析前向每个样品中加入10 µL该悬浮液。</li>
		<li>使用流式细胞仪10,11分析样品，参数设置如下：以绿色荧光触发，流速为10 µL/s，颗粒分析速率低于1,000颗粒/s。
		<ol>
			<li>比较无细胞对照样品与接种琼脂糖样品的SSC vs. FITC点图，绘制“细菌事件”电压门控，以排除背景琼脂糖颗粒。此外，绘制微球计数珠的电压门控，该门控应在各样品间保持一致。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为确定梯度注射器中每个琼脂糖片段内的细胞浓度，使用以下公式，注意上述方案的稀释因子为17.7275，且一个微球珠的体积为10-6 mL。 
		<img alt="细菌浓度公式，每毫升细胞数计算，实验室定量方法。" src="/files/ftp_upload/67191/67191eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>在梯度注射器内计数菌落形成单位
	<ol>
		<li>将1 mL琼脂糖片段分别挤入无菌的2 mL微量离心管中，加入800 µL NMS，并涡旋振荡10秒以利于移液。</li>
		<li>在无菌的96孔板中每孔加入180 µL NMS。在第一列各孔中加入20 µL稀释后的琼脂糖样品，并用移液器吹打混匀。</li>
		<li>使用多通道移液器，通过将20 µL从第一排孔转移至第二排孔并吹打混合10次，进行十倍系列稀释。重复此过程直至板的最后一排。</li>
		<li>标记含有NMS琼脂或所选培养基的方形网格平板。使用多通道移液器，从96孔板的一列中取5 µL点样至琼脂平板上。根据琼脂平板的大小，可在同一平板上点样多个列。</li>
		<li>在含40%甲烷的空气中孵育平板，并于18 °C培养。2–3天后计数细菌菌落，并确定每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生物分子检测实验
<ol>
	<li>多糖测定
	<ol>
		<li>将1 mL琼脂糖片段分别挤入2 mL微量离心管中，加入1 mL 1% (m/v) 的Na2CO3水溶液。将样品在80 °C加热30分钟，每5–10分钟涡旋混匀一次，随后在4 °C下以4,000 × g 离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液，加入三倍体积的100%乙醇，于20 °C孵育至少2小时（或过夜）。</li>
		<li>在4 °C下以16,100 × g 离心30分钟，收集乙醇沉淀的多糖。弃去上清液，将沉淀在空气中干燥。用100 µL去离子水重悬沉淀。</li>
		<li>采用苯酚-硫酸比色法测定各琼脂糖片段的相对多糖含量12,13。在透明的96孔板中，将50 µL重悬的提取物与150 µL浓硫酸及30 µL 5% (v/v) 苯酚水溶液混合。</li>
		<li>使用酶标仪在490 nm处测定吸光度，并将每个琼脂糖片段的相对多糖含量计算为距离聚四氟乙烯（PTFE）滤膜最近的琼脂糖片段吸光度的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质测定
	<ol>
		<li>将琼脂糖分别挤入1.5 mL微量离心管中，将每份100 µL等分试样转移至玻璃试管中。</li>
		<li>采用BCA蛋白检测试剂盒的试管法测定总蛋白浓度。以无菌注射器挤出的琼脂糖作为稀释液，配制牛血清白蛋白（BSA）标准品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胞外DNA测定
	<ol>
		<li>将琼脂糖分别挤入1.5 mL微量离心管中，将每份20 µL转移至0.2 mL微量离心管中。</li>
		<li>按照生产商说明书，使用市售的1x dsDNA高灵敏度检测试剂盒测定DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. RNA 提取
<ol>
	<li>在800 mL无RNase的水中加入以下成分配制提取缓冲液：2.0 g CTAB、2.0 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP 40）、81.8 g NaCl、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）和20 mM EDTA。加水定容至1 L，高压灭菌后于4 °C保存。</li>
	<li>将配制好的提取缓冲液分装，使用前加入β-巯基乙醇至终浓度为1%（v/v）。用水浴或加热块将缓冲液预热至65 °C。</li>
	<li>按照步骤1.9的操作，将琼脂糖挤入多个无RNase的2 mL微量离心管中，每管1 mL，从而将每个梯度注射器分成1 mL的区段。</li>
	<li>将样品在21,000 x g、4 °C条件下离心15分钟，弃去上清液，样品保持在冰上。</li>
	<li>向每1 mL挤出的琼脂糖沉淀中加入600 µL预热的提取缓冲液。加入约200 µL氧化锆/二氧化硅珠，使用珠磨机在30 Hz/s条件下均质化3分钟，中途暂停一次，将样品置于冰上冷却2分钟。</li>
