用三电极、两室生物电化学系统表征乳酸菌介导的细胞外电子转移
2024年8月23日
在这里，我们提出了一种使用三电极、两室生物电化学系统表征乳酸菌中介导的细胞外电子转移 （EET） 的方案。我们用 植物乳植杆菌 和氧化还原介质 1,4-二羟基-2-萘甲酸说明了这种方法，并提供了用于评估介导的 EET 的电化学技术的全面描述。
在我们的实验室中，我们研究了植物乳植杆菌等细菌中的细胞外电子转移 （EET），这是一种在食品工业中至关重要的发酵细菌。在 EET 中，电池将电子转移到细胞外电子权杖，就像生物电化学系统中的电极一样。我们希望了解并设计用于生物传感、生物催化和食品发酵的 EET。
我们发现，在存在醌（如 DHNA）的情况下，高山隧道可以通过 EET 购买电流。这个过程再生 NAD plus，加速初级发酵途径的整体损失，并促进细胞生长。此外，我们发现除 DHNA 以外的多种醌衍生物也可以介导植物乳杆菌中的 EET。
研究介导的 EET 需要专门的生化设置。具体来说，我们使用三电极、双腔室的生物电化学系统来防止阳极和阴极反应之间的串扰。我们还使用具有大表面积的碳场工作电极来增强电子从电子介质的转移。
我们探索植物乳杆菌中 EET 途径以及这些途径如何与发酵代谢相互作用的工作可能在食品工业中具有有用的应用。我们知道 EET 和 L plantarum 通过发酵改变代谢通量，这可以被用于有用的应用，改变食物风味并在电发酵中产生有价值的化学物质。未来，我们将继续增加我们对 EET 的基础知识，并在植物乳杆菌等生物体中寻求新的 EET 应用。
我们计划在 EET 通路中设计蛋白质，这将使我们能够进一步控制 EET 以应用于电发酵和生物传感。首先，用氧化铝砂纸打磨预切一毫米直径的钛丝，用于在对电极中工作，直到均匀闪亮。使用钳子，将每根工作电极丝的一端弯曲成一个小钩子。
将一个 16 平方厘米的碳毡圆滑到每根工作电极丝上，将金属丝编织进出碳毡圆一次，然后将圆丝向下拉，直到固定在钩子上。用金属丝刺穿橡胶隔膜并将其拉过几厘米，将工作接触电极固定到 GL 45 帽中。要构建成对的反应器，请组装 O 形圈，并将预先浸泡在水中的预切割阳离子交换膜放入组装好的 O 形圈中。
将带有膜的 O 形圈放在两个成对的反应器瓶的大底部开口之间。用转向节夹将反应器对瓶和环与膜固定在一起。将磁力搅拌棒放入每个阳极腔中，然后用装有橡胶隔垫的 GL14 瓶盖关闭每个瓶子顶部的所有小开口。
在每个反应器瓶中装满 110 毫升去离子水。插入装有碳毡圆形工作电极的盖子，轻轻按压毛毡圆形的顶部，使其固定在挂钩上。用合适的电极安装 GL45 瓶盖盖上瓶子。
高压釜充水反应器和 GL14 电极帽。在无菌条件下，从甘油原液的顶部刮取乳酸植物 Abasilisk plantarum 培养物，并接种在 3 毫升商业需求 rugosa sharp 或 MRS 培养基中。将培养物在 37 摄氏度下孵育过夜，不要摇晃。
首先，在无菌生物安全柜中，丢弃生物电化学系统反应器中的高压灭菌水。用 110 毫升高压灭菌的 M9 培养基填充阴极室，用 110 毫升新鲜制备的 MCDM 填充阳极室。将阳极室中的一个 GL14 帽更换为带有硅胶吊顶环的高压灭菌器 GL14 帽。
用 70% 乙醇喷洒准备好的参比电极，然后将其通过电极帽放入每个阳极室。拧紧所有盖子和夹子以避免泄漏。要将反应器连接到水泵系统，首先，将每个反应器放在适当的搅拌棒平台上。
然后用橡胶管将每个反应器的水套龙头连接到下一个反应器，将末端反应器连接到水泵的进出管。将泵装满水，并加入 4 到 6 滴水调节剂。打开泵系统并将温度设置为 30 摄氏度。
启动泵并观察流经所有反应器水套的水流，确认没有泄漏。打开搅拌平台，将其设置为以 220 RPM 的速度连续搅拌。要将反应器连接到保氮气体管线，首先，将空气过滤器连接到 22 号针头上，然后将针头穿过反应器阳极室的顶部隔膜插入介质中。
将 18 号针头插入反应器阳极室的顶部隔膜中，然后将气体管线从氮气源连接到空气过滤器，并打开阀门，让气体轻轻冒泡通过反应器。要将生物反应器连接到电化学工作站导线上，请将工作计数器和参比电极鳄鱼夹导线从电化学工作站连接到相应的电极。输入所有参数后，按绿色的开始三角形开始运行。
观察开路电压走线几分钟，以确保所有电抗器读数为正。并靠得很近，信号稳定。在无菌条件下，在 50 毫升 MMRS 中将先前生长的植物李斯特菌培养物 1 至 200 进行传代培养。
将细胞在 37 摄氏度下培养过夜，不要摇晃。首先，从培养箱中取出在 MMRS 中生长的植物乳杆菌培养物。在无菌条件下将培养物转移到 50 毫升锥形管中，并将管子放在冰上。
将培养物在 4， 000 G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。去除上清液，然后将沉淀重悬于 50 ml PBS 中。第二次洗涤后，将细胞重悬于冷 PBS 中，至光密度为 600 纳米 11。
将 2 mL 重悬细胞装入装有针头的 3 mL 注射器中。在反应器站，取下细胞注射器的盖子，并将针头插入反应器阳极室的顶部。所有注射器就位后，按下柱塞以注射细胞。
记录计时安培迹线的注射时间。让电流在走线上稳定 2 到 4 小时。在生物电化学系统中，将实验反应器标记为 plus DHNA，将溶剂控制反应器标记为 minus DHNA。
打开装有 110 微升每毫升 20 毫克 DHNA 的注射器的盖子，然后将其插入阳极室的顶部，指定为 plus DHNA。将装有 110 微升 DMSO 的注射器插入阳极室，指定为负 DHNA。使用装有 21 号针头的 3 毫升注射器，通过未使用的小瓶隔膜从每个阳极腔中取出 2 毫升培养基。
