Name: 用于精确切割肝片生产和培养的优化和简化技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 了解使用振动切片机制备和体外培养小鼠精确切割肝片（PCLS）的优化方案。该方法可将肝片存活时间延长至至少四天，为肝脏代谢研究提供可靠的体外与体内模型桥梁。

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作者感谢Mirabela Bandol、Samantha Richards、Louise Fisher、Rebecca Towns以及伦敦大学学院生物服务中心工作人员在动物种群繁育与维护方面提供的帮助。本研究得到了英国医学研究理事会临床科学家奖学金MR/T008024/1（JB）和英国国家健康研究所大奥蒙德街医院生物医学研究中心（JB）的资助。文中观点仅代表作者自身，不一定代表英国国家医疗服务体系（NHS）或英国国家健康研究所（NIHR）的观点。

野生型 CD57Bl/6J 小鼠购自查尔斯河实验室。小鼠可自由获取食物和水，在独立通风笼具中饲养，环境温度和湿度受控，并维持 12 小时光照循环。3 周龄小鼠被处死，肝脏立即无灌流收获。所有动物实验均经伦敦大学学院动物福利与伦理审查委员会的本地伦理审查批准，并在英国内政部项目许可证 PP9223137 下进行，遵循英国内政部（动物）科学程序法案（1986 年）及 ARRIVE 指南。所有努力均按照伦敦大学学院生物服务部门的标准操作规范，以尽量减少对动物的伤害。
1. 实验准备工作
<ol>
	<li>收获前一天，执行以下步骤。
	<ol>
		<li>将一管Krebs粉末溶解于1 L无菌水中，配制1 L Krebs-Henseleit缓冲液（KREBS）。将其冷却至4 °C，并置于湿冰上保存。</li>
		<li>用70%乙醇对托盘进行消毒，并用无菌PBS冲洗。将托盘用锡箔纸包裹后放入冰箱过夜，以保持切割时的低温环境。</li>
		<li>将所有其他可拆卸部件喷洒乙醇，用无菌PBS冲洗，晾干后保持无菌状态。将刀片进行高压灭菌，并保持无菌直至使用。</li>
		<li>用无菌水配制4% w/v低熔点琼脂糖溶液。待其重悬并完全融化后，置于4 °C冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获当天，在肝脏收获前执行以下步骤。
	<ol>
		<li>将4%低熔点琼脂糖融化，并置于37 °C水浴中保温备用。使用前确保琼脂糖温度已降至37 °C，且所有气泡均已消散。</li>
		<li>向6孔、12孔和24孔板中每孔分别加入2.6 mL、1.5 mL和0.7 mL培养基，并在每孔中放置8 µm孔径的多孔插件。将培养板放入设定为37 °C、5% CO2和21% O2的加湿培养箱中。此步骤有助于培养基在升温过程中调节pH，使其达到适合培养的状态。</li>