	<li>将样品在15,000 x g、4 °C条件下离心2分钟以减少泡沫。向管中加入600 µL氯仿:异戊醇（24:1），涡旋10秒进行提取。</li>
	<li>将样品在15,000 x g、4 °C条件下离心8分钟。小心转移上层水相至新的无RNase微量离心管中，向转移后的上层水相中加入600 µL氯仿:异戊醇（24:1），涡旋10秒。</li>
	<li>将样品在15,000 x g、4 °C条件下离心8分钟，将新的上层水相转移至新的无RNase微量离心管中。向上层水相中加入等体积的异丙醇，在-20 °C孵育数小时。可选：样品可在-20 °C过夜孵育。</li>
	<li>通过在16,100 x g、4 °C条件下离心30分钟收集含RNA的沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，用300 µL以无RNase水配制的冷75%（v/v）乙醇洗涤沉淀，在16,100 x g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>按照步骤5.10再次洗涤沉淀。</li>
	<li>去除乙醇上清液后，将沉淀在室温下风干15分钟。将沉淀溶解于100 µL无RNase水中。</li>
	<li>根据制造商说明书，在37 °C用DNase I处理样品30分钟。</li>
	<li>通过加入300 µL酸性苯酚:氯仿:IAA（125:24:1，pH 4.5）使DNase I失活。涡旋10秒，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在16,100 x g、4 °C条件下离心5分钟，将上层水相转移至新的无RNase微量离心管中保留。</li>
	<li>可选：将所有重复注射器中相同区段的RNA合并，即将各上层水相合并至一个锥形管中。</li>
	<li>向含RNA的上层水相中加入等体积的异丙醇，并加入7.5 M LiCl至终浓度为0.8 M，反复倒置混匀。</li>
	<li>在-20 °C孵育数小时。可选：样品可在-20 °C过夜孵育。</li>
	<li>将样品在16,100 x g、4 °C条件下离心15分钟，小心弃去上清液。用冷70%（v/v）乙醇（以无RNase水配制）洗涤含RNA的沉淀两次，每次在16,100 x g、4 °C条件下离心5分钟，然后弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀在室温下风干10分钟，重悬于50 µL无RNase水中。将RNA样品储存于-80 °C。</li>
	<li>可选，取决于RNA质量：可使用RNA纯化试剂盒对样品进行再次纯化，以去除小分子RNA（<200 nt）。</li>
	<li>为确认RNA样品不含残留DNA，取1 µL纯化后的RNA作为模板，使用通用细菌16S rRNA基因引物27F/1492R进行PCR扩增。另设两个PCR反应，分别加入1 µL基因组DNA（1:100稀释）或无核酸酶水，作为阳性对照和阴性对照。</li>
	<li>使用凝胶电泳在1% TBE琼脂糖凝胶上分析PCR产物14。 
	注意：无DNA污染的RNA样品应在样品泳道中无条带出现。若RNA样品显示存在DNA污染，需从步骤5.13开始重新处理样品。RNA可用于下游分析，也可选择性地通过测定RNA完整性数值（RIN）来评估其完整性。</li>
</ol>

Modeling Methanotroph Niches – The Gradient Syringe Model Ecosystem

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<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methanotrophic+bacterium+to+enable+methane+removal+for+climate+mitigation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A methanotrophic bacterium to enable methane removal for climate mitigation.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (35), e2310046120(2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

甲烷氧化菌培养方法 
数十年来，研究人员一直致力于研究甲烷氧化菌的生理特性、其在自然环境中的个体与群落行为，以及其在工业应用中减缓甲烷排放的潜力。在这些研究中，大部分实验均采用均质的浮游培养体系，导致其空间环境特征的缺失。梯度注射器模型生态系统被开发出来，旨在实验室中模拟自然甲烷氧化菌生境中典型的甲烷-氧气逆向梯度，使研究人员能够在更接近这些微生物自然演化环境的条件下研究其生长特性。