将样品转移到 24 深孔板中，以测量零小时时间点的 pH 值。压下 DHNA 和 DMSO 注射器的柱塞以注入反应器。记录计时安培迹线的注射时间。
丢弃所有注射器和针头。24 小时后，如前所述从每个阳极室中取出 2 毫升培养基，并将其转移到 24 深孔板中进行 24 小时的 pH 测量。运行 24 小时时间点的循环伏安法。
测量并记录每个反应器中 24 小时样品的 pH 值。DHNA 注射后 8 小时，由于细胞外电子转移引起的电流密度达到约每平方厘米 132 微安的峰值。相比之下，DMSO 注入产生的电流密度可以忽略不计。
循环伏安法数据显示，与含 DMSO 的植物乳杆菌相比，在存在 DHNA 的植物乳杆菌的情况下，50 毫伏时的氧化电流明显增加，与非生物 DHNA 迹线相比，300 毫伏时的电流密度增加了 256%。细胞外电子转移导致植物乳杆菌和 DHNA 样品的 pH 值在 24 小时内显著下降至平均 3.33，而植物乳杆菌和 DMSO 样品的平均 pH 值为 6.50。
概述
本研究提出了一种用于表征乳酸菌（特别是植物乳杆菌）介导的胞外电子转移（EET）的协议，使用生物电化学系统。该方法涉及三电极、两室设置，以评估1,4-二羟基-2-萘甲酸等氧化还原介质在EET中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 生物电化学
- 食品科学
背景
- 胞外电子转移（EET）对于各种细菌代谢过程至关重要。
- 植物乳杆菌在食品发酵中具有重要意义。
- 理解EET可以带来生物传感和生物催化的进展。
- 类醌等氧化还原介质在促进EET方面发挥着重要作用。
研究目的
- 探索L. plantarum中介导的EET的机制。
- 评估EET对代谢途径和细胞生长的影响。
- 开发EET在食品工业和电发酵中的应用。
所用方法
- 利用三电极、两室生物电化学系统。
- 使用碳绒和钛线制备工作电极。
- 在受控条件下接种L. plantarum培养物。
- 监测电化学参数以评估EET效率。
主要结果
- 证明L. plantarum可以通过EET将电子转移到电极上。
- 识别了有效介导EET的各种类醌衍生物。
- 显示EET影响代谢通量和发酵途径。
- 提供了一种详细的协议，用于研究乳酸菌中的EET。
结论
- 该研究增强了对L. plantarum中EET的理解。
- 研究结果可能导致食品技术的创新应用。
- 未来的研究将集中在EET途径中的蛋白质工程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in Lactiplantibacillus plantarum enables mechanistic de-risking of microbial electron flow, directly impacting the predictive confidence of metabolic engineering and biocatalysis strategies. This protocol positions EET quantification as a critical inflection point for advancing biosensing, electro-fermentation, and bioelectrocatalytic workflows in industrial biotechnology. The approach supports portfolio decisions by clarifying the functional role of redox mediators in microbial systems relevant to food and chemical production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EET pathways and their interaction with fermentative metabolism in L. plantarum.
- Supports biological de-risking by isolating the impact of specific redox mediators on electron transfer efficiency.
- Facilitates predictive confidence in engineering microbial strains for targeted metabolic outputs.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible bioelectrochemical system for quantitative assessment of EET activity.
- Standardizes chronoamperometry and cyclic voltammetry readouts for cross-condition comparison.
- Prepares validated microbial systems for downstream screening of mediator compounds and pathway variants.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial EET characterization with translational goals in food fermentation and biocatalysis.