		<li>使用8 µm孔径的多孔插件培养组织切片，以便切片两面均可接触培养基。按如下方式配制培养基：在William's Medium E（WME）中加入2 mM L-谷氨酰胺补充剂、10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 μg/mL庆大霉素、25 mM D-葡萄糖溶液和15 mM HEPES溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肝脏采集与制备（15 分钟）
<ol>
	<li>在取材前对所有器械进行灭菌处理。</li>
	<li>根据当地有关实验动物护理的规程，使用异氟烷面罩对小鼠进行麻醉。在打开腹腔前，轻捏脚趾间部位以确认动物已充分麻醉。若肝脏可迅速取出，可通过 CO2 窒息或颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。由于该操作为终末性操作，无需使用眼药膏，因其对动物无影响。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒腹部。可选步骤：剃除小鼠毛发，以防止毛发污染。</li>
	<li>使用无菌镊子和剪刀从腹部中线剪开皮肤和腹膜，打开腹腔。小心将肝脏从其他器官或血管中分离，避免损伤肝叶。</li>
	<li>立即把完整肝脏置于冰上预冷的 Krebs 缓冲液中。所有后续操作均应在 4 °C 的冰上快速进行，尽快进入肝脏制备步骤，以防止细胞进一步死亡。</li>
</ol>
3. 肝叶包埋（每个肝叶25分钟）
<ol>
	<li>将肝脏转移至含有冰冻 Krebs 缓冲液的冰上培养皿中，确保整个肝脏完全浸没。</li>
	<li>使用钝头镊子和锋利的无菌刀具逐个分离肝叶，避免损伤肝叶组织。</li>
	<li>选择第一个肝叶进行切片，其余肝叶暂时保存在冰冻 Krebs 缓冲液中，待后续包埋和切片时使用。</li>
	<li>修整肝叶边缘，使其形成便于包埋的规整直边。此步骤有助于去除部分纤维性的格利森囊（Glisson's capsule），以进一步便于切片。操作过程中应始终保持肝脏表面湿润，并置于冰冻 Krebs 缓冲液中。</li>
	<li>将一个 3 cm 的培养皿（或类似容器）置于湿冰上，倒入已预热至 37 °C 水浴中的 4% 低熔点琼脂糖。将其放回冰上，使琼脂糖自下而上冷却凝固，防止肝叶沉底，确保均匀包埋。</li>
	<li>让琼脂糖继续冷却约 30 秒，然后将修整好的肝叶放入其中。肝叶会自然沉降于琼脂糖块中央。包埋过程需要根据各实验室条件和个人经验进行练习和优化。</li>
	<li>将已完成包埋但仍置于冰上的肝叶放入冰箱冷藏 5 分钟，此时琼脂糖应已完全凝固。</li>
	<li>切除琼脂糖块外围多余部分，并将琼脂糖块从培养皿中取出。</li>
	<li>将琼脂糖块修整为更易操作的大小，确保其上表面以及与振动切片机平台粘附的一侧与肝叶上缘平行。</li>
	<li>尽快开始切片操作，但需确保琼脂糖块始终保存在冰冻 Krebs 缓冲液中并置于冰上。</li>
</ol>
4. 肝脏切片制备（每个叶40分钟）
<ol>
	<li>将振动切片机设置为切片厚度 250 µm，切片速度为 5，频率为 7 Hz。这些为参考参数；具体数值可能需根据所使用的振动切片机型号进行优化。</li>
	<li>切片前用 70% 乙醇喷洒振动切片机及操作台区域，以尽可能保持环境无菌。</li>