在过去的30年中，研究人员已采用多种方法在实验室中重现甲烷-氧气逆向梯度，其主要目标通常是从未纯化的甲烷氧化菌群落中分离并分类甲烷氧化菌。这些方法可分为两类，均涉及使用甲烷和氧气相对分布的腔室：一种是将相对未受扰动的土壤样品置于膜上16,17,18，另一种是将少量土壤或纯细菌培养物接种至琼脂糖中的最低限度培养基中7,8,19。本文所述的梯度注射器法结合了Dedysh及其同事所采用的基于注射器的方法9，以及Amaral与Knowles8和Schink及其同事7早期研究中甲烷氧化菌的培养技术。后者的方法奠定了在甲烷-氧气逆向梯度条件下培养甲烷氧化菌的基础，并在琼脂糖塞两侧持续通入甲烷和氧气。尽管该方法可提供更稳定的环境，但同时也增加了实验装置的复杂性，并需要专用的气体供应系统。
相比之下，本文所述的梯度注射器依赖于每日冲洗注射器以提供新鲜的甲烷，每个注射器的冲洗过程耗时不到一分钟，同时通过无菌聚四氟乙烯（PTFE）滤膜尖端持续获取大气中的氧气。这种更简单的方法可能促进该模型生态系统被更广泛地用于在空间分辨的条件下研究甲烷氧化菌。所描述的实验方案还详细说明了可直接在半固体琼脂糖中孵育的细菌上进行的化学和分子水平分析。因此，在分析前无需将细菌从琼脂糖基质中切除并在体外培养，从而在取样时保留了原有的气体梯度条件。
关于实验方案的说明 
由于细菌在聚丙烯容量注射器内培养，研究人员可利用配套的注射器推杆，在保持注射器筒内剩余琼脂糖基质空间完整性的前提下，精确且可重复地切割琼脂糖凝胶块。若无注射器本身密闭结构的设计优势，琼脂糖凝胶块则需从注射器筒中取出后再进行切片，这将导致琼脂糖片段体积的不确定性，并向大气中释放无法量化量的甲烷和溶解氧。通过无菌针头挤出琼脂糖可简化样品制备过程，并有助于在不剪切细菌细胞的情况下实现挤出片段的均一化。该方法使研究人员能够将每个接种后的梯度注射器分成至少八个琼脂糖片段，并对在不同氧气和甲烷浓度下生长的甲烷氧化菌开展平行实验。
在优化高多糖含量琼脂糖的RNA提取过程中发现，常用的试剂如硫氰酸胍和TRIzol会导致琼脂糖发生凝胶化，从而堵塞纯化柱并阻碍离心沉淀。此外，RNA得率和质量较低也是一个问题，因为大分子多糖可能包裹核酸，而小分子多糖则可能与RNA共沉淀20。因此，本研究采用含有阳离子表面活性剂CTAB的提取缓冲液，CTAB可溶解脂质膜20；同时加入NaCl，防止CTAB与核酸形成复合物，使核酸得以沉淀，而多糖则保留在溶液中21。在CTAB缓冲液中添加β-巯基乙醇以使RNase失活。在RNA-seq实验中，额外增加了一个基于柱子的纯化步骤，用于在建库前去除小分子（&#60;200个核苷酸）RNA。
局限性与注意事项 
尽管NMS和琼脂糖为甲烷氧化菌的培养提供了最低限度的培养基质，但本文所述的梯度注射器仅能重现甲烷氧化菌生境中的气体梯度，而无法模拟这些环境中存在的其他梯度，例如痕量金属22、盐度23或其他营养物质24。未来有可能将这些梯度整合到类似的系统中。此外，注射器的体积（8 mL琼脂糖）限制了每支注射器所能获得的总生物量，因此某些分析需要合并多支注射器的样品（如步骤5.16所述）。尽管手持式注射器可方便地将琼脂糖分割为1 mL的等份，但其尺寸也使得顶空体积仅约为4 mL，从而限制了可供培养微生物利用的大量甲烷储存量。由于甲烷氧化速率与好氧甲烷氧化菌的生长速率成正比25，建议每日补充顶空中的甲烷。尽管如此，仍可能出现甲烷供应受限的时段，但这些时段在实验室中具有可重复性，且可能模拟了自然环境中存在的实际情况。
使用梯度注射器时，由于琼脂糖多糖的存在，需要对用于分析在此系统中培养的甲烷氧化菌的检测方法进行一些调整。例如，在需要转移少量挤出琼脂糖的实验方案中，必须进行多次稀释，并在每次稀释之间充分均质化，以确保移液的准确性。此外，在多糖测定等情况下，琼脂糖基质本身含有的多糖会与硫酸-苯酚试剂发生反应，因此必须设置无菌、无细胞的琼脂糖阴性对照。早期尝试通过添加能够水解琼脂糖的酶——β-琼脂酶来缓解这些问题，但未获成功，且为生物学实验引入了未知变量。通过使用多个技术重复、充分稀释、均质化以及设置对照，可有效克服琼脂糖基质带来的大多数挑战。
应用 
除了单菌株研究外，梯度注射器还可支持多种菌株的共培养，并可使用土壤代替纯细菌培养物作为接种源。通过采用不同的气体底物（如 H2 或 CO）替代甲烷，梯度注射器模型生态系统的简单设计也可适用于培养存在于缺氧-有氧环境界面的其他类型微生物。总之，这种简单且具有空间分辨能力的模型生态系统使研究人员能够研究缺氧-有氧微生物独特的生理特性及代谢适应机制，并可用于关联基因与生物体表型。

生活在缺氧-有氧界面的微生物通常发挥着重要的生态作用1。好氧甲烷氧化细菌（甲烷氧化菌）便是一个例子，它们存在于土壤和沉积物中甲烷与氧气的逆向梯度环境中2。这些微生物具有独特的代谢和生理特征，使其能够利用其所处环境中的气体梯度，数十年来一直是持续研究的对象3,4,5。目前，大多数关于甲烷氧化菌及其群落的研究均基于均质的浮游培养体系，而这类体系往往无法模拟其天然微生物生境中存在的空间和化学梯度。这一局限性阻碍了我们对微生物生理学的理解，也限制了将基因组信息与表型特征相联系的能力。
本方案介绍了一种简单且基于实验室的模型生态系统，可为研究特定的甲烷氧化菌（如Methylomonas sp. 菌株LW13）以及直接从环境土壤样品中获取的甲烷氧化微生物群落提供可重复的实验条件。重要的是，在梯度注射器中培养可产生与均质浮游培养中不同的、依赖于特定梯度的表型特征6，凸显了该系统揭示甲烷氧化菌生理学新特性的能力。该方法借鉴了此前已发表的模型生态系统7,8,9，梯度注射器是一种简化的技术，可用于获取采用此方法培养的微生物的化学与分子信息。
