优化与简化的精准肝切片制备及培养技术

制备和培养精准切割肝组织片（PCLS）的方案可能存在显著差异。PCLS 的主要缺点是其半衰期较短，但本文表明，在具备振动切片机（Vibratome）的标准实验室条件下，即可成功制备并培养 PCLS，并确保其半衰期至少达到四天。PCLS 是一种极具吸引力的模型，能够填补体外与体内模型之间的空白，但由于其相对较短的半衰期，常被忽视。然而，PCLS 包含所有类型的细胞以及保持完整的组织结构，这对于代谢整合至关重要，因此可视为整个器官的微型模型，能够在维持复杂表型的同时，用于活体组织的研究与治疗。连续切片过程本身非常简单，但在技术上具有挑战性。为便于操作，本方案重点关注若干关键步骤，例如切片方向的确定、组织的包埋方法，以及用于培养的微型模型体积的选择，同时强调采用动态培养系统以延长其半衰期。

[旁白] 收获前，准备1升Krebs-Henseleit缓冲液、一个已消毒并冷却的Vibratome托盘、经高压灭菌的Vibratome刀片以及4%低熔点琼脂糖。收获当天，将融化的琼脂糖置于37摄氏度水浴中保温，直至使用。接下来，准备培养板：分别向6孔、12孔和24孔板的每孔中加入2.6、1.5和0.7毫升完全培养基。将孔径为8微米的多孔插入式培养小室放入各孔中。将培养板置于设定为37摄氏度、含5%二氧化碳和21%氧气的湿润培养箱中。使用适当的灭菌方法对收获所需的所有器械进行灭菌。用70%乙醇喷洒已处死小鼠的腹部，以消毒该区域。使用无菌镊子和剪刀，从腹部中线切开皮肤和腹膜，打开腹腔。轻柔地将肝脏从周围器官或血管中分离，避免损伤肝叶。随后立即将完整肝脏置于冰冻的Krebs缓冲液中保存。使用钝头镊子和锋利的无菌刀片或剪刀，将各肝叶单独分离，以避免在分离过程中损伤肝叶。使用锋利的无菌刀片修剪所选肝叶的所有边缘，形成平直且易于操作的边缘，以便包埋。接下来，将4%低熔点琼脂糖倒入置于湿冰上的3厘米培养皿中，使其均匀冷却，防止肝叶下沉。让琼脂糖再冷却30秒，然后将修剪好的肝叶置于琼脂糖中央，使其沉入凝胶块中央。随后，切去琼脂糖块的外周边缘，并将琼脂糖块从培养皿中取出。确保琼脂糖块的顶面以及与Vibratome平台粘附的一面与肝叶上缘平行。首先，将Vibratome设置为切片厚度250微米、速度5、频率7赫兹。对Vibratome进行灭菌并将托盘安装至仪器上后，在其周围放置冰块以保持低温环境。将刀片设置为相对于水平面向下倾斜10度。然后，用冰冻的Krebs缓冲液填充Vibratome槽。在平台上涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，以准备固定琼脂糖块。随后，使用无菌吸水纸巾擦干将要粘附在平台上的琼脂糖块边缘。现在，将琼脂糖块放置在Vibratome的可拆卸平台上。将肝叶竖直放置，以便进行横向切割，这可以减少对肝叶的压力并使切割更顺畅。等待一分钟使胶水固化，然后将平台浸入Vibratome槽中，确保琼脂糖块完全被Krebs缓冲液覆盖。为编程Vibratome进行切片，设定起始和终止位置。然后开始切片，直至到达肝叶部分。使用刮铲收集肝切片，以避免使用镊子或刷子可能造成的损伤。将切片收集至冰冻的Krebs缓冲液中，直至准备进行培养。使用刮铲将肝切片转移至预先准备好的含培养基和插入式小室的培养孔中。然后，将培养板置于设定为130 rpm的轨道摇床上，并在常规细胞培养箱中于37摄氏度、5%二氧化碳和21%氧气条件下进行培养。