	<li>将托盘安装到振动切片机上，并在其周围放置冰块。将刀片以向下 10° 角度（低于水平面）安装到振动切片机上。</li>
	<li>用冰冻的 Krebs 缓冲液填充振动切片机的切片槽。在平台上薄薄涂一层氰基丙烯酸酯胶水。</li>
	<li>使用无菌吸水纸擦干将要粘附在平台上的琼脂糖块边缘。</li>
	<li>将琼脂糖块放置在可拆卸平台上。将肝叶直立放置，以便进行横向切片。尽管切片尺寸有所减小，但此方式可显著简化切片过程，因在切割时能有效减少对肝叶的压力。</li>
	<li>等待 1 分钟使胶水固化，然后将可拆卸平台浸入切片槽中，并确保琼脂糖块完全被 Krebs 缓冲液覆盖。</li>
	<li>通过设定起始和终止位置来编程振动切片机进行切片。最初先切较厚的切片，直至到达肝叶区域。</li>
	<li>弃去第一片切片，因其可能未达到正确厚度。为避免损伤切片，应使用刮铲而非镊子或刷子收集肝组织切片。 
	注意：可使用经 70% 乙醇消毒并用无菌 PBS 冲洗的小型刷子，在切片过程中轻柔引导组织。</li>
	<li>重复该过程，直至获得所需数量的切片。肝叶偶尔可能从琼脂糖块上脱落，导致无法继续使用。将切片收集至冰冻的 Krebs 缓冲液中，待后续培养使用。</li>
</ol>
5. 肝切片的孵育
<ol>
	<li>使用刮铲将切片转移至已准备好的含有培养基和插入式培养插件的孔中。</li>
	<li>将培养板置于旋转摇床上，设置转速为130 rpm，并在37 °C、5% CO2和21% O2条件下，使用常规细胞培养箱进行培养。6孔板、12孔板和24孔板每孔的最终培养体积分别为2.6 mL、1.5 mL和0.7 mL。</li>
	<li>在含有切片的培养板下方放置一个空培养板，以散去摇床平台可能产生的多余热量。每48小时更换一次培养基。</li>
</ol>
6. 细胞存活率检测
<ol>
	<li>将切片转移至含有400 µL预热的完全Williams' Medium E培养基的48孔板中，并加入80 µL MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑）四唑盐试剂。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下于摇床上孵育1小时后，将200 µL培养基转移至96孔板中，使用多孔板读板仪在490 nm处测定吸光度。以在PBS中室温放置24小时的切片作为阴性对照。</li>
</ol>
7. 组织学染色
<ol>
	<li>使用二甲苯和乙醇脱蜡并水化切片，随后用去离子水冲洗。将切片置于苏木精染液中染色 3 分钟。</li>
	<li>用去离子水冲洗 5 分钟。迅速将切片浸入酸性乙醇（1 mL 浓盐酸与 400 mL 70% 乙醇）中 10 次。</li>
	<li>用去离子水冲洗 2 次，并吸去多余水分。将切片浸入伊红染液中 30 秒。</li>
	<li>依次浸入 95% 乙醇和 100% 乙醇中脱水，每次 5 分钟，各重复 3 次。将切片浸入二甲苯中 3 次，每次 15 分钟。最后在载玻片上加盖盖玻片。</li>
</ol>