已对遗传学、化学和分子分析的既定方案进行修改，使其能够可靠地应用于在半固体琼脂糖基质中培养的微生物。这些方法也可用于分析在其他基于半固体琼脂糖体系中生长的细菌，例如细菌软琼脂泳动实验所用体系。将这些分析方法拓展至具有空间分辨能力的环境中，可能为在更接近生态真实性的条件下研究微生物生命活动开辟新的途径。

<table><tbody><tr><td>1% 气体混合物分析标准品</td><td>Supelco</td><td>22561</td><td>各组分在氮气中的浓度为1%：一氧化碳、二氧化碳、氢气、甲烷和氧气</td></tr><tr><td>100% 甲烷</td><td>Airgas</td><td>ME CP300</td><td>化学纯级</td></tr><tr><td>15 ppm 气体混合物分析标准品</td><td>Supelco</td><td>23470-U</td><td>各组分在氮气中的浓度为15 ppm：甲烷、乙烷、乙烯、乙炔、丙烷、丙烯、丙炔和正丁烷</td></tr><tr><td>1x 硝酸盐矿物盐&amp;nbsp;</td><td></td><td>见下方CAS编号</td><td>将以下物质溶解于Mili-Q水中并进行高压灭菌：&amp;nbsp; 0.2 g/L MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.2 g/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、1 g/L KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 和 30 &amp;mu;M LaCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;。使用前加入微量元素至终浓度为1X，并加入磷酸盐缓冲液（pH 6.8）至终浓度为5.8 mM。</td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305194</td><td>无菌，鲁尔锁型</td></tr><tr><td>500x 微量元素溶液</td><td></td><td>见下方CAS编号</td><td>将以下物质溶解于Milli-Q水中：1.0 g/L Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA、2.0 g/L FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.8 g/L ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.03 g/L MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.03 g/L H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;、0.2 g/L CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.6 g/L CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.02 g/L NiCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 和 0.05 g/L Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O。</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>CELLTREAT</td><td>229596</td><td>无菌</td></tr><tr><td>酸性酚:氯仿:异戊醇（125:24:1）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9720</td><td>&amp;nbsp;pH 4.5</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160</td><td>分子生物学级，CAS 9012-36-6</td></tr><tr><td>铝制压盖密封垫</td><td>VWR</td><td>30618-460</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>珠磨机</td><td>Qiagen</td><td>9003240</td><td>TissueLyser III</td></tr><tr><td>丁基橡胶塞</td><td>Chemglass Life Science</td><td>50-143-854</td><td>20 mm，蓝色</td></tr><tr><td>氯仿:异戊醇（24:1）</td><td>Millipore