- Supports continuity from discovery of EET mechanisms to preclinical evaluation of engineered strains.
- Provides mechanistic data to inform risk-adjusted advancement of microbial production platforms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of EET in lactic acid bacteria, supporting both early mechanistic studies and translational optimization for industrial applications.
- Discovery Biology: Quantifies EET activity to clarify electron transfer pathways and mediator dependencies.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for comparing mediator efficacy and microbial performance.
- Analytics: Provides current density and pH measurements as actionable readouts for condition optimization.
- Translational Research: Bridges mechanistic EET insights to applied fermentation and biocatalytic workflows.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform for repeated evaluation of microbial EET across strains and mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial electron transfer and metabolic engineering outcomes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protocols for cross-lab and cross-project comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for advancing engineered strains and mediator strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbial platforms for food and chemical production.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioelectrochemistry and microbial physiology.
- Needs access to three-electrode, two-chamber bioelectrochemical systems and potentiostats.
- Demands rigorous cross-team standardization of electrode preparation and assay conditions.
- Adaptable to diverse lactic acid bacteria and mediator compounds with protocol modifications.
- Dependent on precise control of sterile technique and environmental parameters for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:14
Assembly of Bioelectrochemical System Reactors and Initial Culturing of Lactiplantibacillus plantarum for Extracellular Electron Transfer Study
4:11
Setup of Bioelectrochemical System Reactors for Electrochemical Measurements and Culturing of Lactiplantibacillus plantarum
6:49
Injection of Lactiplantibacillus plantarum and DHNA/DMSO in the Bioelectrochemical System Reactors and Chronoamperometry and Cyclic Voltammetry Analysis