Standardized Protocol for Culturing Liver Slices in Basic Laboratory Settings

不存在需要披露的竞争利益。

我们证明，制备和培养PCLS可以轻松实现，同时确保至少4天的半衰期。本方案包含五个关键步骤：若使用此类振动切片机时的包埋方法、切片方向、动态培养系统、最小培养体积以及使用插入式培养插件。
PCLS 的制备与培养方案目前已有多种公开资源可供参考。然而，这些方案普遍缺乏标准化；尽管它们可能关注于方案中相似且特定的步骤，但在仅具备基础振动切片机的大多数实验室中，往往难以以简便的方式进行重复。振动切片机或组织切片设备的种类繁多，其价格和技术特性各不相同，例如是否配备集成冷却系统等，但它们的共同特点是均采用振荡式剃须刀片进行切割。在组织切片方面，主要差异在于是否需要包埋。出于显而易见的原因以及包埋对组织活性的影响，理想情况下应尽量避免包埋。一种无需包埋的参考型切片设备是 Krumdieck 切片机35。此类切片机可在冷却缓冲液中利用组织芯进行切割，从而获得大小均匀的组织切片，并避免包埋步骤。然而，这类设备通常比基础型振动切片机更昂贵，且在大多数实验室中较少使用或不易获得。本方案所使用的振动切片机通常已用于化学固定组织的切片，但需要对肝叶进行包埋。已有研究显示，使用类似的振动切片机可在无需包埋的情况下完成肝组织切片1；然而，根据我们的经验，该方法难以重复实现。此外，在使用此类振动切片机时，若未使用三维支撑性的琼脂糖凝胶，肝组织切片易出现损伤及厚度不均，从而导致细胞死亡增加。本方案采用横向而非矢状向切割肝叶。切片步骤是一项较难掌握的技术，据我们所知，切割方向是一个从未被重点关注但十分关键的细节。在切片过程中调整肝叶的取向可显著简化操作过程，同时减轻对肝脏组织的压力。此外，也可考虑使用水凝胶以进一步提升切片质量36。
下一个重要的标准是需要更大体积的培养体系以提高存活率。已有研究表明，较大体积能够提供更多营养物质，并稀释毒性更强的胆汁酸代谢产物37。引入振荡的动态系统，并结合Transwell的使用，可通过形成持续的液体流动，改善组织切片两侧对营养物质乃至氧气的获取18,38,39。Transwell的使用以及动态系统的优势已在多种研究背景下得到验证，例如人源肿瘤肝组织切片的反应性研究28，以及纤维化模型的构建26,27。本方案进一步证实了这些方法在更广泛的生理条件下的优势。
Williams' Medium E 常被选作肺切片（PCLS）的标准细胞培养基40,41。已有研究描述在培养基中添加葡萄糖和血清可能有助于维持切片的存活率和功能活性42。培养基中的葡萄糖浓度通常在 4 nM 至 36 nM 之间变化43,44，但目前尚无共识明确高浓度葡萄糖对细胞存活率或氧化应答的影响。有研究声称添加胰岛素或地塞米松35可提高长期存活率，但尚无定论，因为这些添加剂可能诱发继发性胰岛素抵抗，进而对存活率产生下游影响45。
既往数据显示，厚度小于 200 μm 的切片难以均匀切割，并可能出现氧化应激，而厚度大于 400 μm 的切片则表现出营养物质渗透率较低18,19,46。此外，基于肺切片（PCLS）的外观、对质地的影响以及切割难易程度，优选厚度为 250 μm。在动态培养系统中使用 transwell 可显著改善营养物质或治疗剂向 PCLS 内层细胞的渗透18,32。与 Krumdieck 切片机相比，后者因整合了核心切割系统，可产生尺寸均匀的切片，而本方案则可在切片后将切片修整为相同尺寸进行适配。然而，实验中应考虑切片在尺寸、重量或蛋白含量方面的变异性，及其对培养环境，进而对细胞活力和生物标志物的影响。因此，在使用本方案时，MTA 检测结果将根据每片组织的鲜重进行归一化处理。此外，也可能观察到切片厚度的不均一性，但遗憾的是，几乎所有类型的切片设备都可能出现这一现象。操作者可通过评估切片外观，考虑剔除均一性最差的切片，但这仍被认为是一种不可靠的方法，也是肺切片技术（PCTS）的主要缺陷之一。该模型的主要局限性仍在于相对短暂的存活时间，但其处于已有文献报道的时间范围内24,31。可通过提高氧气供应以延长其存活时间。一些既往发表的方案要求使用复杂的培养基以及高于 80% 的氧浓度，以促进代谢并实现更长的存活时间1,24,35,38。然而，将用于 PCLS 氧合的氧浓度与用于细胞系培养的氧浓度直接比较仍存在困难。目前关于氧气对 PCLS 生理功能影响的数据极为有限18,47，且高浓度氧气可能通过产生活性氧（ROS）毒性，显著改变其病理生理状态和表型48。
总之，利用有限的设备即可制备寿命较短的精准切割肝切片（PCLS），并将其作为可靠的离体（ex vivo）模型。组织结构在肝脏生理学中至关重要，而PCLS能够保持这种结构完整性，这进一步说明该模型应被更广泛地采纳。因此，精准切割肝切片应成为科学研究中更为公认的研究工具。