Sigma</td><td>25666</td><td>BioUltra，适用于分子生物学</td></tr><tr><td>克拉克型O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;微电极</td><td>Unisense</td><td>OX-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC处理水</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0601</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（Ambion）</td><td>Invitrogen</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>CytoFLEX</td></tr><tr><td>气相色谱仪（火焰离子化检测）</td><td>Agilent</td><td></td><td>6890N</td></tr><tr><td>气密分析用注射器</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>1750 TLL</td></tr><tr><td>气密分析用注射器针头</td><td>Hamilton</td><td>7729-07</td><td>22 G，金属接头针头，2英寸，5号针尖</td></tr><tr><td>气密小瓶</td><td>Labco</td><td>938W</td><td>Exetainer小瓶：12 mL，圆底</td></tr><tr><td>玻璃培养管</td><td>Bellco Glass</td><td>2048-00150</td><td>18 x 150 mm</td></tr><tr><td>LiCl沉淀溶液（7.5 M）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td>单向旋塞阀</td><td>VWR</td><td>MFLX30600-00</td><td>入口端口：雌性鲁尔接头，出口端口：雄性鲁尔锁接头</td></tr><tr><td>方形培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td>100 x 100 mm</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，0.2 M（pH 6.8）</td><td></td><td>见下方CAS编号</td><td>将以下物质溶解于Milli-Q水中并进行高压灭菌：12.24 g/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、26.29 g/L Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PTFE注射器滤头</td><td>Thermo Scientific</td><td>03-050-469</td><td>疏水性，孔径：0.2 &amp;micro;m，直径：4 mm</td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA 高灵敏度检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>血清瓶塞</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-302</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td>鲁尔锁型，10 mL，一次性使用，无菌</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>1000-US</td><td>NE-1000 单通道可编程</td></tr><tr><td>SYTO9、碘化丙啶、微球</td><td>Invitrogen</td><td>L34856</td><td>LIVE/DEAD BacLight 细菌活力检测试剂盒</td></tr><tr><td>氧化锆/二氧化硅珠</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101z</td><td>直径0.1 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;CAS编号&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>7774-34-7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>7791-13-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浓硫酸</td><td>7664-93-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB，十六烷基三甲基溴化铵</td><td>57-09-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