基于琼脂糖的甲烷-氧气逆梯度培养甲烷氧化菌的模型生态系统

我们希望设计一种简单且低成本的方法，在实验室中培养甲烷氧化细菌，使其生长环境更接近自然状态。这样做的目的是发现标准实验室培养条件下所缺失的细菌表型，并最终将这些表型与其遗传决定因素联系起来。梯度注射器是对先前所述用于在甲烷-氧气逆梯度条件下培养黑素细胞方法的简化版本。

该方法无需持续供应气体底物，因此可同时平行运行多个重复实验。我们还可以直接对在琼脂糖中培养的细菌进行生化分析。研究人员几乎可以无限制地获取细菌基因组序列，但将所有这些信息整合到具体生物学背景中仍然具有挑战性。

我们的研究结果表明，要更好地理解单个基因的作用，必须考虑细菌所演化的环境。我们计划采用比较代谢组学和蛋白质组学等技术，进一步探究黑色素细胞在甲烷-氧气逆向梯度中不同位置时的响应机制。我们还计划在同一梯度注射器中培养多个菌株，以观察它们在空间分辨条件下的相互作用。

首先，取一个含有甲基单胞菌属LW13菌落的培养平板。将菌落接种于玻璃试管中6毫升硝酸盐矿物盐培养基内，用血清瓶塞和铝制压盖密封试管。使用注射器加入甲烷，使试管内最终形成体积分数为50%的甲烷空气混合气体环境。

将该浮游液体培养物在室温下以每分钟200转的速度振荡，直至浑浊，约需一天时间。按1:10的比例将液体培养物转接至新鲜培养基中。继续培养黑色素细胞液体培养物至对数生长期，使其在600纳米处的光密度达到约0.5。

准备注射器时，取下配套的活塞，并将其放入无菌容器中。在每个注射器上连接一个无菌的聚四氟乙烯（PTFE）滤头，并将注射器放入标准试管架中，使滤头朝下。然后，在无菌锥形管中混合1 mL细胞、5 mL硝酸盐矿物盐培养基以及4 mL熔化的琼脂糖。

将琼脂糖混合物缓慢倒入注射器中，至8 mL刻度处，静置使其凝固。约15分钟后，用无菌的20 mm丁基橡胶塞密封注射器。用实验室胶带固定橡胶塞，并标记注射器。

接下来，用一个60毫升的大注射器吸取100%甲烷，并连接带有聚四氟乙烯（PTFE）滤膜头的无菌23号针头。用该大注射器刺穿装有琼脂糖混合物的注射器的橡胶塞，并插入第二根无菌针头作为气体出口。推动大注射器的活塞，使20毫升100%甲烷通入顶空进行冲洗。

当注射器中剩余一到两毫升甲烷时，移除出口针头，以防止氧气倒流。将注射器与琼脂糖混合物及甲烷在18摄氏度下孵育。为挤出琼脂糖，将聚四氟乙烯（PTFE）滤芯吸头更换为无菌23号针头，并将橡胶塞替换为配套的注射器推杆。

缓慢下压活塞，将一毫升增量分别加入到无菌的1.5毫升微量离心管中。野生型LW13菌株在梯度注射器的特定深度形成一条明显的水平条带，该位置的甲烷和氧气浓度均较低。接种了LW13的梯度注射器显示出甲烷-氧气逆向梯度，且甲烷的消耗和氧气的消耗与水平条带所处深度相对应。

与野生型菌株相比，LW13的OAT基因缺失突变体缺乏明显的水平条带结构，表明该基因在此表型中发挥作用。首先，从接种了野生型或突变型甲基单胞菌LW13的梯度注射器中取出挤出的琼脂糖片段。向挤出的琼脂糖样品中加入0.75毫升0.85%氯化钠水溶液，并通过涡旋振荡使其均匀混合。

在新的微量离心管中，用900微升盐溶液将样品进一步稀释1至10倍。在避光、室温条件下，将样品与3微升SYTO 9和碘化丙啶染料1:1混合液孵育15分钟。为确定每毫升琼脂糖中的细胞数，将微球计数珠悬浮液置于水浴中超声处理5分钟。

然后，在流式细胞术分析前，向样品中加入10 µL悬浮液。使用流式细胞仪分析样品。通过比较无细胞对照样品与接种琼脂糖样品的侧向散射与前向散射点图，设定细菌事件电压门，以排除背景琼脂糖颗粒。

为了计数梯度注射器内的菌落形成单位，向挤出的琼脂糖片段中加入 800 微升硝酸盐矿物盐培养基，涡旋振荡 10 秒以助于移液。准备一个无菌的 96 孔板，每孔加入 180 微升硝酸盐矿物盐培养基。取 20 微升稀释后的琼脂糖样品加入第一列各孔中，并充分混匀。

使用多通道移液器，从96孔板的第一排孔开始，将20微升样品进行10倍系列稀释。标记含有硝酸盐矿物盐培养基或所选培养基的方形网格平板。使用多通道移液器，从96孔板的一列中吸取5微升样品点样至培养基平板上。

利用挤出的琼脂糖样品进行流式细胞术分析证实，LW13 的 OAT 缺失突变体与野生型菌株相比，细胞生长减少。通过 OAT 基因对突变体进行互补后，细胞数量和条带形成恢复至与野生型相似的水平，表明该基因在条带形成中具有特异性作用。