精密切割组织切片（PCTS）是器官的薄切片。该技术可在保留邻近细胞和细胞外基质三维结构的同时，维持器官的组织架构，模拟微型器官。由于其易于获取、成本较低且操作相对省力，同时又能保持组织结构完整性，因此是一种具有吸引力的研究模型。
PCTS 填充&#160;一个间隙 体外 细胞研究和 体内 动物研究，克服了两种模型的大多数缺点。PCTS 已从多种器官生成，例如肝脏1肠道2,3结肠2, 大脑4,5，肺6,7,8肾脏9,10脾脏11,12心脏13,14 但还包括肿瘤15,16它们也可来源于多种动物，例如小鼠1，大鼠17,18 但还包括猪19 以及人类手术废弃物15,20,21尽管PCTS需要&#160;使用动物涉及伦理相关问题，而单个动物的器官可生成多个PCTS，从而减少动物使用数量，符合NC3Rs指南中的“减量、替代、优化”（Reduction, Replacement, Refinement）原则22 同时限制个体间差异。
改进的组织切片设备（例如振动切片机23）的发展，使得组织切片从人工切割、厚度不均且存活率低的状态，转变为可重复制备更薄、结构完整性更佳的切片。
然而，关于PCTS，特别是精密切割肝切片（PCLS）的制备与培养方案在文献中存在显著差异，且缺乏标准化，尤其是在切片设备、培养基成分和培养条件等关键参数方面。这些方案还可能因组织来源不同而有明显差异。部分方案需要对缓冲液进行氧合，或使用复杂的生物反应器系统进行培养24。这些方法通常仅单独关注不同的技术细节，或针对特定组织设计，往往成本较高，且在普通实验室中难以以经济高效的方式重复实现。
本方案整合了一些关键步骤，例如包埋方法、切片方向、Transwell小室的使用25、动态培养系统26以及培养基最小体积的重要性。其中部分步骤此前已在其他独立实验或不同研究背景下（如纤维化27或肿瘤反应28）被分别优化过。本方案还特别强调了使用特定类型组织切片机进行包埋以及切片方向的重要性，这两个参数在实际操作中较难掌握，且在现有文献中常被忽视。该方法操作简便，仅需标准实验室设备并配备基础的组织切片机，即可制备出在体外培养至少4天的肺切片（PCLS）。

<table><tbody><tr><td>3 cm 培养皿</td><td>任意</td><td></td><td>任何适用于细胞培养的</td></tr><tr><td>6、12、24 孔培养板</td><td>任意</td><td></td><td>任何适用于细胞培养的</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯瞬间胶</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>8 µm 插入式培养小室，适用于 12 孔板</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>8 µm 插入式培养小室，适用于 24 孔板</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>8 µm 插入式培养小室，适用于 6 孔板</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td>HEPA 空气过滤</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>MTS 四唑盐试剂&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>多孔板读板仪&amp;nbsp;</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科镊子</td><td>任意</td><td></td><td>带扁平方形尖端&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>含 GlutaMAX 的 William&amp;rsquo;s E 培养基（WME）</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

优化与简化的精准肝切片制备及培养技术

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

本方案介绍了一种用于制备和培养精密切割肝组织片（PCLS）的简易系统。PCLS 包含完整微环境中的所有细胞，因此可视为整个器官的微型模型，能够在维持其复杂表型的同时用于活体组织研究。本方案利用振动切片机和常规实验室设备，实现从小鼠肝脏制备组织切片。目前，PCLS 的制备与培养方案缺乏标准化，其具体操作可能因目标组织、所用振动切片机类型以及供氧需求的不同而存在显著差异。对于仅配备基础振动切片机和常规组织培养设施的实验室而言，某些方案可能难以重复。我们整合了现有多种方案中若干关键步骤的重要操作要点，重点强调包埋方法、切片方向、动态与静态培养系统的选择，以及最小培养体积的重要性。本方案可在大多数配备基础组织切片设备的实验室中简便地建立并重复实施。综合采用本方案的操作流程，PCLS 可存活至少 4 天。PCLS 是一种简单、经济且可重复的模型，适用于肝脏等器官的病理生理学研究及药物筛选。