>10125-13-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>64-17-5</td><td></td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>7782-63-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>10043-35-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>69-63-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>7778-77-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>7757-79-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LaCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>10099-58-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>10034-99-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>13446-34-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，碳酸钠</td><td>497-19-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA</td><td>139-33-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>7782-85-6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>10102-40-6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl，氯化钠</td><td>7647-14-5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>7791-20-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯酚（水中90%溶液）</td><td>108-95-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVP40，聚乙烯吡咯烷酮</td><td>9003-39-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>1185-53-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>7446-20-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>60-24-2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于琼脂糖的甲烷-氧气逆梯度培养甲烷氧化菌的模型生态系统

Agarose-Based Model Ecosystem for Cultivating Methanotrophs in a Methane-Oxygen Counter Gradient

好氧甲烷氧化细菌，即甲烷氧化菌，在生物地球化学循环中发挥着重要作用。甲烷氧化菌存在于土壤和沉积物中甲烷与氧气形成的逆向浓度梯度所构成的特定生态环境中，这种环境影响其在个体和群落水平上的行为。然而，研究这些减缓温室气体微生物生理特性的传统方法通常采用均质的浮游培养体系，无法真实反映自然环境中存在的空间和化学梯度，从而限制了科学家对这些细菌行为的理解 原位在此介绍一种简单且低成本的模型生态系统——梯度注射器，该系统利用半固体琼脂糖重现甲烷氧化菌自然生境中典型的陡峭甲烷-氧气逆向梯度。梯度注射器可用于培养甲烷氧化菌菌株，并从环境样品中富集混合的甲烷氧化菌群，揭示仅在此类空间分辨条件下才可观察到的表型特征。本实验方案还报道了多种经改良后适用于半固体琼脂糖基质的生化检测方法，这些方法可能对在其他基于琼脂糖的系统中培养微生物的研究人员具有参考价值。

本研究中，利用梯度注射器模型生态系统培养了一株单一菌株（甲烷氧化菌Methylomonas sp. 菌株 LW13）（图1A）6，但该系统也可通过直接接种土壤样品用于富集甲烷氧化微生物群落（图1B）。通过测定无细胞及接种后注射器中甲烷和氧气的浓度分布，验证了甲烷-氧气逆向梯度的存在（图1C）。对于接种LW13的梯度注射器，在冲洗注射器后一天内即形成逆向梯度，并在随后三天的培养过程中逐渐变陡。在同一时间段内，在两种气体底物浓度均达到最低值的深度处，形成了一个水平菌带（图1A）。气体梯度的陡峭变化以及水平菌带深度以下甲烷和氧气的耗尽表明，LW13以好氧方式代谢甲烷，并表现出在均质浮游培养中未观察到的表型。该表型也在从同一环境样品中分离出的其他甲烷氧化细菌中被观察到6。不同甲烷氧化菌株在水平菌带形成时间和深度上表现出菌株依赖性的差异，提示在空间分辨的培养环境下，水平菌带的形成受到每种微生物特定行为的影响6。