收获时，有意省略动物灌注步骤，以确保器官能够快速处理并防止器官损伤。肝脏在切开后迅速取出，并立即置于冰冻的器官保护缓冲液（如Krebs缓冲液24,29）中。尽管已有不经过包埋直接切取新鲜肝组织的报道1，但将肝脏包埋于低熔点琼脂糖30（图1）并结合使用器官保护缓冲液，可在振动切片机上实现最佳切片条件，减少组织损伤并提高切片厚度的一致性。组织厚度至关重要，较薄的切片可使更多细胞层获得营养和氧气31，从而减少细胞死亡。然而，切片过薄则难以均匀切割。相反，厚度超过400 µm的切片则表现出较低的营养渗透率。切片后，使用插入式培养装置（图1）在液-气界面进行培养，并在37 °C、5% CO2和21% O2条件下置于摇床上孵育。切片应在收获后3小时内置于培养基中孵育，否则细胞将迅速死亡32。
为了评估肺切片（PCLS）的活力，采用4,5-二甲基噻唑-2-基-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑（MTS）法检测细胞活力，该方法依赖于NAD(P)H相关的脱氢酶，即需要代谢活跃的细胞来还原MTS。MTS的检测值已根据各切片的重量进行归一化处理。为了优化PCLS的活力，培养基的最小体积对于维持孵育24小时后的细胞活力至关重要。在24孔板中使用0.7 mL培养基时，与12孔板中的1.5 mL和6孔板中的2.6 mL相比，TMS检测显示细胞活力显著下降（p = 0.02）（图2A）。选择这些体积是为了使切片刚好被液体轻微覆盖，但具体体积可能需要根据所使用的插入式培养小室和培养板类型进行调整。与其他研究者33一致，本研究采用12孔板，因其能在较少培养基体积下实现最佳存活率，是较为理想的折中选择。
振荡培养至关重要，与静态培养相比，振荡条件下孵育24小时后，PCLS的存活率提高50%（图2B）。振荡可形成关键的气液界面，结合Transwell小室的使用可优化该界面，使组织切片的两侧均能接触营养物质和氧气。振荡运动产生的持续流动还可促进氧气和营养物质的摄取，并穿过Transwell膜进行传递。
MTS 检测评估了从孵育1小时至第6天的细胞活性。孵育后第0天至第4天细胞活力保持稳定，到第6天时出现显著下降（p = 0.05）（图 2C）。通过苏木精-伊红（H&amp;E）染色评估的PCLS形态显示，孵育后5天内胆管结构和组织架构均无明显变化（图 3A-D）。与第0天（图 3A）相比，孵育后第1天（图 3B）和第2天（图 3C）的PCLS未见组织学差异；至孵育后第5天出现核深染、轻度炎性浸润及空泡化，提示存在中等程度的细胞死亡过程（图 3D）。综上所述，该PCLS培养方案可维持组织活性至少4天，与在相似条件下使用组织切片的既往研究结果一致31。
<img alt="小鼠器官培养流程图；研究工作流程；肝脏组织制备；实验设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：生成PCLS的实验方案示意图。 本图改编自34。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="OD490 比较；柱状图 A-C；对孔、振荡和天数的统计分析；误差线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：优化的 PCLS 培养方案在 5 天内显示出良好的细胞活力。（A）孔板尺寸对细胞增殖的影响（n=3）。（B）振荡对细胞增殖的影响（每组条件 n=6）。（C）肝组织切片在培养第 0 至第 6 天的 MTS 细胞增殖检测结果（每个时间点 n=5）。OD 为任意单位，按组织切片鲜重标准化。图表显示均值 ± 标准差（SD）。非配对双尾 Student's t 检验，ns=无显著性差异，*p&lt;0.05，**p&lt;0.01。该图已根据文献34修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="组织学分析：随时间变化的肝脏组织切片比较，并标注细胞变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：组织学结果。（A-D）肝PCLS经H&amp;E染色后组织学的代表性图像。比例尺 = 100 µM。本图已根据文献34修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

一种用于小鼠肝脏研究的精准切割肝片（PCLS）制备与培养方案。本文重点介绍该方案的关键步骤，该方案仅需常规实验室设备并配备振动切片机，可使PCLS存活至少4天。

本方案介绍了一种用于制备和培养精准切割肝片（Precision-cut Liver Slices, PCLS）的简易系统。PCLS 包含完整微环境中存在的所有细胞类型……