使用流式细胞术和菌落计数（CFU/mL）测量整个琼脂糖凝胶塞中的细胞数量（图2A）。该方法用于比较野生型LW13与一种LW13突变株的细胞分布和存活情况，该突变株缺失了岩藻糖4-O-乙酰转移酶（OAT）基因，此前已发现该基因影响水平条带的形成6。在梯度注射器中培养6天后，LW13的ΔOAT突变株总体生长水平低于野生型，而该差异在相同菌株的均质浮游培养中并未观察到6。当在梯度注射器中培养时，该突变株未能形成与LW13野生型相似的明显水平条带（图2B）。在突变株中进行基因功能回补后，细胞数量和水平条带的形态恢复至与野生型相似的水平。这些结果表明，梯度注射器可用于将特定基因与仅在甲烷-氧气逆向梯度条件下出现的表型关联起来。
已针对在半固体琼脂糖基质中培养的细菌，改进并应用了多种遗传学、化学及分子生物学技术。通过将未接种的琼脂糖作为阴性对照，可轻松在梯度注射器模型生态系统中开展标准的生物分子定量分析。测定了胞外聚合物和生物膜中常见的三种不同生物分子的浓度：多糖、蛋白质和胞外DNA15（图3）。在接种LW13的注射器区段中，水平条带区域的多糖含量显著高于其他区段，而蛋白质和胞外DNA则无显著增加。
采用RNA-seq技术检测LW13在注射器不同深度生长时的转录差异。通过基于CTAB的提取缓冲液，结合传统的苯酚:氯仿抽提及沉淀步骤，成功实现了稳定的RNA提取。RNA-seq分析结果随后用于鉴定参与水平多糖条带生成的相关基因。结果表明，用于构建空间分辨模型生态系统的半固体琼脂糖并不会阻碍通常仅适用于浮游培养和平板培养的生化分析。
<img alt="静态平衡色谱；琼脂糖深度；O₂、CH₄浓度；土壤稀释；数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67191/67191fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：梯度注射器模拟生态系统。（A）接种甲烷氧化菌Methylomonas sp. LW13的梯度注射器。在用100%甲烷冲洗注射器两天后，出现明显的水平条带（箭头所示）。（B）接种了稀释10-1和10-4土壤样品并培养两周后的梯度注射器的特写照片。接种稀释程度较高土壤的梯度注射器在琼脂糖中形成球形菌落，而接种浓度较高土壤的则形成明显条带。（C）接种LW13菌株及无菌梯度注射器中甲烷-氧气逆向梯度在培养三天后的表征结果。灰色条带表示多糖条带所在深度范围；数据为三次独立实验（每次三个技术重复）的平均值±标准差。图（A）和（C）经Beals等6修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67191/67191fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="野生型与ΔOAT及ΔOAT+OAT条件下细胞生长比较图和琼脂糖柱样品。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67191/67191fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：LW13野生型与突变株在梯度注射器中孵育后的定量分析。（A）通过流式细胞术测定的第0天和第7天从梯度注射器中挤出的琼脂糖中每毫升LW13细胞的总数。ΔOAT缺失了岩藻糖4-O-乙酰转移酶基因，该基因在多糖条带深处位置的细胞中高度表达。ΔOAT+OAT在ΔOAT基因组的远端位置插入了OAT基因。*，差异显著（双尾异方差t检验，α = 0.05）；n.s.，无显著差异。数据表示三次独立实验（每次实验设两个技术重复）的平均值±标准差。（B）接种LW13野生型、ΔOAT或ΔOAT+OAT菌株的梯度注射器在孵育七天后水平条带的形成情况。此图改编自Beals等6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67191/67191fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多糖、蛋白质、DNA浓度图；琼脂糖中的深度；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67191/67191fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：梯度注射器不同深度下生物分子的定量分析。 接种LW13并培养7天的梯度注射器八个区段中的相对多糖含量（%）、蛋白质浓度（µg/mL）和DNA浓度（ng/µL）（实心圆圈；空心圆圈表示无菌梯度注射器的数值）。数据为三次独立实验（每次实验设三个技术重复）的平均值±标准差。对于相对多糖含量，*表示在相同深度下与无菌对照组相比存在显著差异（双尾异方差t检验，α = 0.05）。对于蛋白质和DNA浓度，*表示与含有水平条带的区段相比存在显著差异（单因素方差分析结合Tukey-Kramer事后检验）；n.s.，无显著差异。该图改编自Beals等人的研究6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67191/67191fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种制备简单模型生态系统的方案，该系统可重现好氧甲烷氧化细菌自然生境中存在的甲烷-氧气逆向梯度，从而能够在空间分辨的背景下研究其生理特性。同时还介绍了对常见生化检测方法的改进，以适用于基于琼脂糖的模型生态系统。