制备和培养精准切割肝组织片（PCLS）的方案可能存在显著差异。PCLS 的主要缺点是其半衰期较短，但本文表明，在具备振动切片机（Vibratome）的标准实验室条件下，即可成功制备并培养 PCLS，并确保其半衰期至少达到四天。PCLS 是一种极具吸引力的模型，能够填补体外与体内模型之间的空白，但由于其相对较短的半衰期，常被忽视。然而，PCLS 包含所有类型的细胞以及保持完整的组织结构，这对于代谢整合至关重要，因此可视为整个器官的微型模型，能够在维持复杂表型的同时，用于活体组织的研究与治疗。连续切片过程本身非常简单，但在技术上具有挑战性。为便于操作，本方案重点关注若干关键步骤，例如切片方向的确定、组织的包埋方法，以及用于培养的微型模型体积的选择，同时强调采用动态培养系统以延长其半衰期。[旁白] 收获前，准备1升Krebs-Henseleit缓冲液、一个已消毒并冷却的Vibratome托盘、经高压灭菌的Vibratome刀片以及4%低熔点琼脂糖。收获当天，将融化的琼脂糖置于37摄氏度水浴中保温，直至使用。接下来，准备培养板：分别向6孔、12孔和24孔板的每孔中加入2.6、1.5和0.7毫升完全培养基。将孔径为8微米的多孔插入式培养小室放入各孔中。将培养板置于设定为37摄氏度、含5%二氧化碳和21%氧气的湿润培养箱中。使用适当的灭菌方法对收获所需的所有器械进行灭菌。用70%乙醇喷洒已处死小鼠的腹部，以消毒该区域。使用无菌镊子和剪刀，从腹部中线切开皮肤和腹膜，打开腹腔。轻柔地将肝脏从周围器官或血管中分离，避免损伤肝叶。随后立即将完整肝脏置于冰冻的Krebs缓冲液中保存。使用钝头镊子和锋利的无菌刀片或剪刀，将各肝叶单独分离，以避免在分离过程中损伤肝叶。使用锋利的无菌刀片修剪所选肝叶的所有边缘，形成平直且易于操作的边缘，以便包埋。接下来，将4%低熔点琼脂糖倒入置于湿冰上的3厘米培养皿中，使其均匀冷却，防止肝叶下沉。让琼脂糖再冷却30秒，然后将修剪好的肝叶置于琼脂糖中央，使其沉入凝胶块中央。随后，切去琼脂糖块的外周边缘，并将琼脂糖块从培养皿中取出。确保琼脂糖块的顶面以及与Vibratome平台粘附的一面与肝叶上缘平行。首先，将Vibratome设置为切片厚度250微米、速度5、频率7赫兹。对Vibratome进行灭菌并将托盘安装至仪器上后，在其周围放置冰块以保持低温环境。将刀片设置为相对于水平面向下倾斜10度。然后，用冰冻的Krebs缓冲液填充Vibratome槽。在平台上涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，以准备固定琼脂糖块。随后，使用无菌吸水纸巾擦干将要粘附在平台上的琼脂糖块边缘。现在，将琼脂糖块放置在Vibratome的可拆卸平台上。将肝叶竖直放置，以便进行横向切割，这可以减少对肝叶的压力并使切割更顺畅。等待一分钟使胶水固化，然后将平台浸入Vibratome槽中，确保琼脂糖块完全被Krebs缓冲液覆盖。为编程Vibratome进行切片，设定起始和终止位置。然后开始切片，直至到达肝叶部分。使用刮铲收集肝切片，以避免使用镊子或刷子可能造成的损伤。将切片收集至冰冻的Krebs缓冲液中，直至准备进行培养。使用刮铲将肝切片转移至预先准备好的含培养基和插入式小室的培养孔中。然后，将培养板置于设定为130 rpm的轨道摇床上，并在常规细胞培养箱中于37摄氏度、5%二氧化碳和21%氧气条件下进行培养。

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科研

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生物学

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