好氧型甲烷氧化细菌，即甲烷氧化菌，在生物地球化学循环中发挥着重要作用。甲烷氧化菌占据特定的生态环境……

我们希望设计一种简单且低成本的方法，在实验室中培养甲烷氧化细菌，使其生长环境更接近自然状态。这样做的目的是发现标准实验室培养条件下所缺失的细菌表型，并最终将这些表型与其遗传决定因素联系起来。梯度注射器是对先前所述用于在甲烷-氧气逆梯度条件下培养黑素细胞方法的简化版本。该方法无需持续供应气体底物，因此可同时平行运行多个重复实验。我们还可以直接对在琼脂糖中培养的细菌进行生化分析。研究人员几乎可以无限制地获取细菌基因组序列，但将所有这些信息整合到具体生物学背景中仍然具有挑战性。我们的研究结果表明，要更好地理解单个基因的作用，必须考虑细菌所演化的环境。我们计划采用比较代谢组学和蛋白质组学等技术，进一步探究黑色素细胞在甲烷-氧气逆向梯度中不同位置时的响应机制。我们还计划在同一梯度注射器中培养多个菌株，以观察它们在空间分辨条件下的相互作用。首先，取一个含有甲基单胞菌属LW13菌落的培养平板。将菌落接种于玻璃试管中6毫升硝酸盐矿物盐培养基内，用血清瓶塞和铝制压盖密封试管。使用注射器加入甲烷，使试管内最终形成体积分数为50%的甲烷空气混合气体环境。将该浮游液体培养物在室温下以每分钟200转的速度振荡，直至浑浊，约需一天时间。按1:10的比例将液体培养物转接至新鲜培养基中。继续培养黑色素细胞液体培养物至对数生长期，使其在600纳米处的光密度达到约0.5。准备注射器时，取下配套的活塞，并将其放入无菌容器中。在每个注射器上连接一个无菌的聚四氟乙烯（PTFE）滤头，并将注射器放入标准试管架中，使滤头朝下。然后，在无菌锥形管中混合1 mL细胞、5 mL硝酸盐矿物盐培养基以及4 mL熔化的琼脂糖。将琼脂糖混合物缓慢倒入注射器中，至8 mL刻度处，静置使其凝固。约15分钟后，用无菌的20 mm丁基橡胶塞密封注射器。用实验室胶带固定橡胶塞，并标记注射器。接下来，用一个60毫升的大注射器吸取100%甲烷，并连接带有聚四氟乙烯（PTFE）滤膜头的无菌23号针头。用该大注射器刺穿装有琼脂糖混合物的注射器的橡胶塞，并插入第二根无菌针头作为气体出口。推动大注射器的活塞，使20毫升100%甲烷通入顶空进行冲洗。当注射器中剩余一到两毫升甲烷时，移除出口针头，以防止氧气倒流。将注射器与琼脂糖混合物及甲烷在18摄氏度下孵育。为挤出琼脂糖，将聚四氟乙烯（PTFE）滤芯吸头更换为无菌23号针头，并将橡胶塞替换为配套的注射器推杆。缓慢下压活塞，将一毫升增量分别加入到无菌的1.5毫升微量离心管中。野生型LW13菌株在梯度注射器的特定深度形成一条明显的水平条带，该位置的甲烷和氧气浓度均较低。接种了LW13的梯度注射器显示出甲烷-氧气逆向梯度，且甲烷的消耗和氧气的消耗与水平条带所处深度相对应。与野生型菌株相比，LW13的OAT基因缺失突变体缺乏明显的水平条带结构，表明该基因在此表型中发挥作用。首先，从接种了野生型或突变型甲基单胞菌LW13的梯度注射器中取出挤出的琼脂糖片段。向挤出的琼脂糖样品中加入0.75毫升0.85%氯化钠水溶液，并通过涡旋振荡使其均匀混合。在新的微量离心管中，用900微升盐溶液将样品进一步稀释1至10倍。在避光、室温条件下，将样品与3微升SYTO 9和碘化丙啶染料1:1混合液孵育15分钟。为确定每毫升琼脂糖中的细胞数，将微球计数珠悬浮液置于水浴中超声处理5分钟。然后，在流式细胞术分析前，向样品中加入10 µL悬浮液。使用流式细胞仪分析样品。通过比较无细胞对照样品与接种琼脂糖样品的侧向散射与前向散射点图，设定细菌事件电压门，以排除背景琼脂糖颗粒。为了计数梯度注射器内的菌落形成单位，向挤出的琼脂糖片段中加入 800 微升硝酸盐矿物盐培养基，涡旋振荡 10 秒以助于移液。准备一个无菌的 96 孔板，每孔加入 180 微升硝酸盐矿物盐培养基。取 20 微升稀释后的琼脂糖样品加入第一列各孔中，并充分混匀。使用多通道移液器，从96孔板的第一排孔开始，将20微升样品进行10倍系列稀释。标记含有硝酸盐矿物盐培养基或所选培养基的方形网格平板。使用多通道移液器，从96孔板的一列中吸取5微升样品点样至培养基平板上。利用挤出的琼脂糖样品进行流式细胞术分析证实，LW13 的 OAT 缺失突变体与野生型菌株相比，细胞生长减少。通过 OAT 基因对突变体进行互补后，细胞数量和条带形成恢复至与野生型相似的水平，表明该基因在条带形成中具有特异性作用。

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环境

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基于琼脂糖的甲烷-氧气逆梯度培养甲烷氧化菌的模型生态系统

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